PLoS ONE: Udtømning af White fedtvæv i Cancer Kakeksi syndrom er associeret med inflammatorisk signalering og Forstyrret Circadian forordning

Abstrakt

Ufrivillig vægttab hos patienter med kræft er kendetegnende for kræft kakeksi. Ætiologien for kakeksi er multifaktoriel involverer tab af skeletmuskulatur og fedtvæv forbundet med høje systemiske niveauer af akut fase-proteiner og inflammatoriske cytokiner. Mens muskelsvind åbenlyst indvirkninger på kræftpatient livskvalitet, tab af lipid depoter udgør en vedvarende energi ubalance. I denne undersøgelse blev fedt depletion undersøgt i Colon-26 model af cancer kakeksi, som er en meget anvendt gnaver model af dette syndrom. Vi undersøgte døgnets udtryk for døgnrytmeforstyr- regulatorer samt centrale formidlere af stofskiftet energi og cytokin signalering. Mus, der bærer C26 tumor udviste reduceret fedt masse, forhøjet fedtvæv lipolyse og en 5 gange stigning i plasmaniveauerne af frie fedtsyrer. Disse ændringer var associeret med aktiveret IL-6-signalering i WAT gennem en 3 gange stigning i phosphoryleret STAT3 og høj SOCS3 genekspressionsniveauer. I tilføjelse forstyrrelser i døgnrytmen regulering af lipid metabolisme blev også observeret. Lipid katabolisme syntes ikke at være påvirket af den klassiske PKA pathway aktivering af lipase HSL. ATGL proteinniveauer var forhøjet 2 gange i kakektiske mus mens 4 gange stigning phosphoryleret ACC og en 2 gange formindskelse i phosphoryleret 4EBP1 blev observeret hvilket viser, at lipidmetabolisme moduleres af ATGL AMPK /mTOR pathways. Denne undersøgelse giver evidens for aktivering af cytokin signalering og samtidige ændringer i døgnrytme og regulatorer af lipid metabolisme i WAT af kakektiske dyr

Henvisning:. Tsoli M, Schweiger M, Vanniasinghe AS, Maler A, Zechner R, Clarke S, et al. (2014) Udtømning af White fedtvæv i Cancer Kakeksi syndrom er associeret med inflammatorisk signalering og Forstyrret Circadian forordning. PLoS ONE 9 (3): e92966. doi: 10,1371 /journal.pone.0092966

Redaktør: Harpal Singh Randeva, University of Warwick – Medical School, England

Modtaget: 29 oktober, 2013; Accepteret: 27 februar 2014; Udgivet: 25 Mar 2014

Copyright: © 2014 Tsoli et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev understøttet af en cancer Institute NSW translationel program tilskud til kolorektal cancer. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Kakektiske Colon 26 celler blev venligst stillet til rådighed af Amgen. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft kakeksi syndrom (CCS) er ofte opleves af avancerede kræftpatienter er mest udbredt i bugspytkirtlen, øvre gastrointestinale og lungekræft og tegner sig for næsten 20% af kræftrelaterede følgesygdomme [1], [2]. I øjeblikket er der ingen effektive behandlinger eller prognostiske tests for at indikere de patienter med risiko for udvikling kakeksi. CCS er en kompleks metabolisk lidelse karakteriseret ved ufrivillige vægttab, fedtvæv og skeletmuskulatur udtømning, anoreksi og træthed. Cachexi er ofte forbundet med systemisk inflammation indikeret ved forhøjet plasma CRP og reducerede albuminniveauer [3]. Desuden kakektiske kræftpatienter ofte erfaring øget toksicitet under kemo /strålebehandling fører til reduceret livskvalitet og efterfølgende dårlig overlevelse [4], [5]. Selv om den nøjagtige mekanisme er endnu ikke fuldt belyst, er det almindeligt accepteret, at forhøjede niveauer af cytokiner, såsom interleukin-6 (IL-6), tumornekrosefaktor (TNF) og andre faktorer, såsom zink-alpha2-glycoprotein (ZAG) udløse kataboliske begivenheder, der fremmer lipid udtømning fra fedtdepoter og asteni [6], [7], [8]. Især har IL-6 blevet impliceret i udviklingen af ​​kakeksi i tumorbærende gnavermodeller og tab af fedtvæv hos cancerpatienter [9], [10], samt direkte stimulerende lipolyse hos voksne [11]. Kolon-26 (C26) karcinom er en veletableret murin model af cancer kakeksi resulterer i høje systemiske niveauer af IL-6. Administration af midler, der hæmmer IL-6 signalering forhindre spilde og andre funktioner i kakeksi i flere dyremodeller for kakeksi herunder Colon 26 [12], [13], [14].

