PLoS ONE: MicroRNA-196b Regulerer homeobox B7-karendotelvækstfaktor Axis i livmoderhalskræft

Abstrakt

nedregulering af microRNA-196b (miR-196b) er blevet rapporteret, men dets bidrag til livmoderhalskræft progression mangler at blive undersøgt. I denne undersøgelse, vi først vist, at miR-196b nedregulering var signifikant associeret med dårligere sygdomsfri overlevelse (DFS) for livmoderhalskræft kræftpatienter behandlet med kombineret kemo-strålebehandling. For det andet ved hjælp af en tri-modal tilgang til target identifikation, vi bestemt, at homeobox-B7 (HOXB7) var en

bona fide

mål for miR-196b, og til gengæld, vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) var en nedstrøms udskrift reguleret af HOXB7. Rekonstituering af miR-196b udtryk ved forbigående transfektion resulterede i reduceret cellevækst, clonogenicity, migration og invasion

in vitro

, samt reduceret tumor angiogenese og tumorcelleproliferation

in vivo

. Samstemmende, siRNA knockdown af HOXB7 eller VEGF phenocopied de biologiske virkninger af miR-196b over-udtryk. Vores resultater har vist, at miR-196b /HOXB7 /VEGF vej spiller en vigtig rolle i livmoderhalskræft progression; derfor rettet mod denne vej kunne være en lovende terapeutisk strategi for den fremtidige håndtering af denne sygdom

Henvisning:. Hvordan C, Hui ABY Alajez NM, Shi W, Boutros PC, Clarke BA, et al. (2013) MicroRNA-196b Regulerer homeobox B7-karendotelvækstfaktor Axis i livmoderhalskræft. PLoS ONE 8 (7): e67846. doi: 10,1371 /journal.pone.0067846

Redaktør: Rolf Müller, Philipps Universitet, Tyskland

Modtaget: Januar 11, 2013; Accepteret: 21. maj 2013; Udgivet: 4 jul 2013

Copyright: © 2013 Hvordan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af midler fra Ontario Institute for Cancer Research (Grant nummer: 10NOV-399). Christine Hvordan er en CIHR Strategic Training Fellow i Excellence i Radiation Research for det 21. århundrede (EIRR21) Program, og er støttet af Scholarship Fund Lawrence, Ila og William Gifford. Der ydes også støtte fra Campbell Family Institute for Cancer Research og Ministeriet for Sundhed og langsigtet planlægning. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Worldwide, livmoderhalskræft er den tredje hyppigst diagnosticeret malignitet og den fjerde hyppigste årsag til dødelighed kræft hos kvinder, med en anslået 530.000 nye tilfælde og 275.000 dødsfald hvert år [1]. Selvom livmoderhalskræft forekomst og dødelighed er faldet i løbet af de sidste tredive år i USA [2], har 5-års overlevelse ligget under 40% for patienter diagnosticeret med stadium III eller IV sygdom [3]. Nye indsigter er forpligtet til bedre at forstå de mekanismer, der bidrager til sygdomsprogression, med henblik på at udforme bedre behandlinger til patienter med lokalt fremskreden livmoderhalskræft.

Micro-RNA (miRNA) er korte, ikke-kodende RNA, der regulerer genekspression post-transkriptionelt [4], [5], og afvigende miRNA ekspression har vist sig at være vigtig i mange humane maligniteter [6]. Genmål, der bidrager til tumorudvikling er blevet beskrevet for adskillige miRNA [7], [8], [9]; imidlertid den biologiske funktion af de fleste miRNA stadig ukendt. En af de store udfordringer for miRNA target identifikation er muligheden for miRNA til at binde mRNA-mål med ufuldkommen komplementaritet; dermed en enkelt miRNA kan potentielt regulere flere hundrede eller tusinder af gener [10]. Desværre øjeblikket

i silico

miRNA target forudsigelse algoritmer har høj falsk-discovery og falsk negative satser [11], [12]; derved mandat eksperimentel validering af miRNA mål.

