PLoS ONE: Overekspression af BIRC6 er en indikator for Prognose for kolorektal Cancer

Abstrakt

Baggrund og Formål

inhibitorer af apoptose proteiner (IAP) er blevet godt undersøgt i humane kræftformer, hvor de ofte overudtrykkes og associeret med dårlig prognose. Her udforskede vi rollen som baculovirale IAP gentagelse indeholdende 6 (BIRC6), et medlem af IAP, i human kolorektal cancer (CRC).

Metoder

Vi brugte Western blotting og immunhistokemi at undersøge BIRC6 udtryk i 7 CRC cellelinjer og 126 CRC kliniske prøver. Vi bestemt den biologiske betydning af BIRC6 i CRC-cellelinjer med en lentivirus-medieret lyddæmpning metode.

Resultater

Vi rapporterede, at BIRC6 blev overudtrykt i CRC-cellelinjer og kliniske CRC væv. BIRC6 overekspression var korreleret med tumorstørrelse og invasion dybde af CRC. BIRC6 overekspression er forbundet med dårligere samlet overlevelse (OS) (

P

= 0,001) og kortere sygdomsfri overlevelse (DFS) (

P

= 0,010). BIRC6 knockdown hæmmet celledeling, anholdt cellecyklus på S-fasen, nedreguleret cyklin A2, B1, D1 og E1-niveauer, og sensibiliserede CRC celler til kemoterapi

in vitro

in vivo

.

konklusioner

samlet set disse data tyder på, at BIRC6 overekspression er en indikator for dårlig prognose i kolorektal cancer og BIRC6 kunne være et potentielt mål for CRC terapi

Henvisning:. Hu T , Weng S, Tang W, Xue R, Chen S, Cai G, et al. (2015) Overekspression af BIRC6 er en indikator for Prognose for tarmkræft. PLoS ONE 10 (5): e0125281. doi: 10,1371 /journal.pone.0125281

Academic Redaktør: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: 15 juli, 2014 Accepteret: 23. marts 2015; Udgivet: 1. maj 2015

Copyright: © 2015 Hu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Funding:. Dette arbejde blev støttet af Shanghai Videnskab og Teknologi Kommissionen (tilskud numre: 10411950100 til XS, 12ZR1405300 til YC), National Natural Science Foundation of China (tilskud numre : 81100344, 81173078 til SZ, 81371268 til SC, 81172273, 81272388 til LD, 81472673 til YC, 81272388, 81400628 til XS), National Clinical Key Special Emne Kina (tilskud nummer: 371 til XS), og Shanghai Pujiang Program ( tilskud nummer: No.13PJD008 til GC). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den tredje hyppigst diagnosticeret malignitet og den fjerde hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. På grund af screening og fjernelse af præmaligne polypper, har incidensrater faldet over de sidste 3 årtier [2]. Anvendelsen af ​​nye lægemidler, såsom oxaliplatin, bevacizumab, cetuximab og panitumumab giver patienter med metastatisk kolorektal cancer overleve længere [3,4,5,6]. På trods af fremskridt i diagnosticering og behandling af CRC, stadig høj dødelighed af denne sygdom. I betragtning af den dårlig prognose af CRC, nye prognostiske markører og terapeutiske strategier skal udvikles for yderligere at forbedre resultatet af kolorektal cancer.

De hæmmere af apoptose protein (IAP) familie har vist sig at være afgørende i apoptose modstand i en bred vifte af malignitet [7,8,9,10]. Disse proteiner er kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​op til tre kopier af baculovirale IAP Repeat (BIR) domæne. Den IAP’er binder til og undertrykke en række pro-apoptotiske faktorer, derved effektivt at hæmme apoptose i cancerceller [11]. Baculovirale inhibering af apoptose protein gentagelse indeholdende 6 (BIRC6), også kendt som Apollon eller Bruce, er det største medlem af IAP familie med en enkelt BIR-domæne ved N-terminalen og en aktiv ubiquitin-konjugerende (UBC) enzym domæne i den C-terminal [12]. Ud over sin IAP aktivitet, BIRC6 har den karakteristiske egenskab af aktivitet som en kimære E2 /E3 ubiquitinligase i pattedyr [13]. Med sit UBC domæne, BIRC6 fremmer nedbrydningen af ​​Smac og hæmmer aktiviteten af ​​caspase-9, som spiller en vigtig rolle i initieringen af ​​apoptose [14]. Mens BIRC6 selv er reguleret af ubiquitinering og proteasomalaktivitet nedbrydning medieret af E2, Ubch5c og Nrdp1 [15].