Ud over at fungere som en isolator og lipid reservoir i perioder med metabolisk behov, udvider den rolle, hvide fedtvæv (WAT) for at neuroendokrin kontrol af energi-homeostase, appetit og immune /inflammatoriske reaktioner. Mens mobilisering af lipider fra adipocytter at levere energi til andre organer under fasten /kalorie begrænsning er den primære funktion af WAT, det er også involveret i udskillelsen af ​​adipokiner og cytokiner, med mange adipokiner udviser daglige variationer i plasma, som kan have indflydelse appetit, energi udgifter og reproduktion [15]. Omvendt distale organer kontrollerer lipolytiske vs lipogene veje i WAT via hormoner og cytokiner at regulere lipid metaboliske veje og dermed opnå hele kroppen energibalance. Derfor tab af WAT masse under udviklingen af ​​kakeksi ville påvirke flere organsystemer uden forringet levering af energi rige lipider.

sekretion og aktivitet af døgnets regulatorer af metabolisme er forbundet med kroppens egen endogene ur til at matche næringsstof forsyning med aktivitet cykler og miljømæssige signaler [16]. Central styring af døgnrytme er medieret af suprachiasmatic kerne, hvor en automatisk reguleret molekylær feedback-mekanisme, der involverer de BMAL /Clock regulatorer og Per /Cry målproteiner opererer at udøve neurale forordning om ur funktioner i perifere organer. En yderligere feedback loop involverer nukleare receptor Rev-erbα, som også spiller en væsentlig rolle i adipogenese. Molekylær analyse af WAT fandt, at -20% af den adipøse transkriptom udviser en rytmisk døgnets ekspressionsmønster [17]. Faktisk mange nukleare transkriptionsfaktorer, såsom de peroxisomproliferatoraktiverede receptorer (PPAR’er) samt den centrale energi homeostatiske regulator AMP aktiveret protein kinase (AMPK) og metaboliske enzymer (lipoproteinlipase-LPL) udviser oscillerende profiler indikerer komplekse interaktioner mellem døgnrytmen ur, energibalance og miljømæssige signaler [18]. Døgnrytmen dysregulation er forbundet med højere risiko for metabolisk syndrom omfatter fedme, insulinresistens og hjertekarsygdomme [19], [20]. Musemodeller af genetisk manipulerede døgnrytmen ur komponenter Bmal eller Clock display funktioner af metabolisk syndrom-lignende fænotyper eller magerhed henholdsvis [21], [22]. Endvidere har kliniske undersøgelser vist øget risiko for fedme og dets co-morbiditet i nat-shift og jet-sakket arbejdstagere [20], [23].

Tidligere undersøgelser viste, at hvide fedtvæv er en af ​​de første organer til blive påvirket under cancer kakeksi med WAT udtynding ofte tydeligt i mangel af åbenlys muskelmassen [9] tab. Tab af fedtvæv medieres overvejende af øget lipolyse forbundet med en hypermetabolisk tilstand og i nogen grad reduceret fedtaflejring [24], [25], [26]. Mobiliseringen af ​​lipid reserver i fedtvæv under kakeksi medieres af fedtvæv triglycerid-lipase (ATGL) og hormonsensitiv lipase (HSL) [24]. Den kritiske rolle, ATGL spiller i kræft kakeksi blev fremhævet af ikke blot bevarelsen af ​​fedtmasse, men også manglen på skeletmuskelsvind, i ATGL mangelfuld mus med kakeksi-fremkaldende Lewis Lunge karcinomer eller B16 melanomer [24]. Mens disse undersøgelser udvide vores forståelse af det bidrag, disse lipaser gøre til fedtvæv integritet i kræft samt andre metaboliske stater [27], den signalering mekanisme, der igangsætter fedt udtynding i kakeksi stadig dårligt forstået [28], [29]. Flere spørgsmål forbliver ubesvarede i forhold til de hypermetaboliske funktioner – især øget lipolyse – tilsyneladende i kræft kakeksi. Hvad er forbindelsen mellem forbedret lipolyse og systemisk inflammation i forbindelse med cancer kakeksi? Forøges cytokin signalering udløsende under fedtvæv depletering? Hvordan er døgnets udtryk for master-regulatorer af døgnrytme og lipidmetabolisme påvirket under kræft kakeksi? Er de normale daglige niveauer af vigtige sensorer og mediatorer af ernæringstilstand og lipid metabolisme ændres i WAT?