nedregulering af miR-196b i livmoderhalskræft tidligere er blevet rapporteret [13], men dens rolle i tumor progression i denne sygdom er ikke tidligere blevet undersøgt. Heri rapporterer vi nedregulering af miR-196b i primære humane livmoderhalskræft væv og cellelinier. Endvidere har vi identificeret HOXB7 transkriptionsfaktor som en ny, direkte og specifikt mål af MIR-196b, som igen regulerer VEGF i livmoderhalskræft. Vigtigst blev miR-196b nedregulering forbundet med dårligere DFS hos patienter behandlet med kemo-strålebehandling, fremhæver den biologiske betydning af miR-196b i livmoderhalskræft progression.

Materialer og metoder

Etik Statement

skriftligt informeret samtykke blev opnået fra patienter, ifølge en protokol, der er godkendt til denne undersøgelse fra University Health Network Research Ethics Board. Forsøg med dyr blev udført i nøje overensstemmelse med den protokol, der er godkendt af Animal Care udvalget (ACC) i Ontario Cancer Institute, University Health Network (Animal Brug Protokol: 342,18).

cellelinjer og transfektioner

humane cervikale cancercellelinier (ME-180, SiHa og HT-3) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATTC), og dyrket i α-MEM suppleret med 10% FBS ved 37 ° C, 5% CO

2. Alle celler blev godkendt hvert halve år på Center for Anvendt Genomics (Hospital for Sick Children, Toronto, Canada) ved hjælp af AMPF /STR Identifier PCR Amplification Kit (Applied Biosystems), og fast besluttet på at være fri for

Mycoplasma

kontaminering under anvendelse af MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza). ME-180 og SiHa-celler blev transficeret under anvendelse af LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) fremad transfektionsprotokol, ifølge producentens instruktioner. Pre-miR Negative Control # 1 (NC), præ-MIR-196b (Ambion), All Stars Negative Control (siNEG), siHOXB7 og siVEGF (Qiagen) blev alle transficeret ved en endelig koncentration på 30 nmol /l.

miRNA Expression Profilering af cellelinier

Totalt RNA blev isoleret fra SiHa, ME-180 og HT3 livmoderhalskræft cellelinjer under anvendelse af Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion) ifølge producentens instruktioner. FirstChoice® Total RNA: Humant Normal Cervix Tissue (Ambion) fra 3 forskellige vævsdonorer blev udnyttet som normale komparatorer. Ekspressionsniveauer af 377 miRNA og 3 snoRNAs (kontroller) blev analyseret i de livmoderhalskræft cellelinjer og normale livmoderhalsen væv ved hjælp af TaqMan® Low Density Array (TLDA) Menneskelig MicroRNA Panel (Applied Biosystems), med Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System, som vi tidligere har beskrevet [14].

miRNA Expression Profilering af Patient Væv

Flash-frosne hulning biopsier blev indhentet fra patienter med lokalt fremskreden livmoderhalskræft, der var planlagt til at modtage primær behandling med standard kemo-stråling, der består af ekstern-beam strålebehandling til den primære cervikale tumor og bækken lymfeknuder (45 til 50 Gy total, i 1,8-til-2-Gy daglige fraktioner med 18-til-25-MV fotoner), kombineret med ugentlige doser på cisplatin (40 mg /m

2 total, 5 doser). FIGO (International Federation of Gynækologer og obstetrikere) iscenesættelse blev bestemt ved hjælp af en kombination af: forbehandling evaluering under anæstesi, computertomografi (CT) scanninger af abdomen og bækken, røntgen af ​​thorax, og magnetisk resonans imaging (MRI) af bækkenet. MRI blev også anvendt til at bestemme lymfeknude-status; bækken og para-aorta lymfeknuder blev klassificeret som positive for metastatisk sygdom, hvis MR korte akse dimension var 1 cm og tvetydig hvis det var 8 til 10 mm. Efter biopsi blev prøverne anbragt i optimal skæring temperatur (OLT) lagringsmedium til histopatologisk undersøgelse, så flash-frosset i flydende nitrogen. H 70% tumorceller blev overvejet til yderligere analyse (n = 79). De kliniske karakteristika for disse 79 patienter er angivet i tabel 1. Den mediane follow-up tid for denne kohorte var 3 år. Flash-frosne normale livmoderhalsen væv fra 11 patienter, som gennemgik hysterektomi for benigne årsager tjente som normale komparatorer.