En stor mængde af beviser viste, at BIRC6 var stærkt til udtryk i flere typer af kræft. Det er blevet rapporteret, at kræft hjerne celler med høje niveauer af BIRC6 var resistente over for forskellige anticancerlægemidler [12]. BIRC6 overekspression var forbundet med ugunstige prognose i barndommen

de novo

akut myeloid leukæmi [16]. Endvidere er det blevet rapporteret, at p53 er en nedstrøms effektor af BIRC6 [17,18]. Disse resultater tyder på, at BIRC6 måske en ny terapeutisk mål for ondartet svulst.

Qiu

et al

. [14] først bevist, at siRNA’er rettet BIRC6 forfremmet apoptotisk celledød. Efterfølgende flere undersøgelser bekræftet, at lukke munden BIRC6 forårsagede forhøjet apoptose [17,18,19]. Desuden indledende undersøgelse viste, at BIRC6 udtryk var mere rigelige i CRC væv end i ikke-neoplastiske væv ved hjælp af cDNA microarrays [20]. Lignende resultat blev opnået i sammenlignende proteomics undersøgelse af tyktarmskræft stamceller [21]. Imidlertid har der ikke været nogen rapporter om sin prognostisk relevans baseret på kliniske data. I den foreliggende undersøgelse, vi udforskes prognostiske betydning og biologiske funktioner i BIRC6 i kolorektal cancer. Vores data viste en stærk sammenhæng mellem BIRC6 overekspression og de ugunstige kliniske funktioner. Desuden BIRC6 opregulering i CRC forudsagde dårlig prognose af patienterne. Desuden Vi fandt, at BIRC6 knockdown hæmmet CRC celleproliferation, anholdt CRC cellecyklus på S-fasen, nedreguleret cyclin A2, B1, D1 og E1-niveauer, og sensibiliserede CRC celler til kemoterapi.

Materialer og metoder

Patienter, vævsprøver og opfølgende

Den foreliggende undersøgelse blev overvejende udført af en retrospektiv design. CRC prøver (n = 126) blev opnået fra patienter, der fik kirurgi på Zhongshan Sygehus, Fudan University mellem januar 2008 og august 2008. Ingen af ​​dem har modtaget strålebehandling. Blandt 126 patienter, 42 Patienter receieved oxaliplatin kemoterapi (FOLFOX4, oxaliplatin, 5-fluorouracil og leucovorin) efter kurativ resektion. Den opfølgende oplysninger af alle deltagere blev opdateret hver 3. måned via telefon. Alle patienter blev overvåget fremadrettet ved serum CEA, ultralydsundersøgelse, endoskop, computertomografi hver 3-6 måned. Diagnosen for tilbagefald var baseret på den billeddannende fremgangsmåde og biopsi (om muligt). Patienterne blev fulgt indtil døden eller april 1, 2013 med en gennemsnitlig postoperativ opfølgning varighed på 59 måneder. Samlet overlevelse (OS) blev defineret som tiden fra datoen for kirurgi til døden af ​​enhver årsag, bliver patienter i live censureret ved sidste opfølgning. Sygdomsfri overlevelse (DFS) blev defineret som den forløbne tid fra operation til den første forekomst af en af ​​følgende begivenheder: kolorektal cancer fjernmetastaser; gentagelse af kolorektal cancer; udvikling af anden ikke-colorectal malignitet eksklusive basalcellekarcinomer i huden og carcinoma in situ i cervix; eller død uanset årsag uden dokumentation for en cancer-relateret begivenhed. Patienter med TNM stadie IV tumorer blev udelukket, når man analyserer DFS. Tredive parrede frisk resektion CRC væv og de parrede tilstødende ikke-kræft væv blev indsamlet til Western blotting. Undersøgelsen blev godkendt af Research etiske komité Zhongshan Hospital. Alle patienter forudsat skriftlig samtykke formularer til denne undersøgelse

mikrosatelitter ustabilitet (MSI) analyse og KRAS mutation analyse

MSI-analyse blev undersøgt ved hjælp af tre mononukleotidbyggeblokken gentagne markører:. BAT25, BAT26, og CAT25 som beskrevet tidligere [22]. KRAS mutation blev udført ved PCR amplifikation af genomisk DNA ved anvendelse af følgende primere:. Sense 5′-AAGGCCTGCTGAAAATGACTG-3 ‘og antisense 5′-AGAATGGTCCTGCACCAGTAA-3’