I dette studie undersøgte vi virkningen af ​​kakektiske colon-26 carcinom på hvidt adipocyt døgnets rytme og funktion. Denne musemodel af cancer kakeksi har været meget anvendt til at studere kakeksi som udviser lignende funktionelle og metaboliske svækkelser til den kliniske tilstand [30]. Vi kendetegnet specifikt for døgnemis- ekspression af gener er vigtige for circadian kontrol rytme og lipidmetabolisme samt aktiveringstilstanden af ​​centrale regulatorer af energi-homeostase ved to modstående tidspunkter i døgnets cyklus. Vi viser evidens for cytokin signalering gennem komponenter af IL-6 signaleringskaskade – STAT3 og SOCS3. Derudover rapporterer vi at stimulering af det lipolytiske vej hos WAT af kakektiske mus er forbundet med øget ATGL og perilipin snarere end via PKA /HSL. Vores data identificerer potentielle krydstale mellem AMPK, mTOR og 4EBP1 som vigtige mediatorer af ændret lipid stofskiftet i kræft kakeksi.

Materialer og metoder

Cell Kultur og Animal Studies

de kakeksi-fremkaldende Colon 26 celler (C26) er en muse kolon adenocarcinom og blev venligst stillet til rådighed som en gave af Amgen (USA) [31]. C26-celler blev dyrket og opretholdt i RPMI-medium (Invitrogen) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og 100 ug /ml penicillin /streptomycin (Invitrogen) i en CO 5%

2 miljø. Patogenfrie, 10-12 uger gamle BALB /c * DBA2 (F1-hybrid) mus blev fremskaffet fra ARC, Perth (Australien), og holdt ved en omgivelsestemperatur på 22 ° C under en 12 timers lys cyklus (lys tændt 6:00 til 06:00). Colon 26-celler blev inokuleret subkutant på 1 × 10

6 celler /100 pi ind i højre flanke af mus. Kontrolmus blev injiceret med 100 pi RPMI-medium indeholdende antibiotika. Over en periode på 14 dage efter podning blev legemsvægt, fødeindtagelse og tumordimensionerne registreret dagligt. Tumor-bærende og gratis-fodret kontrol mus havde

ad libitum

adgang til mad. En gruppe af kontrolmus var pair-fed at matche den daglige fødeindtagelse af kakektiske C26-bærende gruppe. Pair-fodring blev opnået ved at give ikke-tumorbærende kontrolmus fødevarer indtagelse af tilsvarende C26-tumorbærende dyr. Mus blev euthanazed ved cervikal dislokation før høsten epididymal fedtvæv, der blev lynfrosset i flydende nitrogen. Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med den australske adfærdskodeks for pasning og anvendelse af dyr til videnskabelige formål under Forskning forordning Animal (2005) i NSW. Virkningen af ​​tumorvækst og udvikling af kakeksi om dyrevelfærd blev overvejet, med passende foranstaltninger for at overvåge og afhjælpe lidelse gennemført, under protokol # 2007/006 godkendt af Animal Welfare Udvalg for Sydney Sydvest Area Health Service.