To sektioner af 50-micron tykkelse blev skåret fra OLT indbygget flash-frosne væv og placeret i en nuklease-fri mikrorør. Totalt RNA blev isoleret ved anvendelse af Norgen Total RNA Purification Kit (Norgen Biotek), ifølge producentens instruktioner. Global miRNA ekspression blev målt mod cervixcancer og normale cervix væv med TaqMan® Low Density Array (TLDA) Humant MicroRNA A Array v2.0 (Applied Biosystems) under anvendelse af Applied Biosystems 7900HT Real-Time PCR System, som allerede beskrevet [14 ].

kvantitativ real-time PCR-analyse af miRNA og mRNA’er

Totalt RNA blev isoleret fra cellelinjer under anvendelse af Total RNA Purification Kit (Norgen Biotek), ifølge producentens instruktioner. Ekspressionen af ​​MIR-196b blev målt ved kvantitativ realtids polymerasekædereaktion (QRT-PCR) under anvendelse af standard TaqMan MicroRNA assay (Applied Biosystems). Kort beskrevet blev RNA først omvendt transkriberet under anvendelse af TaqMan MicroRNA Reverse Transcription (RT) Kit og en hårnåle-primer specifik for MIR-196b (Applied Biosystems) [15]. De 2

-ΔΔCt metode blev anvendt til at beregne relative niveauer af MIR-196b ekspression under anvendelse RNU44 som reference gen [16].

RT-produkter blev amplificeret med MIR-196b-specifikke primere, som vi tidligere beskrevet [14]. Ekspressionsniveauerne af tidligere beskrevne (c-myc, Bcl2, HoxA9, MEIS1) og kandidat mRNA mål for miR-196b (ANKHD1, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140), og HOXB7 (VEGF, Ku70, Ku80, DNA-PK, FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, THBS2) blev også målt ved QRT-PCR. Et mikrogram af total RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af SuperScript II revers transkriptase (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Kvantitativ RT-PCR blev udført under anvendelse SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) og PCR-primere (tabel S1) konstrueret ved hjælp af Primer 3 Input. De 2

-ΔΔCt metode blev anvendt til at beregne relative niveauer af genekspression, med GAPDH som reference gen [16].

Cell Levedygtighed, Proliferation og kolonidannende Analyser

levedygtighed af transficerede celler blev vurderet af Trypan blå eksklusion assay. ME-180 og SiHa-celler blev transficeret i tre eksemplarer med 30 nmol /l af præ-MIR-196b, NC, siHOXB7, siVEGF eller siNEG og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2. 48 og 72 timer efter transfektion blev cellerne trypsiniseret, farvet med Trypan blå og talt ved anvendelse af et hæmocytometer. Celleproliferation blev undersøgt ved anvendelse af CellTiter 96 ikke-radioaktivt celleproliferationsassay (MTS Assay) (Promega BioSciences), ifølge producentens instruktioner. For kolonidannelse assays blev celler transficeret med 30 nmol /l af præ-MIR-196b, før-miR Negative Control # 1, siHOXB7, siVEGF eller siNEG og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2. Ved 48 timer efter transfektion blev cellerne re-podet ved lav densitet i 6-brønds plader in triplo. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 10-12 dage, derefter fikseret og farvet med 0,1% krystalviolet i 50% methanol. Antallet af kolonier, der indeholder mindst 50 celler blev talt, og den overlevende fraktion blev beregnet ved sammenligning med celler transficeret med negativ kontrol.