Immunhistokemi og evaluering

Paraffin -embedded sektioner af normale og tumorvæv blev afparaffiniseret i xylen og rehydreret i en faldende ethanol serie fortyndet i destilleret vand. Efter antigen-genvinding med en 10 mM citratpuffer blev CRC sektioner inkuberet natten over ved 4 ° C med det primære anti-BIRC6 polyklonalt antistof (Abcam, Cambridge, MA). Efter 30 minutters inkubation med sekundært antistof mod HRP-konjugeret-kanin Ig, blev snit udviklet i 3, 3′-diaminobenzidin opløsning ved mikroskopisk observation og modfarvet med hæmatoxylin.

Sektionerne blev observeret under et lysmikroskop, for en histologisk bedømmelse, at undersøge tumor mikroheterogenitet i antigen distribution. Fem randomiserede mikroskopiske udsigt over 400 gange forstørrelse af hver sektion blev observeret og scorede. Både intensiteten af ​​immunhistokemisk farvning (0, negativ; 1, svag; 2, mellemprodukt 3, stærk), og procentdelen af ​​positive celler (0, 0% positive celler; 1, 1-10% positive celler; 2, 11- 50% positive celler; 3, 50% positive celler) blev evalueret. Det endelige resultat af hver prøve blev opnået ved at gange de snesevis af farvningsintensitet og procentdelen af ​​positive celler. Prøver blev klassificeret som negativ, når de endelige scoringer var fra 0 til 3 og positive, når 4 til 9 [23]. Den BIRC6 farvning blev scoret uafhængigt af to patologer blindede til de kliniske karakteristika af patienterne. Den intra-observatør reproducerbarhed blev testet ved at opnå de mest udbredte statistiske K-scores at kvalitet styrken af ​​aftalen til seks kategorier [dårlig (κ-score, 0,00), let (0,00-0,20), fair (0,21-0,40) , moderat (0,41-0,60), væsentlig (0,61-0,80) og næsten perfekt (0,81-1,00)] [24].

Cell kultur

LoVo, SW620, DLD-1, HT -29, blev HCT116, SW480 og SW1116 købt fra Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), human kolon sunde cellelinie NCM460 blev købt fra Incell corporation. The SW620, HT-29, blev SW480 og HCT116-celler rutinemæssigt opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium tilsat 10% føtalt bovint serum (FBS) (HyClone, Logan, UT). LoVo, DLD-1 og SW1116 blev opretholdt i RPMI 1640 medium plus 10% føtalt bovint serum. NCM460 blev dyrket i M3: 10 medium. Celler blev holdt ved 37 ° C i en fugtig inkubator under 5% CO

2.

Etablering af stabile BIRC6-knockdown kloner

Lentiviral transduktion blev brugt til at etablere BIRC6 knockdown stabile kloner. Et panel af shRNA (short hairpin RNA) lentivirusvektorer afveg i BIRC6-targeting sekvenser (TRCN0000041-57 ~ 61) og pLKO.1-puro tom vektor blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Celler blev transficeret ved en MOI på 1 i 24 h, screenet ved puromycin. Inhiberingen effektivitet blev identificeret ved Western blotting.

Western blotting

Colorectum væv eller høstede celler blev homogeniseret i SDS-lysepuffer (40 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % SDS, 1 mM aprotinin, 1 mM PMSF og 10 mg /ml leupeptin) og derefter centrifugeret i 15 minutter ved 4 ° C. Total proteinlysater ekstraheret fra prøver blev kvantificeret med BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). En alikvot af protein blev kogt med protein loading buffer i 5 minutter, og blev sat på SDS-polyacrylamidgel. Lige store mængder protein blev separeret med 8% SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA) under anvendelse af en mini-trans-blot-apparat (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Membraner blev blokeret med PBS-0,05% Tween 20 indeholdende 5% fedtfri tørmælk i 1 time efterfulgt af inkubering med antistof mod BIRC6 eller glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase antistof ved 4 ° C natten over. Membranen blev derefter inkuberet med sekundært peberrodsperoxidasekonjugeret gede-anti-kanin eller anti-muse-antistof (Jackson Immune Research Laboratories Inc., West Grove, PA). Blots blev udviklet ved anvendelse af en forøget kemiluminescens-kit (Tiangen, Kina). Hvert eksperiment blev gentaget mindst tre gange.

