PLoS ONE: Lad-7, Mir-98 og Mir-181 som biomarkører for Cancer og Schizophrenia

Abstrakt

Nye beviser understøtter en rolle microRNA i kræft og psykiatriske lidelser, såsom skizofreni og bipolar lidelse, gennem deres regulerende rolle på ekspressionen af ​​flere gener. Den temmelig sjældne komorbiditet af kræft og skizofreni er en gammel hypotese, der har behov for yderligere forskning i microRNA som molekyler, der kan udøve deres oncosuppressive eller onkogen aktivitet i forbindelse med deres rolle i psykiatriske lidelser. Ekspressionsmønsteret for en række forskellige microRNAer blev undersøgt i patienter (N = 6), der lider af skizofreni betegnet kontrol, patienter med en fast tumor (N = 10) og patienter med både skizofreni og tumor (N = 8). miRNA profilering blev udført på hele blodprøver ved hjælp af miRCURY LNA microRNA Array teknologi (6th 7. generation). En delmængde af 3 microRNA’er viste en statistisk signifikant differentiel ekspression mellem kontrol og studiegrupperne. Konkret blev signifikant nedregulering af lad-7 p-5p, miR-98-5p og miR-183-5p i studiegrupperne (tumor alene og tumorand skizofreni) observeret (p 0,05). Resultaterne af den foreliggende undersøgelse viste, at lade-7, kan MIR-98 og MIR-183 spiller en vigtig oncosuppressive rolle gennem deres lovgivningsmæssige konsekvenser i genekspression uanset tilstedeværelsen af ​​skizofreni, selv om en større prøvestørrelse er påkrævet for at validere disse resultater . Ikke desto mindre, er yderligere undersøgelser berettiget for at fremhæve en mulig rolle af disse og andre mikro-RNA i de molekylære veje for skizofreni

Henvisning:. Rizos E, Siafakas N, Katsantoni E, Skourti E, Salpeas V, Rizos I, et al. (2015) Lad-7, Mir-98 og Mir-181 som biomarkører for Cancer og skizofreni. PLoS ONE 10 (4): e0123522. doi: 10,1371 /journal.pone.0123522

Academic Redaktør: James D. Clelland, The Nathan Kline Institute, UNITED STATES

Modtaget: August 9, 2014 Accepteret: Februar 20, 2015; Udgivet: April 9, 2015

Copyright: © 2015 Rizos et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Skizofreni og kræft deler et bredt spektrum af kliniske fænotyper og en kompleks biologisk baggrund, implicerer et stort antal genetiske og epigenetiske faktorer [1]. Desuden er disse to betingelser synes at dele en mistænkt ætiologi, der omfatter påvirkning af flere transkriptomisk komponenter, hvilket antyder, at epigenetisk regulering af genekspression gennem virkningen af ​​miRNA kan repræsentere en central fælles træk i den lave co-forekomst af skizofreni og kræft [2 ]. Der er en gammel hypotese om temmelig sjældne co-forekomst af skizofreni og kræft. Tidligere, populationsbaserede undersøgelser har vist nedsat forekomst af carcinogenese hos skizofrene Patiens [3]. Siden da har flere spekulationer blevet gjort med hensyn til mulige molekylære basis for disse observationer, men ingen specifikke resultater er blevet registreret hidtil.

Der har været en stigende interesse på den rolle, microRNA som regulatoriske faktorer i ætiologien og patofysiologien af ​​større psykiatriske lidelser, såsom skizofreni, autisme, bipolar lidelse etc [4-6]. MikroRNA’er er en klasse af små, ikke-kodende RNA, som spiller en vigtig rolle i forskellige biologiske processer [7], herunder både psykiatriske lidelser og carcinogenese. miRNA synes at have en post-transkriptionel kontrol af genekspression, hvilket resulterer i gendæmpning eller genekspression stimulation [8]. Nylige undersøgelser har afsløret specifikke roller miRNA i hjernens udvikling [9,10], i forstyrrelser i nervesystemets udvikling [11] og i langtidshukommelsen opbevaring [12]. Rolle miRNA i carcinogenese er også blevet etableret i en lang række rapporter. Det er for nylig blevet afsløret, at 98 ud af 186 miRNA gener lokaliseret i cancerassocierede genomiske regioner ofte kan findes i forskellige typer af tumorer, hvorimod ændret ekspression af lad-7 og MIR-155 i lungekræft var korreleret med overlevelsen af ​​patienter [13,14].