Evaluering af Kakeksi og biokemiske analyser

Fjorten dage efter inokulation af tumorceller blev musene bedøvet med ketamin /xylazin og euthanazed efter tapning af blod ved hjertepunktur. Den nettovægt slagtekroppene blev målt. Epididymal fedt blev opsamlet, vejet og derefter opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Aliquoter af plasma opnået fra blodet fra hver mus blev holdt nedfrosset indtil yderligere analyse. Den ikke-esterificeret fedtsyre-indhold i plasmaet hos kakektiske dyr blev bestemt enzymatisk under anvendelse af NEFA C kit (Wako Pure Chemicals /Novachem, Collingwood, VIC, Australia). Triglyceridindholdet i plasmaet hos kakeksi inducerende C26-bærende dyr blev bestemt ved anvendelse af kliniske automater analysator (Roche Modular E170) ifølge producentens instruktioner (Roche).

fedtvæv Histologi og Mikroskopi

WAT prøver blev fikseret i 10% formalin neutral bufret opløsning (Sigma-Aldrich), indlejret i paraffinvoks, og 5 um snit skæres og monteres på objektglas. Efter dehydrering, blev snittene farvet med hematoxylin-eosin (H /E) til histologisk undersøgelse ved lysmikroskopi og CAST gitter software (Olympus Corp., Albertslund, Danmark). Morfologisk analyse blev udført væv opnået fra 4 dyr pr gruppe (kontrol, C26-bærende mus og pair-fed). Areal og omkreds blev estimeret fra ca. 5-8 forskellige synsfelter per billede giver i alt give 250 per dyr dvs 1000 adipocytter per forsøgsgruppe.

lipolyse af Isoleret WAT Organ Cultures

gonadale fedtpuder blev kirurgisk fjernet og vasket flere gange med PBS. Vævsstykker (-15 mg) blev præ-inkuberet i 2 timer i DMEM i nærværelse eller i fravær af 25 uM Hi-76-0079 (Novo Nordisk) ved C37 ° C, 5% CO

2, 95% fugtig atmosfære. Derefter blev mediet erstattet med DMEM indeholdende 2% BSA (fedtsyre-fri) enten i nærværelse eller i fravær af 10 uM forskolin og 25 uM Hi-76-0079 og inkuberet i yderligere 60 minutter ved 37 ° C. Alikvoter af mediet blev fjernet og analyseret for FFA og glycerolindhold under anvendelse af kommercielle kits (HR Series NEFA-HR (2), WAKO Diagnostics). For Proteinbestemmelser blev fedtpuder vasket grundigt med PBS og lyseret i 0,3 N NaOH /0,1% SDS. Protein-målinger blev udført ved anvendelse af BCA-reagens (Pierce).

Kvantitativ realtids-PCR-analyse

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse af Trizol (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Første-streng cDNA blev syntetiseret fra total RNA ved anvendelse SuperScript III med tilfældige primere (Invitrogen) og oligo (dT) 12-14 (Invitrogen). Alle primersekvenser blev sprængt mod NCBI muse genomiske sekvens database for at sikre specificitet for det tilsvarende gen. Primersekvenser er vist i tabel S1. qPCR reaktioner indeholdt 1,25 ng cDNA, 300 nm genspecifikke primere og 12 pi SybrGreen (Invitrogen). Alle reaktioner blev udført under anvendelse af Corbett Rotor Gene 6000 (Corbett Life Science). Relative mRNA-niveauer blev beregnet ved den sammenlignende tærskel cyklus metode ved hjælp af

36B4

,

Tfrc

og

Hmbs

gener som housekeeping kontroller.