Celleproliferationsassay

Celleproliferation blev målt ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Co, Kumamoto, Japan) ifølge til anvisningerne fra leverandøren. Celler blev inkuberet med CCK-8 i 1 time med 3 multipla og proliferationshastighed blev vurderet ved at måle absorbansen ved 450 nm med den universelle mikropladelæser. Hvert eksperiment blev gentaget tre gange [25].

Kolonidannelse assay

forankringsuafhængig vækst evne blev målt ved anvendelse blød agar-kolonidannelse assayet og plade kolonidannelse assayet hhv. For blød agar-kolonidannelse, bekæmpelse eller stabile BIRC6-knockdown celler (1 x 10

3 celler /brønd) blev resuspenderet i DMEM eller RPMI 1640 indeholdende 0,3% ædle agarose (Takara Shuzo Co., Tokyo, Japan) i seks- brønds plader. Suspensionen blev lagt over DMEM eller RPMI 1640 indeholdende 0,6% ædelt agarose og yderligere dækket med 0,5 ml DMEM eller RPMI 1640. Pladerne blev derefter inkuberet i en CO 5%

2 inkubator ved 37 ° C i 14 dage, med opfyldning af medium hver anden dag. Kolonier blev afbildet under anvendelse af Nikon ECLIPSE TE300 og makroskopisk synlige kolonier i 3 tilfældigt udvalgte felter per brønd blev talt for kvantificering. For plade kolonidannelse assayet blev celler fra forskellige behandlede grupper podet i seks-brønds plader (800 celler /brønd) i 2 uger. Kolonier blev farvet med 0,1% krystalviolet i 20% methanol og kolonier indeholdende mere end 50 celler blev talt. Plating effektivitet blev beregnet som:. Plating effektivitet = (koloni nummer /plating celle nummer) × 100%, i tre eksemplarer

Cell cyklus og apoptose assay

Effekten af ​​BIRC6 knockdown på cellecyklus blev analyseret ved flowcytometri. Celler blev trypsinbehandlet og fikseret med iskold 70% ethanol ved 4 ° C natten over. For DNA indholdsanalyse blev celler inkuberet med 50 pg /ml propidiumiodid (Sigma, St. Louis, MO) i nærvær af 100 ug /ml RNase og 0,2% Triton X-100 i 30 minutter ved 37 ° C. DNA-indholdet blev bestemt i BD FACSAria

II. Fordelingen af ​​celler i hver fase af cellecyklussen blev beregnet under anvendelse af Flowjo Program. Hvert eksperiment blev udført tre gange.

I apoptose analyse ved flowcytometri blev cellerne behandlet med 5-FU, CDDP, oxaliplatin eller CPT-11 (alle fra Sigma, St. Louis, MO) [26]. Drug-induceret apoptose blev analyseret ved hjælp af Annexin V assay kit (BD Biosciences, San Jose, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Tumor xenograftmodeller

Tyve Balb /c nøgne mus (4 uger gamle, 12-14 g) blev købt fra forsøgsdyr center of Shanghai Institute of Life Science (Shanghai, Kina) og blevet rejst under specifikke patogenfrie betingelser. Alle operationer blev udført under bedøvelse med natriumpentobarbital. DLD-1-celler (stabil BIRC6 knockdown 59 og kontrol- kloner, 10

6) i 0,1 ml PBS blev injiceret subkutant i den højre flanke af hver mus. Mus blev aflivet efter 4 uger efter injektion; tumorer blev udskåret og vejet. Tumorvolumen blev beregnet ved formlen: 0,5 × L × W

2 (L = længden af ​​tumor; W = bredde tumor). Dyreforsøg blev udført i henhold til de kriterier, der er skitseret i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, udarbejdet af National Academy of Sciences og offentliggjort af National Institutes of Health, og også er godkendt af den etiske komité for Fudan University.

statistisk analyse

statistisk analyse blev udført ved anvendelse af IBM SPSS statistisk software (version 17.0). Kategoriske variabler blev sammenlignet ved χ

