PLoS ONE: Kombineret 5-FU og ChoKα Inhibitors som et nyt alternativ terapi af kolorektal cancer: Beviser i Human tumorafledte cellelinjer og Mouse Xenografts

Abstrakt

Baggrund

Tyktarmskræft ( CRC) er den tredje største årsag til kræft dødsfald i verden. 5-fluorouracil (5-FU) er almindeligt anvendt til behandling af kolorektal cancer, men som en enkelt-agent gør lave svarprocenter. Cholin kinase alpha (ChoKα), et enzym, der spiller en rolle i celleproliferation og transformation, er blevet rapporteret overudtrykt i mange forskellige tumorer, herunder kolorektale tumorer. ChoKα hæmmere har for nylig indgået kliniske forsøg som en ny antitumor strategi.

Metode /vigtigste resultater

ChoKα specifikke hæmmere, MN58b og TCD-717, har vist en potent antitumoraktivitet både

i vitro

in vivo

mod flere tumorafledte cellelinie xenotransplantater herunder CRC-afledte cellelinier. Virkningen af ​​ChoKα inhibitorer i kombination med 5-FU som ny alternativ til behandling af colon-tumorer er blevet undersøgt både

in vitro

i CRC-tumor cellelinier, og

in vivo

i muse-xenotransplantater modeller. Virkningerne på thymidylatsyntase (TS) og thymidinkinase (TK1) niveauer, to enzymer, der vides at spille en væsentlig rolle i virkningsmekanismen af ​​5-FU, blev analyseret ved Western blotting og kvantitativ PCR-analyse. Kombinationen af ​​5-FU med ChoKα inhibitorer resulterede i en synergistisk virkning

in vitro

i tre forskellige humane coloncancer-cellelinjer og

in vivo

mod human colon xenografter i nøgne mus. ChoKα hæmmere modulere ekspressionsniveauerne af TS og TK1 gennem hæmning af E2F produktion, hvilket giver en rationel for sin virkningsmekanisme.

Konklusion /Betydning

Vores data tyder på, at begge lægemidler i kombination display en synergistisk antitumoral virkning på grund af ChoKα inhibitorer drevet modulering af metabolisering af 5-FU. Den kliniske relevans af disse fund er kraftigt støttet siden TCD-717 for nylig har indgået fase I kliniske forsøg mod solide tumorer

Henvisning:. De la Cueva A, Ramírez de Molina A, Álvarez-Ayerza N, Ramos MA, Cebrián A, Pulgar TGD, et al. (2013) Kombineret 5-FU og ChoKα Inhibitors som et nyt alternativ terapi af kolorektal cancer: Beviser i Human tumorafledte cellelinjer og Mouse Xenografter. PLoS ONE 8 (6): e64961. doi: 10,1371 /journal.pone.0064961

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: Marts 25, 2011; Accepteret den 22. april 2013; Udgivet: 10 juni 2013

Copyright: © 2013 de la Cueva et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er finansieret af følgende tilskud: Comunidad de Madrid (S-BIO /0280/2006 og S2010 /BMD-2326), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2008-03750, SAF2011-29699, RD06-0020-0016 og RD12 /0036 /0019) og EU # 259.737. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Juan Carlos Lacal er en af ​​stifterne af TCD Pharma og et medlem af sin videnskabelige advisory board men ikke en medarbejder i virksomheden. TCD Pharma udvikler stoffet TCD717, en ChoKα inhibitor, der i øjeblikket er i kliniske fase I studier. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den første mest udbredte kræft og er den anden årsag til kræft dødsfald i Europa med omkring 212.000 dødsfald hvert år [1]. Den mest undersøgte lægemiddel i CRC er antimetabolit 5-fluorouracil (5-FU), udviklet over 50 år siden [2]. 5-FU er en analog af uracil med et fluoratom. Dens mekanisme af cytotoksicitet består i fejlinkorporering af fluoronucleotides til RNA og DNA, men de vigtigste toksiske virkninger medieres af inhiberingen af ​​nukleotidet syntetisk enzym thymidylatsyntase (TS). 5-FU er meget udbredt i behandling af en række cancersygdomme, herunder CRC, bryst og hoved og halscancer [3], [4]. Svarprocenten for 5-FU baseret kemoterapi som en første-line behandling for avanceret CRC kræft er kun 10-15% [5]. Kombination af 5-FU med nye cytotoksiske lægemidler såsom oxaliplatin og irinotecan har forbedret responsrater til 40-50% [6], [7]. Endvidere har nye biologiske midler, såsom det monoklonale antistoffer cetuximab og bevacizumab demonstreret yderligere fordele hos patienter med metastatisk sygdom [8], [9]. Således er denne fremgangsmåde at opnå vigtige forbedringer, og fremmer nye terapeutiske strategier baseret på kombinatoriske behandlinger.