vestlige Blotting

helcelleekstrakterne fra fedtvæv blev opnået ved anvendelse RIPA Lysis Buffer suppleret med phosphatase og proteasehæmmere (Roche) under anvendelse af en glashomogenisator og koncentreret med centrifugale filterenheder ifølge producentens protokoller (cellesignalering Technologies, Millipore) og blev efterfølgende kvantificeret ved BCA protein acid assay kit (Pierce). Proteiner (20 ug) blev opløst på 10% Tris-HCI-geler (Bio-Rad), og blottet (iBlot, Invitrogen) som beskrevet af fabrikanterne. Cellelysater blev analyseret med de følgende primære antistoffer: kanin anti-phospho-p44 /42-mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) -Thr202 /Tyr204, kanin-anti-p44 /42-MAPK, kanin-anti-phospho-p38 MAPK-Thr180 /Tyr182, kanin-anti-p38 MAPK, kanin-anti-signal transducer og aktivator af transkription 3 (STAT3), kanin-anti-phospho-STAT3-Ser727, kanin-anti-ATGL kanin-anti-hormon-sensitive- lipase (HSL), kanin-anti -phospho-HSL-Ser563, kanin-anti-acetyl-CoA-carboxylase (ACC), kanin-anti-perilipin, kanin-anti-AMP-aktiveret protein kinase α (AMPKα), kanin-anti-phospho-AMPKα-Thr172, kanin-anti-raptor , kanin-anti-mammalian target of rapamycin (mTOR), kanin-anti-phospho-mTOR-Ser2481, kanin-anti-eukaryot translationsinitiering faktor 4E-bindende protein 1 (4EBP1), kanin-anti-phospho-4EBP1-Thr37 /46, kanin-anti -phospho-4EBP1-Thr70, kanin-anti-phospho-4EBP1-Ser65, kanin-anti-3-hydroxyacyl CoA dehydrogenase (EHHADH /PBE) og kanin-anti-beta actin. Alle anti-phospho primære antistoffer blev fortyndet 1:500 mens de resterende antistoffer blev fortyndet 1:1000. Proteiner blev visualiseret ved anvendelse af ged-anti-kanin-HRP sekundært antistof (1:2000) og vest-femto kit (Pierce). Bortset fra EHHADH (Abcam) resten af ​​antistoffer blev opnået fra Cell Signaling Technology.

Statistical Analysis

Data er præsenteret som middelværdi ± middelfejl. Statistiske analyser blev udført med uparret Students t-test. Analyse mellem 3 grupper (kontrol, colon-26 og parret-fodret) blev udført ved hjælp af One-way Anova post hoc Tyrkiet test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant ved P. 0,05

Resultater

Virkningen af ​​C26 Carcinoma på Epidydimal White fedtvæv

Colon26 karcinom er en veletableret model for kræft kakeksi i mus udviser betydelige vægttab, muskelsvind, fedt udtynding og gradvis nedsættelse af fødeindtagelse 14 dage efter tumor implantat. Efter aftale med tidligere rapporter, blev massen af ​​epididymis WAT betydeligt reduceret i forhold til frie-fodret og par-fodret kontroller (Figur 1A). Vi undersøgte, om denne dramatiske reduktion i fedtvæv masse var tydelig på mikroskopisk niveau. Hæmatoxylin /eosin farvning viste signifikante morfologiske forandringer. Hvide adipocytter fra kontrolmus viste enkelt sekskantet lipidvakuoler, der var mindre i pair-fodrede dyr og syntes mere sfærisk kakektiske mus (Figur 1B-D). Morfometrisk analyse viste desuden et signifikant fald i tværsnitsareal og omkredsen af ​​hvide adipocytter fra C26 kakektiske mus sammenlignet med

ad lib

par-fodret ikke-tumor bærer kontrol mus (Figur 1E-1F). Reduktionen i WAT vægt blev ledsaget af en stigning i plasma ikke-esterificeret fedtsyrer (NEFA) i kakektiske mus (figur 1G) og et fald i plasmatriglyceridniveauer (figur 1H). For at undersøge bidrag lipaser til mobilisering af triglycerider fra fedtvæv, vi bestemt lipid mobilisering aktivitet WAT eksplantater. Hastigheden af ​​frie fedtsyrer (FFA) frigivelse var 5 gange højere i WAT af C26 med kakeksi mus sammenlignet med kontrol ikke-tumorbærende mus (figur 1 i) med en tilsvarende stigning i glycerol frigivelse (Figur 1J). Tilsætningen af ​​HSL-specifik inhibitor (Hi 76-0079) kun marginalt reduceret FFA frigivelse indikerer, at ATGL er den dominerende lipase ansvarlig for fedtvæv lipolyse (fig 1I). For at vurdere virkningen af ​​kakeksi på den samlede lipid hydrolytiske kapacitet efter hormonal stimulering, blev WAT væv behandlet med forskolin. En yderligere stigning i FFA frigivelse var tydelig for både kontrol- og C26 kakektiske mus, med kakektiske mus præstere en maksimal hastighed på FFA produktion på 250 nmol /time * mg protein sammenlignet med 100 nmol /time * mg i kontrol mus (fig. 1K) . Glycerol release viste også en højere maksimal hastighed i C26 versus kontrol mus efter stimulering af WAT eksplanteret med forskolin (figur 1 l) indikerer en højere lipolytisk kapacitet WAT eksplantater fra C26 kakektiske mus.