2 test eller Continuity Correction eller Fishers eksakte test efter behov. Kontinuerlige variabler blev sammenlignet ved hjælp af Wilcoxon ranksum test og uafhængig to prøve

t

-test. Univariate analyser blev udført for at identificere de faktorer, der påvirker overlevelse CRC. Multivariat analyse blev udført ved hjælp af Cox multivariate proportional hazard regressionsmodel. Overlevelseskurver blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden (log-rank test). Alle data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse af middelværdien (SEM) fra tre uafhængige forsøg og

P

-værdier blev bestemt ud fra 2-sidede test. Statistisk signifikans blev vist som *,

P

0,05 eller **,

P

0.01.

Resultater

Forbedret BIRC6 udtryk i CRC celler linjer og klinik CRC væv

Vi først opdaget den BIRC6 udtryk i 7 CRC celler. Western blotting viste, at BIRC6 blev overudtrykt i LoVo, SW620, DLD-1, HT-29, HCT116, SW480 og SW1116, det svagt blev påvist i normal colon epitelial cellelinje NCM460 (Fig 1A). Vi næste udført Western blotting for at undersøge BIRC6 udtryk i 30 parrede CRC væv og tilstødende nontumorous væv. Dataene antydede, at BIRC6 var forhøjet i tumorvæv (figur 1B). Vi vurderede endvidere BIRC6 udtryk i 126 CRC patienter ved immunhistokemi. Som et resultat blev signifikant BIRC6 farvning detekteret i CRC væv (positiv, 73 af 126), hvorimod farvningen i tilsvarende normale væv var meget svagere (positiv, 17 126) (fig 1C og 1D). Især blev reproducerbarheden af ​​vores klassifikation af BIRC6 udtryk fundet at være “næsten perfekt” (κ-værdi, 0,816), når de 126 lysbilleder af CRC væv blev vurderet af to uafhængige observatører. Resultaterne ovenfor viste, at BIRC6 blev signifikant opreguleret i CRC cellelinier og klinik CRC væv.

(A) Ekspression af BIRC6 i 1 human colon sund cellelinie og 7 CRC cellelinier. Overpanel: Typiske mønstre af BIRC6 udtryk i NCM460 og CRC-cellelinjer. Underpanel: Relativ intensitet BIRC6 normaliseret til GAPDH. Data tilstedeværende gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg. (B) Ekspression af BIRC6 i 30 parrede CRC væv (T) og tilstødende nontumorous væv (N). Overpanel: Typiske mønstre af BIRC6 udtryk i CRC væv. Underpanel: Relativ intensitet BIRC6 normaliseret til GAPDH. (C) Immunhistokemi farvning af BIRC6 i tumorvæv og selvstændige parret tilstødende ikke-tumorform væv fra fire repræsentative CRC patienter. (D) Snesevis af immunhistokemi farvning af BIRC6 i 126 tilfælde. **,

P

0.01.

Sammenhæng mellem BIRC6 udtryk og klinisk patologisk data

Vi undersøgte korrelationen mellem BIRC6 udtryk med clinicopathologic funktioner i 126 CRC patienter. Patient kliniske karakteristika er anført i S1 tabel. Der var ingen signifikant sammenhæng mellem BIRC6 udtryk og alder, køn, tumor placering, lymfeknude metastaser (N etape), fjernmetastaser (M etape), histologi typen, graden af ​​differentiering, KRAS status og MSI-status. Men BIRC6 udtryk positivt korreleret med tumorstørrelse (

P

= 0,044) og invasion dybde (T etape) (

P

= 0,013) (Tabel 1).

Prognostisk værdi af forbedret BIRC6 udtryk

Kaplan-Meier analyse og log-rank test blev anvendt til at bestemme forholdet mellem BIRC6 udtryk og prognose. CRC patienter med positiv BIRC6 udtryk tendens til at have kortere samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS) (

P

= 0,001 og

P

= 0,010, henholdsvis) (fig 2A og 2B). Vi næste opdelt patienterne i to grupper: ingen kemoterapi gruppe og kemoterapi gruppe. Som det viste i figur 2C og 2D, blev BIRC6 udtryk korreleret med OS (