cholin kinase alpha (ChoKα), det første enzym i Kennedy pathway, er ansvarlig for syntesen af ​​de store phospholipid af den plasmamembraner, phosphatidylcholin (PC). Flere undersøgelser har vist, at ChoKα spiller en vigtig rolle i celle transformation og inducerer

in vivo

tumorogenesis [10], [11]. Endvidere er ChoKα overudtrykkes i tyktarms-, bryst-, lunge-, prostata-, ovarie- og hæmatologiske tumorer [11] – [16]. Baseret på disse observationer har ChoKα blevet anvendt som et hidtil ukendt molekylært mål at udvikle en ny antitumoral strategi. ChoKα hæmmere (ChoKIs) er derivater af Hemicolinium-3 (HC3) struktur, en kendt cholin kinaseinhibitor med en høj neurotoksicitet

in vivo

[17] – [19]. MN58b [20], [21] blev identificeret som en første generation VK3 derivat med potent antiproliferativ aktivitet

in vitro

og effektiv antitumoraktivitet

in vivo

i nøgne mus systemer, herunder kolon xenografter [10] , [21]. MN58b er blevet anvendt som en model for en ny generation af forbindelser, og en ledende molekyle til at studere virkningsmekanismen af ​​denne hidtil ukendte klasse af antitumorlægemidler.

En anden generation af ChoKα inhibitorer er blevet syntetiseret for at forbedre tolerabilitet af ChoKα inhibitorer i mus. TCD-717 er blevet udvalgt blandt flere molekyler, fordi det gav de bedste resultater

in vitro

in vivo

(upublicerede resultater). ChoKα inhibitorer er meget specifikke lægemidler til tumorceller, da primære celler reversibelt bliver arresteret i G1 og er i stand til at genvinde deres vækst kinetik, når lægemidlet fjernes. Imidlertid er tumorceller udløses til celledød samtidig til en stigning i de intracellulære niveauer af ceramider [22], [23]. Begge lægemidler, MN58b og TCD-717, er afledt af Hemicolinium-3, og som sådan betragtes begge som kompetitive inhibitorer med cholin ved cholin bindende lomme [24] – [26].

Det er blevet beskrevet at den kombinerede anvendelse af et cholin kinase-specifikt siRNA og 5-FU, resulterer i en synergistisk virkning på reduktionen af ​​celleproliferation af brystcancerceller [27]. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge antitumorvirkningen af ​​den kombinerede administration af kemiske ChoKα inhibitorer og 5-FU, der søger efter en alternativ behandling, der ville tillade at forbedre 5-FU frekvensrespons i CRC behandling og reducere dens tilknyttede toksicitet. Den kliniske relevans af denne nye behandling er stærkt støttet siden TCD-717 er for nylig blevet godkendt til at indtaste kliniske forsøg mod solide tumorer (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01215864).

Resultater

ChoKα niveauer i menneskelig afledt kolorektal cancer cellelinjer

ChoKα niveauer blev analyseret i de tre tyktarmskræft cellelinjer anvendt i denne undersøgelse, DLD-1, HT29 og SW620 versus en ikke tumoral kolorektal cellelinie CCD -841. Figur 1 viser, at ChoKα niveauer er omkring 20-30 gange højere end den primære cellelinie. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere analyse af ChoKα ekspression i tumorprøver sammenlignet med matchede normale væv fra den samme patient [11], og tilvejebringer et rationelt for den potentielle anvendelse af ChoKα inhibitorer i klinikken i kombination med standard kemoterapi.

ChoKα proteinniveauer af tre colorektale tumorcellelinjer, DLD-1, HT29 og SW620 er blevet sammenlignet hensyn til ikke tumorale kolorektal cellelinie CCD-841. Nedenfor den vestlige er det repræsenteret kvantificering niveauer (ChoKα /tubulin).