Cell Migration og Invasion Analyser

BD BioCoat Matrigel Invasion Chambers og kontrol Inserts (BD Biosciences) blev anvendt til assay migration og invasion af transficerede celler. Chambers indeholdt en polyethylenterephthalat membran med 8 um porer. ME-180 og SiHa-celler blev transficeret med 30 nmol /l af præ-MIR-196b, NC, siHOXB7, siVEGF eller siNEG og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2. Ved 24 timer efter transfektion, 1,5 × 10

5 celler blev igen udsået i hver kammer med medium indeholdende lav serum (1% FBS). Kamrene blev anbragt i en 24-brønds plade, med høj serum (20% FBS) medium i hver nedre kammer til at tjene som en kemo-tiltrækningsstof. Cellerne blev inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 48 timer, derefter blev membranerne vasket, farvet, og monteret på objektglas. En lysmikroskop blev anvendt til at tælle antallet af migrerende eller invaderende celler. Relativ migration blev beregnet ved sammenligning med celler transficeret med den negative kontrol. Procent invasion blev beregnet som antallet af celler, der invaderede gennem Matrigel insert, divideret med antallet af celler, som migrerede gennem styring insert.

Cell Cycle Analysis

Cellecyklusanalyse blev udført på ME-180 og SiHa-celler efter transfektion med 30 nmol /l af præ-mIR-196b eller NC, at måle den del af cellerne i sub-G

1 fasen af ​​cellens cyklus. Celler blev høstet og vasket to gange i FACS-buffer (PBS /0,5% BSA), resuspenderes i 1 ml FACS buffer, derefter fikseret i 1 ml iskold 70% ethanol. Efter 1 h inkubation på is blev cellerne vasket igen og resuspenderet i 500 pi FACS buffer indeholdende 40 ug /ml RNase A (Sigma) og 50 ug /ml propidiumiodid, derefter inkuberet i mørke ved stuetemperatur i 30 minutter. Celler blev analyseret i BD FACScalibur (Becton Dickinson) under anvendelse af FL-2A og FL-2W-kanaler. Den flowcytometri blev analyseret under anvendelse FlowJo 7.5 software (Tree stjerne).

in vivo forsøg Salg

Seks til 8 uger gamle svær kombineret immundefekt (SCID) hunmus blev anvendt til xenotransplantat eksperimenter, i henhold til retningslinjer fra Animal Care udvalget, Ontario Cancer Institute, University Health Network. Celler blev transficeret med præ-MIR-196b eller NC og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2. Ved 48 timer efter transfektion blev cellerne høstet, og 5 × 10

5 levedygtige celler blev fortyndet i 100 pi vækstmedium. Celler blev injiceret intramuskulært i venstre musculus gastrocnemius af SCID-mus. Tumor plus ben diameter blev målt to gange om ugen og mus blev aflivet, når 15 mm blev opnået. Tumorer blev fjernet ved 25 dage efter implantation og straks fikseret i 10% pufret formalin i 24 timer, placeret i 70% ethanol i 24 timer, indlejret i paraffin, og snit (5 uM) til immunfarvning. Foruden hematoxylin og eosin (H ii) mRNA’er opreguleret mindst 2 gange i livmoderhalskræft væv sammenlignet med normale livmoderhalsen væv, ved anvendelse af to uafhængige offentligt tilgængelige microarray datasæt [17], [18]; og iii) mRNA’er nedreguleret mindst 0,5-fold ved både 24 og 72 timer efter transfektion med 30 nmol /l af præ-MIR-196b, hvor transkriptniveauer blev målt ved anvendelse af Whole Human Genome 4 × 44 K One-Color Array (Agilent).