P

= 0,038) og DFS (

P

= 0,041) på ingen kemoterapi gruppe. Lignende resultater blev observeret i kemoterapi gruppe (

P

= 0,003 og

P

= 0,010) (fig 2E og 2F). Univariate analyse viste, at positiv BIRC6 udtryk var forbundet med dårligere OS (

P

= 0,002) og DFS (

P

= 0,013) (Tabel 2). Andre faktorer korrelerede med OS var T stadium, N stadium M scenen og tumor grad af differentiering. Faktorer, der påvirker DFS medfølgende T stadium, N stadium KRAS status og MSI-status. Desuden multivariate analyse identificeret forbedret BIRC6 niveau en risikofaktor for både OS (

P

= 0,045) og DFS (

P

= 0,026) (tabel 3).

samlet overlevelse (A) og sygdomsfri overlevelse (B) mellem patienter med positiv og negativ ekspression af BIRC6 blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet ved log rank test. Samlet overlevelse (C) og sygdomsfri overlevelse (D) blev estimeret på ingen kemoterapi gruppe. Samlet overlevelse (E) og sygdomsfri overlevelse (F) blev estimeret i kemoterapi-gruppen. Patienter med TNM stadie IV tumorer blev udelukket ved analyse sygdomsfri overlevelse. Vejviser

BIRC6 knockdown hæmmet CRC celledeling

Da den fuld længde cDNA af BIRC6 strækker i 14,5 kb, er det vanskeligt at overudtrykke BIRC6 i en cellelinie. I stedet brugte vi lentiviral transduktion at etablere BIRC6 Knockdown stabile kloner i to CRC cellelinier: SW480 og DLD-1. Den nedreguleret BIRC6 ekspression blev observeret signifikant i to BIRC6-knockdown cellelinjer (59 og 61), som vist ved Western blotting (fig 3). Disse to kloner blev anvendt i den efterfølgende analyse.

(A) BIRC6 knockdown effektivitet blev bevidnet ved Western blotting. (B) Relativ ekspression af BIRC6 normaliseret til GAPDH blev beregnet. **,

P

0,01 over for kontrol.

CCK-8 assay viste, at BIRC6 knockdown signifikant inhiberede proliferationen af ​​SW480 og DLD-1 celler i en tidsafhængig måde

in vitro

(fig 4A ). Kolonidannelse assay viste, at BIRC6 knockdown reduceret kolonidannelse i agar i SW480 og DLD-1-celler (Fig 4B). Lignende resultater blev observeret i kolonidannelse i plader (Fig 4C).

(A) Cell-vækstkurver kontrol (CS) og to BIRC6 knockdown kloner (59 og 61). (B) Repræsentative billeder af blød agar-kolonidannelse assayet og relative niveauer af kolonier i BIRC6 knockdown kloner normaliseret til kontrollen. (C) Repræsentative billeder af plade kolonidannelse assayet og relative niveauer af kolonier i BIRC6 knockdown kloner normaliseret til kontrollen. Data tilstedeværende gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg. **,

P

0,01 over for kontrol.

BIRC6 knockdown induceret cellecyklusstandsning ved S-fasen og nedreguleret cyclin A2, B1, D1 og E1-niveauer i CRC-celler Salg

Cell cyklus analyse viste, at procentdelen af celler i S-fase steg mens procentdelen af ​​celler i G2 /M-fase faldt efter BIRC6 knockdown i både SW480-celler og DLD-1 celler (fig 5A og 5B), hvilket indikerede, at BIRC6 knockdown forhindret CRC-celler i at komme ind den mitotiske fase . For at kontrollere om BIRC6 kunne regulere de gener, der er involveret i celle-cyklus kontrol, vi har registreret effekten af ​​BIRC6 på ekspressionen af ​​flere cycliner. Western blotting viste, at BIRC6 knockdown faldt niveauerne af cyclin A2, B1, D1 og E1 i både SW480-celler og DLD-1-celler (Fig 5C).

(A) Repræsentative billeder af cellecyklus vurderet af PI-farvning . (B) Kvantificering af fordelingen cellecyklus. Kontrolceller blev celler transficeret med pLKO.1-puro tom vektor; KD-59 og KD-61 var celler transficeret med shRNA lentivirusvektorer afveg i BIRC6-målsekvenser. (C) Ekspression af cyclin A2, B1, blev D1 og E1 udført ved Western blotting i kontrolgruppen og to knockdown kloner.