ChoKα hæmmere synergistisk med 5-FU fremmer celledød af kolon kræftceller

Effekten på spredning af ChoKα hæmmere i kombination med 5-FU blev bestemt i de tre kolorektale cancercellelinjer: DLD-1, HT29 og SW620. For at estimere de passende koncentrationer for hver forbindelse blev celler behandlet med en lang række koncentrationer baseret på deres respektive IC

50, alene eller i kombination. Anvendte koncentrationer var fra 1 til 6 um (MN58b og TCD717) og 2 på 8,5 uM 5FU både som samtidige og sekventielle behandlinger (fig S1). Den bedste kombination at opnå en effektiv synergi som antiproliferative lægemidler var en sekventiel behandling initieres af en ChoKα inhibitor og efterfulgt af 5-FU. Den inhiberende virkning blev kvantificeret ved MTT-assayet, og inhiberingen satser blev analyseret ved fremgangsmåden ifølge Chou og Talalay og kombinationsprodukter indekser (CIS) estimerede ifølge CalcuSyn programmet [28]. Parceller blev opnået, når ChoKα inhibitorer TCD-717 og MN58b blev kombineret med 5-FU i DLD-1, HT29 og SW620 cellelinjer (fig S1). CIs og et repræsentativt tal på hver forskellig CRC cellelinie ved sekventiel kombination af ChoKα inhibitorer og 5-FU er vist (figur 2).

6 × 10

3 Tumorceller brøndsplader dyrket i 96 . Efter 24 timers inkubation blev celler eksponeret for TCD-717 (venstre paneler) i 24 timer eller MN58b (højre paneler) i 9 timer. Derefter skiftedes mediet til medium indeholdende 5-FU i 60 timer i plader, der tidligere er behandlet med MN58b og i 24 timer i plader behandlet med TCD-717. Cellelevedygtighed blev evalueret ved MTT-assay og repræsenteret som procent af kontrol, ubehandlede celler. CI-værdi i hvert tilfælde er gennemsnittet af tre uafhængige forsøg, som hver blev udført firdobbelte. CI 1 angiver en synergistisk virkning. Et repræsentativt eksperiment af tre uafhængige forsøg er vist.

Virkningen af ​​denne kombination blev undersøgt, og cellecyklusfordeling induceret af TCD-717 og 5-FU alene eller i kombination analyseret (figur 3). Flowcytometri-analyse viste en signifikant induktion af celledød efter behandling med ChoKIs med en yderligere stigning i kombination med 5-FU, hvilket indikerer, at den kombinerede behandling havde en stærkere virkning end individuelle behandlinger. Tidligere undersøgelser viste, at tumorceller er følsomme for ChoKα inhibitorer, hvis de udsættes på G1-fasen, men bliver ufølsomme i S-fase [23]. 5-FU eksponering inducerede S-fase akkumulering, men den kombinerede behandling drastisk reduceret S-fase ophobning og øgede celle dødelighed. Disse resultater understøtter kravet om en sekventiel behandling initieret med ChoKα inhibitorer forklarer den manglende synergisme observeret med alternative skemaer for behandling.

2,5 × 10

5 DLD-1 og SW620 cellelinier blev podet i 6 brønd plader og inkuberet i 24 timer med TCD-717 efterfulgt af 5-FU i 24 timer alene eller i kombination. Kombination af de to lægemidler forøget celledød i forhold til de to lægemidler alene. Tabeller under grafikken angive den procentdel af de forskellige faser i cellecyklus, når vi behandler med TCD-717 og 5-FU alene eller i kombination. * P. 0,05 sammenlignet de forskellige cellecyklus faser vs. kontrol

In vivo

synergi af ChoKα inhibitorer og 5-FU i nøgne mus

Effekterne af kombinatoriske behandlinger af ChoKα inhibitorer og 5-FU på

in vivo

tumorvækst af DLD-1 og SW620 xenografter i nøgne mus blev næste undersøgt. DLD-1-xenografter blev inokuleret i athymiske mus, og når tumorerne nåede standarden volumen på ca. 0,2 cm