Luciferase Reporter Assay

Vildtype eller mutant fragmenter af 3′-utranslaterede region (UTR) af HOXB7 indeholdende det forudsagte bindingssted (position 220-226) for mIR-196b blev individuelt amplificeret ved AmpliTaq Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems) under anvendelse af primerne, der er anført i tabel S1. PCR-produkterne blev oprenset, derefter klonet nedstrøms for ildflue

luciferase

gen i pMIR-RAPPORT vektor (Ambion) på

Spe

I og

Hind

III restriktionssites , at producere pMIR-HOXB7 eller pMIR-HOXB7-mut vektor. ME-180 og SiHa-celler blev co-transficeret med 100 nmol /l af præ-MIR-196b eller NC, og 100 ng af reporter vektor af interesse. Som reference kontrol, 50 ng pRL-SV vektor (Promega) indeholdende

Renilla luciferase

genet blev også transfekteret med hver tilstand. Firefly og renilla luciferaseaktiviteter blev målt ved 24 timer efter transfektion under anvendelse af Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) ifølge producentens instruktioner.

immunblotting

Celler blev transficeret med enten 100 nmol /L af præ-mIR-196b eller NC, og totale proteinekstrakter blev høstet på is efter 48 og 72 timer. Proteiner af interesse blev probet med kanin-anti-HOXB7 (1:500 fortynding Invitrogen) eller muse-anti-GAPDH (1:10,000 fortynding Sigma), og påvist med IRDye fluorescerende sekundære antistoffer (1:20,000 fortynding, LI-COR). GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Immunoblots blev scannet og kvantificeret ved hjælp af Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR).

enzymmaerket (ELISA)

Celler blev transficeret med 30 nmol /l siHOXB7 eller siNEG, og niveauet af udskilt VEGF blev målt ved 48 og 72 timer efter transfektion under anvendelse af human VEGF DuoSet ELISA (R 0,001; fig. 1A). Vigtigt er det, patienter med lavere end median miR-196b udtryk niveau på tidspunktet for diagnosen oplevet værre DFS i forhold til dem med højere miR-196b udtryk (

P

= 0,02; hazard ratio = 0,39;. Figur 1B). miR-196b udtryk blev ikke signifikant korreleret med tumorstørrelse (

P

= 0,12), FIGO stadie (

P

= 0,14), eller nodal status (

P

= 0,60 ). Global miRNA udtryk profilering udføres på tre livmoderhalskræft cellelinier (ME-180, SiHa og HT-3), også bekræftet den nedregulering af miR-196b i livmoderhalskræft. Fra de 55 miRNA, der blev dereguleret mindst 2 gange i alle tre cellelinjer i forhold til 3 normale livmoderhalsen væv, miR-196b var blandt de mest betydeligt nedreguleret miRNA (Fig. 1C), i overensstemmelse med en tidligere publiceret miRNA udtryk profilering undersøgelse [13].

A) mIR-196b ekspressionsniveauer blev målt under anvendelse QRT-PCR i 79 primære livmoderhalskræft prøver, sammenlignet med 11 normale cervix epiteliale kontroller væv. B) Kaplan-Meier-analyse af DFS i patienter med cervikal cancer. Rød, patienter med højere end median miR-196b udtryk niveau (n = 39); blå, patienter med lavere end median MIR-196b ekspression (n = 39); én patient blev fjernet fra overlevelsesanalyse grund af manglende overlevelse information. C) basale niveauer af MIR-196b i tre cervikale cancercellelinier (SiHa, ME-180, og HT-3), sammenlignet med normale cervix epitelvæv, analyseret ved QRT-PCR. **

P

. 0,01

For at udforske, om miR-196b nedregulering blev epigenetisk bestemt, foruden kromosomal tab [19], ME-180 og SiHa celler blev behandlet med demethyleringsmiddel 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-DCT). Denne behandling resulterede i kun en minimal stigning i MIR-196b ekspression, hvilket indikerer, at promotor-methylering var usandsynligt at være en vigtig mekanisme til MIR-196b under-ekspression (fig. S1A). Desuden har undersøgelsen af ​​offentligt tilgængelige microarray datasæt genekspression i primære livmoderhalskræft væv ikke konstateret væsentlige ændringer i ekspressionen af ​​DICER, drosha, DGCR8, exportin-5, eller eventuelle underenheder af RNA-polymerase II, som alle er involveret i miRNA biogenese og behandling (data ikke vist).