Der er ingen tilfredsstillende bevis hidtil vedrørende den eventuelle regulerende rolle miRNA i co-forekomst og co-morbiditet af skizofreni og kræft. I vores tidligere undersøgelse, en signifikant nedregulering af MIR-183 i en gruppe af patienter med både skizofreni og kræft blev observeret i sammenligning med skizofrene patienter, at tilvejebringe en første indikation af, at MIR-183 kan spille en rolle i reguleringen af ​​ekspressionen af ​​andre gener med kræftpsykologisk suppressor-aktivitet [15]. I den foreliggende undersøgelse, at en større stikprøve, der nu indgår en anden undersøgelse af patienter med kræft kun blev undersøgt med hensyn til udtryk for mange forskellige RNA, i et forsøg på at give yderligere indsigt om den mulige molekylære forklaring på den lave forekomst af kræftrisiko blandt skizofren patienter.

Materialer og metoder

emner

Fireogtyve patienter blev rekrutteret fra Psykiatrisk Hospital i Attika og fra Onkologisk ambulatorium af “Attikon” University General Hospital fra og med februar 2011 til december 2012. En skematisk præsentation af både kontrol- og studiegrupper af patienter er vist i figur 1, mens mere detaljerede kliniske oplysninger findes i tabel 1. Disse patienter blev vurderet ved SCID-IV [16] og ved positive og negative syndrom subskalaer (PANSS) [17]. Eksklusionskriterier omfattede en historie på en neurologisk sygdom og aktuelle misbrug eller afhængighed i de foregående 6 måneder som defineret i DSM-IV [18]. Alle patienter var i stabiliseret psykiske tilstand og medicinen blev holdt uændret i de sidste 6 måneder mindst. Diagnosen kræft blev foretaget i henhold til de medicinske optegnelser patienten.

Ingen statistisk signifikant forskel blev fundet mellem de gennemsnitlige alderen kontrol og studiegrupper (t-test,

p

= 0,36)

kontrolgruppen bestod af 6 patienter (M /F:. 2/4, alder 48-78 år), der lider af kronisk skizofren lidelse, som havde ingen tegn på kræftsygdom (figur 1). Inklusionskriterier for kontrolgruppen var kropsvægt inden for 10% af en passende BMI, ingen andre alvorlige sygdomme undtagen skizofreni, ingen klinisk signifikante anormale laboratorieværdier og ingen patologiske fund på grundig klinisk undersøgelse. Derudover alle personer i kontrolgruppen havde ingen historie af overfølsomhed (astma, nældefeber og eksem), autoimmune sygdomme, såsom systemisk lupus erythematosus, ukontrolleret hypertension eller alvorlig hjerte, lunge, lever eller nyre tilstand.

Undersøgelsen gruppe bestod af 18 patienter (M /F: 8/10, alder 49-87 år), som lider enten fra både skizofreni og kræft (N = 8), eller cancer kun (N = 10) (fig 1). Eksklusionskriterier omfattede en historie på en neurologisk sygdom og aktuelle misbrug eller afhængighed i de foregående 6 måneder, som defineret af DSM-IV [18]. Alle patienter var i stabiliseret psykiske tilstand og medicinen blev holdt uændret i de sidste 6 måneder mindst. Diagnosticering af kræft blev foretaget i henhold til de medicinske optegnelser patienten. De patienter, der lider af kræft kun havde ingen historie af psykiatriske symptomer, og de havde en negativ familiær historie med nogen større psykiatrisk lidelse.

Alle skizofrene patienter var i en stabiliseret psykiske tilstand og deres medicin blev holdt uændret i de sidste 6 måneder mindst. Rygning historie, men ikke nyere historie ( 1 år) af alkoholisme, blev rekreative narkotika eller stofmisbrug tilladt i inklusionskriterierne for begge grupper. Alle kvindelige deltagere blev testet og fundet ikke at være gravid. Alle skizofrene patienter var på regelmæssig medicinsk behandling med antipsykotika. Alle deltagere var i stand til at kommunikere effektivt, blev informeret om arten af ​​undersøgelsen og forudsat skriftligt informeret samtykke. Undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle Review Board og etiske udvalg af både deltagende sygehuse (University General Hospital “Attikon”, Psykiatrisk Hospital i Attika) og blev gennemført i overensstemmelse med god klinisk praksis principper og gældende lokale regler. De skizofrene patienter blev klinisk fulgt op i et år efter blod indsamling til denne undersøgelse og viste ingen tegn på kræft sygdom.

Sample indsamling og bevarelse

miRNA profilering for hver patient blev udført på hele blodprøver. Bevarelse af genekspression status af prøverne blev opnået ved at samle 500 pi af fuldblod fra hver patient til en RNAprotect dyreblod Tube (Qiagen, Hilden, Tyskland). Efter forsigtig inversion blev rørene inkuberet i 2 timer ved omgivelsestemperatur, ifølge producentens instruktioner, med henblik på at give mulighed for effektiv cellelysis. Alle rør blev derefter opbevaret ved -80 ° C før RNA oprensning.