3, blev musene tilfældigt inddelt i fire grupper (10 tumorer /gruppe) og behandlet efter den næste skema: ChoKα inhibitorer blev administreret ved 2 mg /kg /dag tre gange om ugen i 3 uger, og 5-FU blev indgivet ved 40 mg /kg /dag to gange om ugen i 3 uger. Tumor vækst blev indspillet efter indledningen af ​​behandlingen. Tumor volumener blev reduceret i alle behandlede grupper uanset behandlingen, sammenlignet med dem for kontrol, ubehandlede mus (Figur 4). Tumor vækst i kombinationen grupper i hvert forsøg var væsentligt mindre end de behandlet med ChoKα inhibitorer eller 5-FU alene (p-værdier 0,05). Indikerer en kraftig reduktion tumor volumen i kombination tidsplaner

Mus var eksponeret til 2 mg /kg /dag af ChoKα inhibitorer tre dage om ugen og 40 mg /kg /dag i 5-FU to dage om ugen i kombination eller alene i 3 uger. Tumorvækstinhibering sats er vist nedenfor hvert eksperiment. (A) DLD-1-tumorer behandlet med MN58b som ChoKα inhibitor og 5-FU. (B) DLD-1 tumorer behandlet med TCD-717. (C) SW620 tumorer udsat for TCD-717 og 5-FU.

Som en validering, SW620 xenografter blev også undersøgt efter en identisk tidsplan med en kombination af TCD-717 og 5-FU. En statistisk signifikant effekt blev også observeret i kombinationsbehandlingen (figur 4).

ChoKα hæmmere modulere ekspressionsniveauerne af vigtige enzymer involveret i metabolismen af ​​5-FU

For at belyse mekanismen i denne synergistiske effekt af ChoKα inhibitorer og 5-FU, undersøgte vi virkningen af ​​ChoKα inhibitorer på ekspressionsniveauerne af nøgleenzymer i den metaboliske vej for 5-FU såsom thymidylatsyntase (TS) og thymidinkinase (TK1). SW620-celler blev behandlet med stigende koncentrationer af ChoKα inhibitorer fra 2 til 10 pM (figur 5A) viser en dosis-afhængigt fald i niveauerne af disse proteiner. Derefter blev SW620, HT29 og DLD-1 behandlet med ChoKα inhibitorer (TCD-717 6 og 10 uM, MN58b 10 og 15 um) og 5-FU (5,5 uM), alene eller i sekventiel kombination for at bestemme virkningerne på ekspressionen niveauer af disse enzymer (figur 5B). Gratis (aktiv form) og ternære kompleks (inaktiv form) af TS og TK1 blev analyseret ved western blotting. Som forventet celler behandlet med 5-FU viste både TS ternære kompleks (øvre bånd) og de frie TS (nedre bånd). ChoKα inhibitorer inducerede betydelig nedregulering af både frie TS (aktiv form) og ternære kompleks (inaktiv form), samt TK1 (figur 5B). Således sekventiel kombination af ChoKα inhibitorer og 5-FU inducerede begge mekanismer af inaktivering, nedsat dannelse af ternære kompleks og en betydelig nedregulering af TS aktiv (fri form). Desuden ChoKIs faldt TK1 niveauer, også påvirker den mekanisme forbundet til 5-FU resistens. Denne virkning kan forklare den mekanisme af synergisme mellem begge lægemidler.

2,5 × 10

5 DLD-1, HT29 og SW620 cellelinier blev podet i plader med 6 brønde og inkuberet i 24 timer. (A) SW620 cellelinje blev udsat for øgede koncentrationer af ChoKα hæmmere i 24 timer. (B) SW620, HT29 og DLD-1 cellelinjer blev udsat for to koncentrationer af ChoKα hæmmere [TCD-717: 6 uM (venstre linje) eller 10 uM (højre linje); MN58b: 10 pM (venstre linie) eller 15 pM (højre linje)]. Hvor det er angivet, blev mediet fjernet efter behandling med ChoKα inhibitorer som ovenfor og ændret til frisk medium med 5,5 uM 5-FU i yderligere 24 timer. Proteinekspression blev analyseret ved western blot med monoklonalt anti-thymidylatsyntase TS106 klon for TS og monoklonalt anti-thymidinkinase klon F12 for TK1. Figuren viser på toppen en repræsentativ blot nederst proteinniveauer (total TS, aktive TS, og TK1 /tubulin) beregnes som gennemsnittet ± SEM for tre uafhængige forsøg. (C) 2,5 × 10