(A) epididymis fedtvæv vægte fra kakektiske dyr på dag 14 efter tumor podning (

*** P 0.001,

¥¥¥ P 0,001 vs pair-fed); (C-E) Hematoxylin og eosin farvning og (B-F) kvantificering af fedtcellerne størrelse fra kakektiske og par-fodret mus. (G) cirkulerende niveauer af ikke-esterificerede frie fedtsyrer i plasma fra kakektiske dyr (* P 0,05; vs kontrol); (H, I) Fri fedtsyre (FFA) og glycerol-frigivelse fra WAT ​​eksplantater opnået fra kontrolindivider og C26 tumorbærende mus under basale betingelser i nærvær og i fravær af HSL inhibitoren Hi 76-0079; (J, K) Gratis fedtsyre (FFA) og glycerol frigivelse fra Wat eksplantaterne under forskolinstimuleret betingelser i nærvær eller i fravær af Hi 76-0079. For A, er værdier præsenteres som gennemsnit ± S.E.M. til 8-10 dyr pr gruppe. For B, er C- og D-repræsentative billeder vist blandt H 0,05,

** P 0,01,

*** P 0,001 vs kontrol). 6 am værdier duplikeret i grafen for at illustrere døgnets rytme. mRNA-ekspression værdier er middelværdier ± S.E.M. i forhold til kontroller for 4-6 dyr pr gruppe. Western blot og densitometrisk analyse af STAT3 protein og phospho-STAT3 (Ser727), i hvid fedtvæv fra kakeksi og kontroldyr.

Effekt af kræft Kakeksi på Diurnal Expression Mønster af lipogenese Pathway

for at undersøge virkningen af ​​kræft kakeksi på

de novo

syntese af fedtsyrer i WAT vi undersøgte døgnets udtryk profil metaboliske gener og nukleare transkriptionsfaktorer involveret i lipogenese. Lipoproteinlipase (LPL) er et centralt enzym involveret i TG hydrolyse af lipoproteiner at frigive fedtsyrer for optagelse i celler. I kontrolmus sine transkriptniveauer udviste ingen døgnrytme mens i kakektiske mus ekspressionsniveauer blev signifikant dæmpet på de fleste tidspunkter (figur 3). Sammen med

LPL

, udtryk for

Ap2

blev reduceret, mens

CD36

blev ikke ændret i WAT af kakektiske mus indikerer en vis grad af undertrykkelse i optagelse eller intracellulær håndtering af fede syrer (fig S1). PPAR er den fremherskende nukleare transskriptionsfaktor regulerer lipid metabolisme i adipocytter. I kontrol mus,

PPAR

og tilhørende målgener

Fas

og

Dgat2

toppede i lyset cyklus, mens der i tumor-bærende kakektiske dyr rytme var tabt og mRNA-niveauer var markant nedsat på de fleste tidspunkter. Tilsvarende

SCD1

udstillet reduceret mRNA-ekspression i kakektiske mus. C /EBPα er vigtig for adipogenese og normal adipocytfunktion. I kontrol-mus

C /ebpα

udviste ikke en daglig ekspressionsmønster mens i kakektiske mus transcript niveauer blev signifikant reduceret i løbet af dagen. Interessant direkte sammenligninger ved de genekspressionsniveauer for

Fas

C /ebpα

mellem pair-fed mus og kakektiske mus angivne signifikante forskelle på 2:00 tidspunkt indikerer, at lipid syntese kan være primært påvirket under kakeksi og ikke så meget i løbet af kaloriefattige begrænsning.

mRNA analyse af

PPARy

,

C /ebpα

,

LPL

,

Fas

,

SCD1

,

Dgat2

, isoleret fra WAT ​​af kontrol (hvid cirkel), og C26-bærende mus (sort firkant); Værdier er gennemsnit ± S.E.M. præsenteret som procentdele i forhold til kontrollerne i 4-5 dyr per gruppe (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 C26 vs kontrol). 6 am værdier duplikeret i hver graf til at illustrere en komplet 24-h cyklus.