miR-196b over-udtryk Markant Reduceret Cell levedygtighed, Clonogenicity, spredning og invasion

for at vurdere den biologiske betydning af miR-196b nedregulering blev celler transficeret med 30 nmol /l NC eller præ-mIR-196b. Opregulering af MIR-196b ekspression blev opretholdt i op til 72 timer efter transfektion (fig. S1B). Transfektion med præ-MIR-196b medførte signifikant nedsat cellelevedygtigheden sammenlignet med kontroller efter 48 og 72 timer efter transfektion (ME-180:25% ved 48 timer, 41% efter 72 timer, SiHa: 29% efter 48 timer; 54 % ved 72 h) (fig. 2A). Desuden miR-196b overekspression medført betydelige reduktioner i clonogenicity (ME-180:57% i forhold til NC, SiHa: 64% i forhold til NC) (Fig 2B.), Proliferation (ME-180:36% ved 48 h , 35% ved 72 timer, SiHa: 22% ved 48 h 21% ved 72 h) (fig 2C), og migration (32% i forhold til NC), plus invasion (32%

vs

.. 63% for NC) (fig. 2D). Celler behandlet med præ-miR-196b demonstrerede en lille, men ikke statistisk signifikant, stigning i andelen af ​​celler i sub G

1 befolkning, ledsaget af et lille fald i G

0-G

1 populationen (fig. S1c).

A) Relativ levedygtighed ME-180 og SiHa-celler blev vurderet 48 og 72 timer efter transfektion med præ-mIR-196b (30 nmol /l) sammenlignet med negativ kontrol præ-miR (30 nmol /l) ved anvendelse af trypanblåt-assayet. B) Clonogenicity af ME-180 og SiHa celler blev vurderet ved transfektion med 30 nmol /l af præ-miR 196b eller negativ kontrol pre-miR. Ved 48 timer efter transfektion blev cellerne høstet derefter talt og re-podet ved lav densitet i 6-brønds plader. Efter 10 dages inkubation blev cellerne fikseret og farvet, og antallet af kolonier ( 50 celler) blev talt. C) Relativ proliferation af ME-180 og SiHa-celler blev undersøgt ved 24, 48 og 72 timer efter transfektion med præ-MIR-196b (30 nmol /l) sammenlignet med negative kontrol pre-miR (30 nmol /l) ved hjælp af MTS-assayet. D) Repræsentative billeder (venstre) og histogrammer (højre) afbilder migreringsevnen (øverst) og invasivitet (nederst) af ME-180-celler, som blev transficeret med 30 nmol /l af præ-miR 196b eller negativ kontrol pre-miR, høstet ved 24 timer efter transfektion, derefter talt og re-podet i invasionen kamre. Cellevandring (top), og invasion (nederst), vurderet ved 48 timer efter podning i Transwell kamre. Alle data repræsenterer middelværdien ± SEM fra 3 uafhængige eksperimenter. NC, præ-miR Negativ kontrol; *

P

0,05; **

P

. 0,01

miR-196b Over Expression Undertrykt tumorangiogenese og tumorcelleproliferation in vivo

Celler transficeret med præ-miR-196b viste ikke en statistisk signifikant forskel i tumorvækst i mus, sammenlignet med NC-behandlede celler (fig. S2). Ved 25 dage efter implantation blev imidlertid CD31 immunfarvning alligevel observeret at blive reduceret til 69% i præ-MIR-196b-behandlede tumorer i forhold til kontrol tumorer (Fig. S3, øverst). Endvidere var dette forbundet med en beskeden endnu signifikant reduktion i Ki-67-ekspression (46%

vs

. 53% for celler behandlet med NC) (fig. S3, midten), og en mindre, men ikke statistisk signifikant stigning i TUNEL-farvning (fig. S3, nederst). Derfor foreslog vores data, at præ-miR-196b bidraget til reduceret angiogenese og tumorcelleproliferation.