5 SW620 blev HT29 og DLD-1 cellelinier podet i plader med 6 brønde og inkuberet i 24 timer. (A) SW620, (B) HT29 og (C) DLD-1 cellelinier blev udsat for to koncentrationer af ChoKα inhibitorer [TCD-717: 6 um (venstre linie) eller 10 pM (højre linie); MN58b: 10 pM (venstre linie) eller 15 pM (højre linje)]. Hvor det er angivet, blev mediet fjernet efter behandling med ChoKα inhibitorer som ovenfor og ændret til frisk medium med 5,5 uM 5-FU i yderligere 24 timer. Proteinekspression blev analyseret ved western blot med anti-E2F1. Figuren viser på toppen en repræsentativ blot nederst proteinniveauer (E2F1 /GAPDH) beregnet som middelværdien ± SEM af tre uafhængige forsøg.

Både TK1 og TS har vist sig at være under transkriptionel kontrol af E2F1 [29], [30]. Vi undersøgte derfor, om den drastiske reduktion i niveauet af TK1 en TS efter Chok hæmning blev medieret af en virkning på niveauerne af denne transskription faktor. Som vist i figur 5C, i alle tre cellelinjer undersøgt, blev en drastisk reduktion i niveauet af E2F1 observeret i overensstemmelse med sin rolle som regulator af TS og TK1 syntese.

Dernæst at undersøge potentialet induktion af apoptose efter Chok inibition, som et kendetegn for apoptose, niveauerne af PARP blev analyseret under lignende betingelser, og der blev observeret en drastisk reduktion i PARP niveauer i SW620 (figur 6A), HT29 (figur 6B) og DLD-1 (figur 6C) celle linjer efter behandling med kombinationen tidsplan. PARP er et protein impliceret i DNA-reparation og dens fald har en lignende fysiologisk betydning som i sin spaltning fordi reducerede niveauer af PARP undgå DNA-reparation og celler udløses for apoptose engagement.

(A-C) SW620, HT29 og DLD-1 celler blev podet som beskrevet under Materialer og Metoder og behandlet med to koncentrationer af ChoKα hæmmere [TCD-717: 6 uM (venstre linje) eller 10 uM (højre linje); MN58b: 10 pM (venstre linie) eller 15 pM (højre linje)] i 24 timer og, hvor det er angivet, med 5,5 uM 5-FU eller køretøj i yderligere 24 timer. Proteinekspression blev analyseret ved Western blot ved anvendelse af polyklonalt antistof-anti-PARP. Bag hver graf, data viser proteinniveauer (PARP /GAPDH) beregnet som middelværdien ± SEM af tre uafhængige forsøg. (A) SW620. (B) HT29. (C) DLD-1. (D) PARP og ChoKα ekspressionsniveauer i HT29 og SW620-cellelinier transficeret med et specifikt ChoKα siRNA bestemt ved Western blot-analyse eller en kontrol scramble siRNA (scr). Proteinekspression blev analyseret ved Western blot under anvendelse af ChoKα monoklonalt antistof og polyklonalt antistof-anti-PARP. Under hvert vestlige forholdet PARP /tubulin er repræsenteret. (E) Caspase 3-aktivitet (øverste felt) og dets spaltning (nederste panel) blev bestemt i HT29-celler efter behandling med MN58b i 24 timer. (F) Caspase 3 enzymatisk aktivitet blev også målt efter transfektion af HT29-celler med en ChoKα specifik siRNA eller en kontrol siRNA (scr) i 48 timer. Western blot repræsenterer niveauet af ChoKα efter transfektion og dens relative reduktion normaliseret til GAPDH niveauer.

HT29 og SW620 celler blev også transficeret med en specifik siRNA-ChoKα. Som vist i figur 6D, blev lignende resultater opnået til de af ChoKα farmakologisk hæmning, med en drastisk reduktion i PARP niveauer, en indikation af specificitet skyldes ChoKα hæmning.

Som en ekstra bevis for induktion af apoptose efter Chok-hæmmere i kolon kræftceller blev to alternative metoder til indledningen af ​​den apoptotiske signalering maskiner, der anvendes. Caspase 3-aktivitet og spaltning blev let detekteret efter MN58b behandling af HT29-celler (figur 6E). Nedregulering af ChoKα udtryk ved specifik siRNA steg også caspaseaktivitet, en yderligere støtte af specificiteten af ​​denne virkning er baseret på reduktion af ChoKα aktivitet (figur 6F). Således Chok-inhibitorer er i stand til at inducere apoptose ved aktivering af caspase 3.