RNA oprensning, kvalitetskontrol og miRNA array-profilering

Total RNA oprensning, der indeholdt miRNA blev udført ved hjælp af RNeasy Protect Animal Blood kit (Qiagen). Alle forsøg, der omfattede prøve RNA kvalitetskontrol, miRNA profilering og analyse blev udført af Exiqon Services (Vedbæk, Danmark). Kort fortalt blev RNA kvalitetskontrol og måling foretages ud fra en Agilent 2100 Bioanalyzer og en NanoDrop instrument. 300 ng af totalt RNA fra både prøve og reference blev derefter mærket med Hy3 og hY5 fluorescerende mærke henholdsvis ved hjælp af miRCURY LNA microRNA Hi-Power Labeling Kit, Hy3 /hY5 (Exiqon, Danmark), ved at følge fremgangsmåden beskrevet af producenten. De Hy3-mærkede prøver og en hY5-mærket henvisning RNA prøve blev blandet parvis og hybridiseret til miRCURY LNA microRNA Array 7. (Exiqon, Danmark), der indeholder capture prober rettet mod alle microRNA til human, mus eller rotte registreret i miRBase 18,0. Hybridiseringen blev udført i overensstemmelse med miRCURY LNA microRNA Array Instruktionsbog anvendelse af et Tecan HS4800 hybridisering station (Tecan, Østrig). Efter hybridisering mikroarrayet objektglas blev scannet og lagret i en ozon frit miljø (ozon niveau under 2,0 ppb) for at forhindre potentiel blegning af fluorescerende farvestoffer. De miRCURY LNA microRNA Array slides blev scannet ved hjælp af Agilent G2565BA Microarray Scanner System (Agilent Technologies, Inc., USA) og billedet analyse blev udført ved hjælp af Imagene 9 (miRCURY LNA microRNA Array Analysis Software, Exiqon, Danmark). De kvantificerede signaler blev baggrund korrigeret (Normexp med offset værdi 10) [19] og normaliseret ved hjælp af den globale Lowess (lokalt vægtet Scatterplot Smoothing) regression algoritme. Spike-i kontroller blev tilsat i forskellige koncentrationer i både Hy3 og hY5 mærkningsreaktioner at evaluere mærkning reaktion, hybridisering og udførelsen af ​​array eksperiment.

Dataanalyse (uden opsyn og ekspressionsanalyse)

Principal Component Analysis (PCA) blev anvendt for at undersøge de naturligt opstår prøve klasser baseret på udtrykket profil. Et zonekort diagram blev produceret som viste resultaterne af en to-vejs hierarkisk gruppering af microRNA og prøver. Den klyngedannelse blev udført ved hjælp af den komplette-kobling metode sammen med euklidisk afstand foranstaltning.

Den statistiske signifikans af den relative ekspression af miRNA mellem kontrol og studiegrupperne blev bestemt ved anvendelse af t-test. Endvidere blev Benjamini-Hochberg metoden multipel justering test anvendes på

s

-værdier for kontrol med mulige falske positive resultater.

Resultatet af microarray analyse blev forelagt Gene Expression Omnibus og tildelt accessionsnummer GSE65143.

Resultater

i alt 322 forskellige miRNA blev analyseret af miRCURY LNA miRNA Array. Figur 2 viser et zonekort diagram, der viser ekspressionen af ​​de 50 miRNA med den højeste standardafvigelse på alle prøver. Statistisk analyse af resultaterne viste, først og fremmest, at der ikke var signifikante forskelle i udtryk profiler mellem de 2 studiegrupper (patienter med skizofreni og tumordannelse og patienter uden skizofreni, men med tumordannelse), som også depsicted i PCA plot af figur 3. Men analysen identificerede lad-7 p-5p, miR-98-5p og miR-183-5p med en meget betydelig differentiering i deres udtryk profil (

s

0,05, efter anvendelsen af Benjamini-Hochberg multiple test justering metode) mellem kontrolgruppen (patienter med skizofreni, men uden dannelse af tumorer) og begge studiegrupper (patienter med /uden skizofreni, men med tumordannelse). Disse 3 differentielt udtrykte microRNAer blev nedreguleret i begge undersøgelsesgrupper, som vist i fig 2.

Farveskalaen illustrerer den relative ekspression niveauet for miRNA og specifikt, rød farve repræsenterer et ekspressionsniveau under referenceværdien kanal, mens grøn farve repræsenterer et udtryk højere end referencen. Hver række repræsenterer et microRNA og hver kolonne repræsenterer en prøve. Den microRNA clustering træ er vist til venstre. kontrol- og studiegrupper De er tydeligt angivet med forskellige farver. Prøver S9-S13, S16, S18 S19 svarer til studiegruppen af ​​patienter med skizofreni og tumordannelse, mens prøver S21-S30 svarer til studiegruppen af ​​patienter med kun dannelse tumor. De 3 miRNA, hvis ekspression blev fundet at være signifikant højere i prøverne med kontrolgruppen af ​​patienter, er også angivet.