PKA-induceret Lipolytisk Pathway ikke Enhanced i Cancer Kakeksi

Stimulering af FFA frigivelse fra triglycerid var menes at være primært medieret via protein kinase A (PKA), som direkte phosphorylerer perilipin og hormon følsomme lipase (HSL) og også påvirker fedt triglycerid lipase (ATGL), om end indirekte. seneste undersøgelser har imidlertid identificeret AMPK-medieret fosforylering af ATGL og interaktioner med CGI-58 som omdrejningspunkt for maksimal ATGL hydrolase aktivitet [27]. Vi vurderet, om lipolyse er medieret gennem PKA-vejen under udtømning af WAT i kræft kakeksi. Som vist i figur 4A, observerede vi et lille fald i phosphoryleret PKA og totale PKA-niveauer på 2 am, mens 2 PM ingen synlige ændringer blev noteret mellem kontrol og kakeksi dyr (Figur S2). mRNA-ekspressionsniveauer syntes reduceret, mens total og phospho-HSL protein niveauer var uændret på enten tid-punkt under cancer kakeksi. Interessant på genekspression niveau sås ingen signifikante ændringer mellem kontrol og par-fodret mus (Figur S3), hvorimod på proteinniveauet, observerede vi øget fosforylering i både PKA og HSL på 02:00 (figur S3). Perilipin er en central lipid belægning protein til dannelse fedt dråber og er direkte påvirket af PKA. Vi undersøgte, om cancer kakeksi påvirket mRNA og protein niveauer af perilipin og fandt ingen tilsyneladende døgnrytme i transkriptniveauer af perilipin i kontrolmus, mens ekspression blev reduceret i kakektiske dyr (figur 4B). Men Western-analyse viste øget niveauer af perilipin protein ved begge tidspunkter (figur 4C, figur S2). ATGL er den kritiske lipase som initierer det første skridt i triglycerid nedbrydning. Vi har ikke observere døgnrytmen rytme i ekspressionen af ​​dette gen, og der var ingen indvirkning på ATGL mRNA under kræft kakeksi. Imidlertid afslørede Western-analyse øget ATGL proteinniveauet for begge tidspunkter i WAT fra C26 tumor-bærende dyr (figur 4, figur S2). Svarende til den tilsyneladende uoverensstemmelse i perilipin protein og mRNA-niveauer, fremgår det, at ATGL overvejende er reguleret på en post-transkriptionel niveau i kakeksi. Disse data viser, at under sent stadium kakeksi, fedt mobilisering fra WAT ​​af C26 mus ikke induceres af PKA-vejen til at stimulere HSL-medieret lipolyse, men er forbundet med forøget ATGL protein.

(A) mRNA-analyse af

HSL

genekspression og Western blot-analyse af phospho-PKA (Thr197), total PKA, phospho-HSL og totale HSL proteiner ved 2 am og 2:00; (B) mRNA analyse af

Atgl

Perilipin

genekspression fra WAT ​​af kontrol (hvid cirkel), og C26 tumor-bærende mus (sort firkant); Værdier er gennemsnit ± S.E.M. præsenteret som procentdele i forhold til kontrollerne i 4-5 dyr per gruppe (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, C26 vs kontrol). 6 am værdier duplikeret i hver graf til at illustrere en komplet 24-h cyklus; (C) Western blot analyse af ATGL og PERILIPIN proteiner ved 2:00 og 2:00.

Perturberet døgnets udtryk for fedtsyre udnyttelse vej hos kakektiske mus.