Endelig blev TS-niveauer analyseret i tumorer genereret fra

in vivo

xenograft model DLD-1 efter behandling med MN58b og 5-FU og sammenlignet med kontrol, ubehandlede mus (figur 7). En statistisk signifikant reduktion i TS niveauer (både total og aktiv protein) blev observeret i tumorer behandlet med MN58b alene eller i kombination med 5-FU, mens ingen signifikant forskel blev fundet i tumorerne fra mus behandlet med 5-FU alene.

Mus blev inokuleret med DLD-1-celler som angivet under Materialer og metoder og enten venstre ubehandlet eller behandlet med MN58b eller 5-FU alene eller i kombination. A) TS ekspressionsniveauer af hvert forsøg gruppe: Kontrol, MN58b, 5-FU og kombinationen gruppe. Tubulin blev anvendt som indlæsning kontrol. B) Graph repræsenterer betyde protein niveauer som TS /tubulin nøgletal for hver gruppe. Sorte søjler repræsenterer samlede TS /tubulin værdier; Grå søjler repræsenterer TS aktive værdier. (*) Statistisk signifikant (p 0,05)., Sammenlignet med kontrolgruppen

nedregulering af mRNA-niveauer af TS og TK1 gen efter behandling med ChoKα hæmmere og 5FU i DLD-1, SW620 og HT29-celler

Prækliniske og kliniske undersøgelser har vist, at TS udtryk er afgørende for 5-FU følsomhed og klinisk resultat [31], [32]. I overensstemmelse med disse resultater, genamplifikation af TS med heraf følgende øget TS mRNA og protein, er blevet observeret i cellelinier, der er resistente over for 5-FU [31], [33], [34].

på baggrund af ovenstående resultater blev SW620, HT29 og DLD-1 celler behandlet med MN58b og TCD-717 i 24 timer. Behandling med ChoKα inhibitorer resulterede i en signifikant nedregulering af både TS og TK1 mRNA-niveauer som bestemt ved real time Q-PCR analyse under anvendelse af de specifikke prober Hs00426591_m1 for TS og Hs01062125_m1 for TK1 (figur 8). Disse resultater viser, at den nedadgående graduering i de proteinniveauer af TS og TK1 induceret af ChoKα hæmmere resulterer fra en drastisk reduktion på det transskriptionelle niveau, med en signifikant effekt i begge TS, og dens frelsesyntesevejen medieret af TK1. Da niveauerne af E2F1 blev også drastisk reduceret, er det rimeligt at foreslå, at denne transskription faktor er ansvarlig for de observerede virkninger på TS og TK1 hæmning som tidligere beskrevet [29], [30].

2,5 × 10

5 DLD-1, HT29 og SW620 cellelinier blev podet i plader med 6 brønde og inkuberet under optimale betingelser i 24 timer. Derefter blev cellerne eksponeret for forskellige koncentrationer af ChoKα inhibitorer i 24 timer. Niveauer af TS og TK1 blev analyseret ved RT-qPCR som beskrevet under materialer og metoder. 18S blev anvendt som den endogene kontrol for normalisering.

Ovenstående resultater ville være i overensstemmelse med en generel effekt på gentranskription induceret af ChoKα inhibitorer. For at teste denne mulighed, blev mRNA-niveauer af andre proteiner også involveret i 5-FU virkningsmekanisme undersøges. I modsætning til, hvad der blev observeret med TS eller TK1, uridinphosphorylase (

UPP1

) blev forøget efter behandling med ChoKα inhibitorer (figur 9). Denne højde kan være fysiologisk relevant, fordi

UPP1

er ansvarlig for omdannelsen af ​​5-FU til en mellemliggende metabolit, der vil blive konverteret til den aktive metabolitter fluoruridin trifosfat (FUTP) og fluorodeoxyuridin trifosfat (FdUTP). Således behøver de observerede på E2F1, TS og TK1 effekter ikke reagerer på en generel, ikke-specifik effekt på gentranskription.