miR-196b Direkte Mål HOXB7

nedregulering af miR-196b i livmoderhalskræft væv og cellelinjer, og de betydelige fænotypiske virkninger af miR-196b overekspression både

in vitro

in vivo

, indikerede, at miR-196b synes at være en vigtig mediator af livmoderhalskræft progression . Således blev en tri-modal strategi [8] anvendes til at identificere potentielle mRNA mål, der kunne tegne sig for disse fænotypiske forandringer (Fig. S4). Denne metode identificeret 15 overlappende kandidat mål (ANKHD1, CALM3, CLK2, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, overfor almindelige stålbremser, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140). For målvalidering blev ME-180-celler transficeret med præ-miR-196b eller NC, og transkriptniveauer 24 timer efter transfektion blev målt med QRT-PCR for 12 kandidatlande mål (egnede primere kunne ikke være designet til de andre 3 udskrifter ), plus 4 tidligere beskrevne mål for miR-196b (c-myc, BCL2, HoxA9, MEIS1). Ingen af ​​de tidligere beskrevne mål blev ændret signifikant efter MIR-196b overekspression (fig S5A). Kun fem af de 12 testede kandidat mål var signifikant nedreguleret efter miR-196b overekspression (Fig S5B.); HOXB7 blev udvalgt til yderligere funktionel evaluering, da det var den kandidat mål, viste det højeste niveau for nedregulering (40% i forhold til kontroller). Endvidere HOXB7 er medlem af

Hox

genklyngen, en familie af gener, som er blevet rapporteret at blive dysreguleret i forskellige maligniteter [20], og MIR-196 familien er kendt for at målrette det mammale

Hox

gener [21].

En luciferase bindende assay bekræftede, at miR-196b direkte og specifikt interagerede med 3′-UTR af HOXB7. I forhold til at styre celler transficeret med pMIR-RAPPORT, celler transficeret med pMIR-HOXB7 viste nedsat luciferaseaktivitet (ME-180:68%, SiHa: 71%), når cotransficeret med præ-miR-196b (figur 3A.). Denne inhiberende virkning blev helt ophævet med pMIR-HOXB7-mut, som indeholdt en mutation i MIR-196b bindingssted. Desuden transfektion med præ-MIR-196b resulterede i signifikant reduceret HOXB7 mRNA-transkript (ME-180:49% ved 48 timer, 62% efter 72 timer; SiHa: 55% ved 48 timer, 69% ved 72 h) (Fig . 3B), og protein (74% efter 48 h. 80% ved 72 h) (fig 3C) niveauer på 48 og 72 timer efter transfektion. Der syntes at være en større fold ændring i HOXB7 på mRNA-niveauet i forhold til protein, hvilket ikke er overraskende, da miRNA interagere direkte med mRNA-transkripter og ikke proteiner. Derudover kan protein translation blive påvirket af en række mekanismer, der forekommer opstrøms, såsom nuklear eksport af RNA-transkripter og rekruttering af ribosomale subunits.

A) Relativ luciferaseaktivitet af ME-180 eller SiHa-celler ved 24 timer efter co-transfektion med pMIR-RAPPORT, pMIR-HOXB7 eller pMIR-HOXB7-mut vektorer og præ-mIR-196b eller NC (30 nmol /l). B) Relativ HOXB7 mRNA ekspressionsniveauer i ME-180 eller SiHa-celler efter transfektion (48 og 72 timer) med præ-MIR-196b eller NC (30 nmol /l), som målt ved QRT-PCR. Ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH-ekspression. C) repræsentative Western blot-billede (øverst), og relativ kvantificering af HOXB7 proteinniveauer (nederst) efter transfektion (48 og 72 timer) med præ-MIR-196b eller NC (30 nmol /l). Alle data repræsenteret middelværdien ± SEM fra 3 uafhængige eksperimenter. OD, optisk densitet; NC, præ-miR Negativ kontrol; *