BIRC6 knockdown sensibiliserede CRC celler til kemoterapi

in vitro

og

in vivo

Vi undersøger rolle BIRC6 i chmosensitivity af ESCC celler. Selvom BIRC6 knockdown alene ikke inducere apoptose i SW480 celler og DLD-1 celler, BIRC6 knockdown sensibiliserede SW480 celler og DLD-1 celler til kemo-induceret apoptose, herunder 5-FU, CDDP, oxaliplatin og CPT-11 (fig 6A og 6B og S2). Konstateringen af, at BIRC6 knockdown hæmmet vækst celle og sensibiliserede CRC celler til kemo-induceret apoptose

in vitro

fik os til at afgøre, om det udøver en lignende effekt

in vivo

. Kontrol eller BIRC6 stabil Knockdown kloner af DLD-1 blev subkutant indpodet i nøgne mus. Når alle dyr havde etableret tumorer i gennemsnit fra 50 til 100 mm

3 blev tumorbearing mus behandlet med CDDP (4 mg /kg, i.p., to gange ugentligt) [27]. Antitumorvirkningen blev målt ved at overvåge tumor volumen og vægt efter behandling. BIRC6 knockdown lidt hæmmede tumorvækst. Interessant kombination af BIRC6 knockdown og CDDP behandling hæmmede tumorvækst betydeligt i forhold til enten BIRC6 knockdown eller CDDP behandling alene (Fig 7A og 7B).

(A) Repræsentative billeder af celle apoptose vurderet af Annexin V /PI farvning i kontrolgruppen (CS) og BIRC6 knockdown celler behandlet med CDDP (40 uM for SW480 eller 100 uM for DLD-1) i 24 timer eller ej. (B) Repræsentative billeder af celleapoptose for kontrol og BIRC6 knockdown celler behandlet med 5-FU (75 ug /ml for SW480 eller 50 ug /ml for DLD-1) i 48 timer eller ej. (C) Kvantificering af apoptose sats. Data tilstedeværende gennemsnit ± SEM fra tre uafhængige forsøg. **,

P

0,01 vs. kontrol.

DLD-1 celler stabilt transficeret med kontrol shRNA og BIRC6 knockdown shRNA (59) blev injiceret subkutant i nøgne mus. Tumorbearing mus blev behandlet med CDDP (4 mg /kg, i.p., to gange ugentligt). (A) Tumorstørrelsen blev overvåget. (B) Samlet tumorvægt i hver gruppe mus blev registreret. Data foreliggende gennemsnit ± SEM af 5 mus i hver gruppe. *,

P

0,05; **,

P

0.01.

Diskussion

Erhvervet resistens over for apoptose er en af ​​de afgørende kendetegnende for kræft [28]. IAP’er, en gruppe af anti-apoptose-proteiner, som er stærkt konserveret evolutionært over adskillige arter, er centrale regulatorer af apoptose [29]. BIRC6, også nævnt som Apollon, er det største medlem af IAP familie med 4830 aminosyrerester [12]. Det er også den eneste kendte IAP medlem, som er membranassocieret og lokaliserer til Golgi rum og vesikulære system [30]. BIRC6 er stærkt konserveret i forskellige arter, hvilket antyder en fælles biologisk funktion. Sekvensanalyse viste, at BIRC6 delte ca. 92% aminosyreidentitet med Bruce, et medlem af IAP familie fra mus [12]. Desuden eksisterer der Drosophila homolog af BIRC6 kaldet dBruce [31]. Modsætning til de fleste andre pattedyr IAP’er har BIRC6 blevet vist at være essentielle for levedygtighed. Fuldstændig inaktivering af Bruce-genet førte til perinatal dødelighed og forsinket vækst hos mus embryoner efter fosterdag 14 [32]. Ligeledes deletion af den C-terminale halvdel af Bruce forårsagede aktivering af caspaser og apoptose i placenta og blommesækken, og resulterede i embryonisk dødelighed [17]. Desuden masser af beviser indikerede, at BIRC6 blev overudtrykt i en række forskellige cancere, herunder gliom, barndommen

de novo

akut myeloid leukæmi, brystcancer, neuroblastom, prostatacancer og ikke-småcellet lungecancer, og overekspression af BIRC6 var korreleret med carcinogenese, progression og dårlig prognose af ondartet svulst [12,16,18,33,34,35]. Selv om den tidligere undersøgelse viste, at BIRC6 var opreguleret i kolorektal cancer ved hjælp af cDNA microarray og QRT-PCR-analyse, forholdet mellem BIRC6 udtryk og kolorektal cancer progression er ikke blevet grundigt undersøgt.