2,5 × 10

5 DLD-1, HT29 og SW620 cellelinjer blev podet i plader med 6 brønde og inkuberet 24 timer under standardbetingelser. Derefter blev celler behandlet med ChoKα inhibitorer, TCD-717 (6 og 10 uM) og MN58b (10 og 15 uM) under 24 timer. 18S blev brugt som en endogen kontrol

Effekter af ChoKα inhibitorer på MAPK, AKT-signalering og ceramider niveauer

Som tidligere beskrevet af os og Chesney gruppe [40] -. [42] inhibering af ChoKα har en effekt på MAPK kinase og Akt signalveje med en drastisk reduktion i de phosphorylerede former i flere celletyper. I overensstemmelse med disse resultater, når SW620-celler blev behandlet med ChoKα inhibitorer blev en drastisk reduktion i både p42 /p44 observeret (figur 10A). Men i modsætning til tidligere rapporter om andre cellelinjer, blev ingen signifikant effekt observeret i phosphoryleringen af ​​Pakt-Ser

473 (figur 10B). Endvidere blev der ikke observeret nogen effekt på hverken signalvejen ved behandling af SW620 celler med 5-FU alene, og nogen væsentlig ændring af virkningerne observeres, når celler blev behandlet med ChoKα hæmmere blev observeret under kombination betingelser.

(A ) 2,5 × 10

5 SW620-celler blev podet i plader med 6 brønde og inkuberet i 24 timer og udsat for to koncentrationer af ChoKα inhibitorer [TCD-717: 6 um (venstre linie) eller 10 pM (højre linie); MN58b: 10 pM (venstre linie) eller 15 pM (højre linje)]. Hvor det er angivet, blev mediet fjernet efter behandling med ChoKα inhibitorer og ændret til frisk medium med 5,5 uM 5-FU i yderligere 24 timer. Proteinekspression blev analyseret ved western blot med monoklonalt anti-phospho p44 /p42 MAPK og anti-p44 /p42 MAPK. Figuren viser et repræsentativt blot af to uafhængige forsøg. (B) SW620-celler blev dyrket og behandlet som angivet i (A) med 15 uM MN58b og 5,5 uM 5-FU alene eller i kombination i 24 timer. Proteinekspression blev analyseret ved western blot under anvendelse af anti-pAKT- Ser

473, anti-AKT eller anti-GAPDH. Figuren viser på toppen en repræsentativ skamplet, på de nederste protein niveauer (Pakt-Ser

473 /total AKT /GAPDH) fra et repræsentativt eksperiment. (C) 2 × 10

6 SW620-celler blev podet i P100 plader og inkuberet 24 timer under standardbetingelser. Celler blev derefter behandlet med 15 pM MN58b og 5,5 uM 5-FU alene eller i kombination i 24 timer. Total ceramidniveauer blev analyseret ved UPLC-TOF. Middelværdi ± SD af to uafhængige forsøg udført tredobbelt, er vist.

Endelig generation af ceramider er observeret specifikt i Jurkat-celler efter behandling med MN58B mens ingen signifikant stigning blev observeret i humane primære lymfocytter [22 ]. Dette kan være ansvarlig for induktionen af ​​apoptose i dette cellesystem og kunne også forklare den observerede synergisme i denne undersøgelse. Der blev dog ikke observeret nogen effekt på ceramider niveauer efter 5-FU-behandling alene eller efter kombinatoriske tidsplaner med MN58B og 5-FU (figur 10B), undtagen denne mekanisme som ansvarlig for synergi observeret, når 5-FU blev kombineret med Chok-hæmmere.

diskussion

Tyktarmskræft er en af ​​de mest almindelige dødsårsager fra kræft over hele verden. Den standard behandling for CRC er baseret på 5-FU som første-line normalt i kombination med andre cytotoksiske lægemidler såsom oxaliplatin eller topoisomerase I inhibitor CPT-11 (Irinotecan) [33] – [35].

et bedre kendskab til molekylærbiologi CRC tumorer har ændret forvaltning af CRC patienter med status som K-Ras-mutationer bliver en kritisk beslutningsproces problem. Talrige kliniske forsøg er i gang for at forbedre tidsplaner for CRC patienter, som for mange andre typer af kræft. Men den lave helbredende behandlinger gør stadig nødvendigt at udforske nye terapeutiske metoder til at opnå bedre priser i overlevelse. I den forstand har en meget aktiv søgning efter hidtil ukendte behandlinger baseret på kombinatorisk kemoterapi og målrettet terapi genereret nye lovende alternativer. Denne strategi er baseret på skemaer, der har rejst respons priser fra 10-15% med 5-FU alene til 40-50% i kombination med kemoterapi [6], [7].