En vigtig funktion af WAT er lipid forbruget gennem aktivering af fedtsyre β-oxidation i mitokondrierne og peroxisomer. For at forstå den rolle, WAT i generering af frie fedtsyrer som kilde brændstof under cancer kakeksi, undersøgte vi for døgnemis- ekspression af transkriptionsfaktorer, der er involveret i regulering fedtsyrekatabolisme og tilsvarende målgener (figur 5A). I overensstemmelse med tidligere rapporter,

PPARa

udstillet døgnrytmen svingning mens

PPARS

viste ikke rytme i kontrol mus. Der var ingen signifikant ændring tilsyneladende til enten

PPARa

eller

PPARS

mellem kontrol og kakeksi mus. Tilsvarende

Pgc1α

havde en karakteristisk døgnets mønster af udtryk, men var uændret i WAT af kakektiske mus.

Nrf1

, en central regulator af metaboliske gener involveret i mitokondriel respiration, viste ikke circadian svingning, men det var signifikant forøget på visse tidspunkter i løbet af 24 timer. Tfam er en mester regulator af mitokondrie biogenese. Dens transkriptniveauer ikke vise rytme og væsentlige ændringer var ikke tydeligt i løbet kræft kakeksi. I lighed med

Tfam

, udtryk for carnitinpalmitoyltransferase transferase 1α (

Cpt1α)

kræves til optagelse af langkædede fedtsyrer i mitokondrier blev opretholdt i C26 tumor-bærende dyr. PPAR målgen, peroxisomal bifunktionelt enzym (

PBE

) involveret i peroxisomal fedtsyre β-oxidation udviser en daglig spidsværdien ved 10 pm i mørke cyklus hos raske mus. WAT fra kakektiske mus viste højere overflod af

PBE

mRNA på de fleste gange, samt en betydelig 12-timers fase forhånd, toppede på 10:00 (figur 6A). Derudover blev der observeret signifikante ændringer mellem kakektiske mus og pair-fed mus ved 14:00 (figur S4). Yderligere tegn på forbedret peroxisomal β-oxidation er det højere proteinniveau af PBE i kakektiske dyr på både 02:00 og 02:00 (figur 5B, figur S4). Det ser dog, at andre komponenter i fedtsyre udnyttelse såsom AOX, HADHA og HADHB er uændret (figur S5).

(A) mRNA analyse af

PPARa, Pgc1α, PPARS

,

Nrf1, Tfam, Cpt1α

PBE

fra WAT ​​af kontrol (hvid cirkel) og C26 tumor -fyldt mus (sort firkant); Værdier er gennemsnit ± S.E.M. præsenteret som procentdele i forhold til kontrollerne i 4-5 dyr per gruppe (* P 0,05; ** P 0,01; C26 vs kontrol). 6 am værdier duplikeret i hver graf til at illustrere en komplet 24-h cyklus; (B) Western blot analyse af PBE protein ved 2 pm og 2 am tidspunkter.

(A) mRNA analyse af

AMPKa1, AMPKa2

Nøjagtig

fra WAT ​​af kontrol (hvid cirkel), og C26-bærende mus (sort firkant); (B) Western blot-analyse af phospho-AMPK (Thr192) og total AMPK 2 PM og 2:00; Immunoblotanalyse phospho-ACC og total ACC for 2 pm WAT prøver. (C) mRNA analyse af

mTOR

4Ebp1;

fra WAT ​​af kontrol (hvid cirkel), og C26-bærende mus (sort firkant); (D) Western blot analyse af phospho-mTOR (Ser2448) total mTOR, phospho-4EBP1 (Ser65), phospho-4EBP1 (Thr37 /46) og total 4EBP1 på 2:00 og 2:00. Værdier er gennemsnit ± S.E.M. præsenteret som procentdele i forhold til kontrollerne i 4-5 dyr per gruppe (* P 0,05; ** P 0,01; C26 vs kontrol). 6 am værdier duplikeret i hver graf til at illustrere en komplet 24-h cyklus.

Aktivering af AMPK Pathway i C26-bærende dyr

AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) er en større regulator af energi-homeostase, at reagere på forøget AMP: ATP-forhold ved at stimulere fedtsyreoxidation og stigende glucoseoptagelse [32]. En af de primære roller AMPK er phosphorylering og deraf følgende hæmning af acetyl CoA carboxylase (ACC), det hastighedsbegrænsende enzym i fedtsyresyntese.