I den foreliggende undersøgelse, vi observeret, at kunne detekteres ekspressionen af ​​BIRC6 i både kolorektal cancer og tilstødende væv, men med forskellig procentsats. Niveauet af BIRC6 var tydeligvis opreguleret i CRC væv sammenlignet med tilstødende nontumorous væv. Vi viste også, at høj ekspression af BIRC6 var forbundet med uønskede kliniske og patologiske funktioner i kolorektal cancer. Endvidere patienter med positiv BIRC6 ekspression tendens til at overleve kortere og havde en højere risiko for fornyet end dem med negativ BIRC6 ekspression. Univariate og multivariate analyse viste, at BIRC6 udtryk var signifikant korreleret med OS og DFS, hvilket indikerer, at BIRC6 var en indikator for prognose.

Ligeledes BIRC6 blev også overudtrykt i 7 CRC cellelinjer. Vi anvendte RNAi tilgang til at undertrykke BIRC6 udtryk og udforskede rolle BIRC6 i CRC progression. Vores resultater viste, at knockdown af BIRC6 reduceret CRC-celleproliferation, hvilket er i overensstemmelse med den tidligere undersøgelse i flere andre tumorer. Cellecyklus-analyse viste, at BIRC6 knockdown resulterede i S-fase blok, hvilket forhindrer CRC-celler i at komme ind til mitose. Desuden Vi fandt, at BIRC6 knockdown faldt cyklin A2, B1, D1 og E1-niveauer i CRC celler. Vi foreslog, at faldet cycliner niveauer kan bidrage til BIRC6 Knockdown-induceret S fasen blok. I overensstemmelse med vores hypotese, Lee

et al

. [36] fandt, at forbindelse, der består af hinokitiol faldt niveauerne af cyclin A og cyclin E og førte til S fasen i HCT116 og SW620 celler. Joe

et al

. [37] rapporterede, at resveratrol faldt niveauerne af cycliner D1, A, og B1 og resulterede i S-fasen anholdelse i SW480 celler. Men i modsætning til vores resultater, Kikuchi

et al

. [38] fandt, at BIRC6 ubiquitylated cyklin A og BIRC6 mangel akkumuleret mere cyklin A i 293T-celler. Derfor vises effekten af ​​BIRC6 på cycliner at afhænge af celletyper og målproteiner. Endelig fandt vi, at BIRC6 knockdown sensibiliserede CRC celler for kemoterapi både

in vitro

in vivo

, som giver en begrundelse for at kombinere BIRC6 antagonisme med kemoterapi til behandling af CRC.

Den foreliggende undersøgelse har visse begrænsninger. For eksempel blev korrelationen mellem BIRC6 og prognose bestemt i et begrænset antal CRC patienter (n = 126), og denne korrelation kræves bekræftelse på et større målestok basis. I samme forstand, at vi ikke oplever en betydelig korrelation mellem BIRC6 udtryk og MSI-status kræver yderligere undersøgelser i større prøver inden fastere konklusioner kan drages. Det er værd at bemærke, at vi fandt, at BIRC6 reguleret cellecyklusprogression via modulering af celle-cyklus-regulering proteiner. Mens stigende tegn har foreslået en biologisk sammenhæng mellem MSI og ændringer i celle-cyklus-regulering proteiner i kræft [39,40].

Som konklusion nærværende undersøgelse dokumenterer, at BIRC6 fungerer som en prognostisk faktor for menneskers CRC. Desuden vores resultater tyder på, at BIRC6 knockdown i kombination med kemoterapi kan have terapeutisk potentiale i behandlingen af ​​human CRC.

Støtte Information

S1 datasæt. Data for alle Western blotting, immunhistokemi og overlevelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125281.s001

(DOCX)

S2 datasæt. Data til celleproliferationsassay, kolonidannelse assay, cellecyklus og apoptose assay og tumor xenograftmodeller

doi:. 10,1371 /journal.pone.0125281.s002

(DOCX)

S1 Fig.