Målrettet terapi er en behandling med en fokuseret mekanisme, der specifikt indvirker forstyrrende en veldefineret mål eller biologisk vej [36]. I øjeblikket udgør disse nye fremgangsmåder en reel løfte for forbedret styring og resultatet af kræftpatienter, idet den netop virker mod cancerceller og bør derfor have færre bivirkninger end andre typer af terapeutiske behandlinger.

ChoKα overudtrykkes i en lang række humane tumorer, herunder colorectal cancer [11] – [16]. Øget samlede cholin metabolitter, herunder phosphocholin, produktet af Chok-aktivitet, er også et fælles træk for mange typer af tumorer [37]. Derfor ChoKα er et hidtil ukendt interessant mål for udviklingen af ​​behandlinger mod kræft. Som følge heraf har ChoKα hæmmere blevet syntetiseret til specifikt forstyrre dens aktivitet [10], [18], [20], [21].

Kombinationen af ​​siRNA-Chok med 5-FU i brystkræft celler har vist en reduktion af cellelevedygtighed og proliferation [27]. Men denne behandling bygger på anvendelsen af ​​et siRNA, der ikke transporteres til målcellerne

in vivo

på en effektiv måde. Her bruger vi to kemiske inhibitorer specielt designet mod ChoKα (MN58b og TCD-717) med høj styrke over for tumorceller

in vitro

in vivo

, at undersøge effekten af ​​kombinationen af 5-FU, og denne nye målrettede terapeutiske tilgang til at forbedre de nuværende CRC behandlinger. En stærk synergistisk antitumoral virkning, når 5-FU og ChoKα inhibitorer blev anvendt i kombination mod flere CRC cellelinier er rapporteret.

Tidligere rapporter fra vores gruppe viser, at induktion af apoptose ved inhibering af ChoKα er relateret til den specifikke generation af ceramider i tumorceller [22], [23]. Der er konstateret en dramatisk forskel i respons på specifikke ChoKα hæmmere mellem normale og tumorceller. Betragtninger blokering af

de novo

phosphocholin- (PCho) syntese af MN58b i primære celler inducerer retinoblastom (Rb) dephosphorylering og resulterer i reversibel cellecyklusstop i G0 /G1 fasen, lider tumorceller en drastisk wobble i metabolismen af vigtigste membranlipider phosphatidylcholin og sphingomyelin, hvilket resulterer i en væsentlig stigning i de intracellulære niveauer af ceramider, der fremmer apoptose [22], [23]. Disse indledende forsøg er blevet gengivet i yderligere celletyper, herunder coloncancer afledte cellelinier (data ikke vist). Yderligere beviser er blevet rapporteret, som angiver en klar hæmning af PI3K /AKT og ERK signalveje ved Chok-inhibitorer [38], [39], [40]. Men i kælder, der anvendes i denne undersøgelse, er hverken MAPK eller AKT signalering eller ceramider generation ændret sig væsentligt med 5-FU-behandling alene. Ingen signifikant virkning observeres enten når celler blev behandlet med de kombinatoriske regimer, som viste en potent synergisme både under in vitro eller in vivo-betingelser. Disse resultater helt viser, at de tidligere virkninger rapporteret på virkningsmekanismer for ChoKα hæmmere enten på MAPK, AKT og ceramider signalering ikke er ansvarlige for den synergistiske virkning observeret i tyktarmen kræftceller, når man kombinerer ChoKα inhibitorer og 5-FU.

Her har vi yderligere undersøgt den mekanisme af synergien af ​​Chok-inhibitorer og 5-FU til en bedre forståelse og forbedring af dens potentielle anvendelse i klinikken. TS protein har en central rolle i biosyntesen af ​​thymidylat, en essentiel forløber for DNA-syntese [41]. Nogle undersøgelser har vist, at TS-proteinniveauer er højere i flere tumorer væv sammenlignet med deres normale modparter [42]. Endvidere er højt TS-niveauer associeret med dårlig prognose i disse cancere [43] – [45]. Anden kritisk enzym til thymidin stofskifte er TK1 der øget aktivitet udgør en potentiel mekanisme af resistens over for 5-FU [46].

Her viser vi, at ChoKα hæmmere fremkalde en stærk ned graduering af niveauerne for både TS og