P

0,05; **

P

. 0,01

VEGF er en Relevant Downstream Target af HOXB7

Da HOXB7 er en transskription faktor, var det nødvendigt at bestemme, hvilket gen (s) reguleret af HOXB7 kunne være relevante i denne sammenhæng for livmoderhalskræft. Derfor blev celler transficeret med 30 nmol /l af siHOXB7 eller siNEG, og mRNA-niveauer af kendte HOXB7 mål som Ku70, Ku80, DNA-PK, FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, thrombospoindin 2 (THBS2) og VEGF [22] , [23], [24], [25] blev målt ved 48 timer efter transfektion. VEGF demonstrerede det højeste niveau for nedregulering (43%) efter HOXB7 knockdown (Fig. S6A). Samstemmende, signifikant reduktion i VEGF-mRNA (ME-180:63% ved 48 timer, 33% efter 72 h; SiHa: 69% ved 48 timer, 41% ved 72 h) (. Figur 4A) og udskilt protein (ME-180 :82% ved 48 timer, 77% efter 72 timer; SiHa: 84% ved 48 timer, 75% ved 72 timer) (fig 4b) niveauer blev observeret ved både 48 og 72 timer efter transfektion med siHOXB7, hvilket bekræfter, at VEGF. var faktisk en relevant nedstrøms HOXB7 mål i denne sygdom. Endvidere andre pro-angiogeniske kendte mål for HOXB7 (FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, THBS2) blev ikke ændret signifikant efter HOXB7 knockdown (Fig. S6A) eller MIR-196b overekspression (fig. S6E), hvilket antyder, at HOXB7 medieret angiogenese

via

VEGF i denne sammenhæng.

A) Relativ VEGF udtryk på mRNA niveau efter transfektion af ME-180 eller SiHa celler med siHOXB7 eller siNEG (30 nmol /l), som bestemt af QRT -PCR. Ekspressionsniveauer blev normaliseret til GAPDH-ekspression. B) Relative niveauer af secerneret VEGF protein efter transfektion af ME-180 eller SiHa celler med siHOXB7 eller siNEG (30 nmol /l) som bestemt ved ELISA. Alle data repræsenteret middelværdien ± SEM fra 3 uafhængige eksperimenter. siNEG, All Stars Negativ kontrol; *

P

0,05; **

P

. 0,01

Knockdown af HOXB7 eller VEGF gengivet de biologiske virkninger observeret efter miR-196b Over Expression

For yderligere at bekræfte dette nyan- beskrevet vej af miR-196b målrettet HOXB7 som igen reguleres VEGF, ME-180 og SiHa celler blev behandlet med siHOXB7 eller siVEGF at afgøre, om disse indgreb kunne rekapitulere virkningerne af miR-196b over-udtryk. Knockdown af HOXB7 og VEGF transcript og proteinniveauer blev opretholdt i op til 72 timer efter siRNA transfektion (fig. S6B, S6c, og S6D). Vi observerede, at cellelevedygtigheden blev reduceret signifikant efter transfektion med enten siHOXB7 (ME-180:77% efter 48 timer, 66% efter 72 h; SiHa: 80% ved 48 timer, 70% ved 72 h). (Fig 5A, venstre ) eller siVEGF (ME-180:78% efter 48 timer, 60% efter 72 h; SiHa: 77% ved 48 timer, 68% ved 72 h) (fig 5A, højre), svarende til de observeret efter transfektion med effekter. præ-miR-196b (ME-180:25% ved 48 h, 41% på 72 timer, SiHa: 29% ved 48 h, 54% på 72 timer) (figur 2A.). Clonogenicity faldet markant efter enten siHOXB7 (ME-180:69%; SiHa: 71%) (Fig 5B, venstre.) Eller siVEGF (ME-180:78%; SiHa: 75%) (. Figur 5B, højre) transfektion, som tidligere observeret for pre-mIR-196b transfektion (ME-180:57% i forhold til NC; SiHa: 64% i forhold til NC) (figur 2B.).