Hovedbestanddelen analyse blev udført på alle prøver, og på den top 50 microRNA med den højeste standardafvigelse. De normaliserede log forholdstallene er blevet anvendt til analysen. De funktioner er blevet flyttet til nul centreret, (dvs. middelværdien tværs prøver er forskudt til 0) og skaleres til at have enhed varians (dvs. variansen tværs prøver er skaleret til 1) før analysen. Prøver C2-C5, C7 C13 svarer til kontrolgruppe af patienter, mens prøve koder, der begynder med S, svarer til de 2 delmængder af studiegruppen, der er udpeget og farvet separat som i figur 2.

Diskussion

det er almindeligt kendt, at cancerceller viser et fald i apoptose niveauer, hvorimod neurodegenerative sygdomme, såsom skizofreni, er markeret med en stigning i apoptose. Under den foreliggende undersøgelse var der et forsøg på at bestemme, om eventuelt ringe association mellem kræft og skizofreni kan være forbundet med visse miRNA udtryk profiler. Disse data leveres foreløbig indsigt om den differentielle ekspression af 3 miRNA i sammenhæng med kræft kun og ikke med både skizofreni og kræft, i modsætning til hvad der oprindeligt var forventet, selv om en større stikprøve af patienter med skizofreni og /eller kræft stadig er nødvendig for at opnå mere repræsentative konklusioner. Konkret blev der observeret en statistisk signifikant nedregulering af lad-7g-5p, miR-98-5p og miR-183-5p i studiegruppen af ​​patienter (patienter med solide tumorer og patienter med skizofreni og tumor) (p 0,05), hvilket giver en indikation om deres rolle i forekomsten af ​​kræft. Høje ekspressionsniveauer af disse miRNA kan føre til høje niveauer af apoptose og således muliggøre forekomsten af ​​skizofreni. Men de observerede lave niveauer af ekspression af de samme miRNA i en bestemt gruppe af patienter med skizofreni og kræft, muligvis forårsage et fald i apoptose-niveauer og således, hvilket gør dem tilbøjelige til at udvikle maligne tumorer, kan indikere udvikling af skizofreni skyldes ændringer i molekylære veje, uafhængig af disse miRNA. Derudover neurologisk og neurotoksicitet teori har en dominerende rolle på deres patofysiologi og således, nedregulering af lad-7, MIR-98 og MIR-183 kan tilvejebringe en mulig molekylær forklaring.

Lad-7 er en miRNA som aldrig er blevet undersøgt i forbindelse med neurologiske lidelser, såsom skizofreni. Men med hensyn til Parkinsons sygdom (PD), nævnes det, at i en

Caenorhabditis elegans

model lad-7 er nedreguleret i stammer, der bærer en typisk mutation i alfa-synuclein genet (A53T) og i stammer med mutationer i PDR-1-genet [20]. Endvidere forøgede niveauer af lad-7 viste sig at dæmpe patogene LRRK2 virkninger, et molekyle, som er meget hyppigt muteret i både familiær og sporadisk PD [21]. I Alzheimers sygdom (AD), blev APP-lignende-1-ekspression vist skal moduleres ved aktiviteten af ​​lad-7 familie [22]. I en anden undersøgelse lad-7 viste sig at aktivere Toll-lignende receptor 7 og efterfølgende forårsage neurodegeneration [23]. Med hensyn til konsekvenserne af lad-7 i kræft, er det blevet nævnt, at dette miRNA hæmmer celle invasion og migration i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [24]. Desuden er en nylig undersøgelse fremhæver konsekvenserne af lad-7 i sensibiliserede fluorouracil-resistente humane hepatomaceller [25]. Endvidere lav ekspression af lad-7 forudsiger dårlig prognose hos patienter med multiple cancere [26]. Ifølge en anden undersøgelse, lad-7 nedregulerer STAT3 fosforylering i bugspytkirtelkræftceller ved at øge SOCS3 udtryk [27].

MIR-183 er en miRNA, der aldrig er blevet korreleret med neurodegenerative sygdomme i fortiden, med undtagelse af en nylig undersøgelse, hvor den mulige undertrykkende rolle miR-183 i de neurobiologiske involverede veje i skizofreni blev fremhævet [15]. Mir183 er for nylig blevet impliceret i modulering af forskellige apoptotiske og autophagic stadier gennem regulering af apoptose og autofagi gener [28-30]. I specifikke, knock-down af mir-183-ekspression kan inducere autophagic celledød i medullær thyreoideacancer, gennem regulering af nogle tumor undertrykkende signalveje, hvilket indikerer, at mir-183 kan være et attraktivt terapeutisk mål [31]. Den onkogen rolle miR183 er også blevet afsløret i en nylig undersøgelse ved at målrette transkriptionsfaktor EGR1 og fremme tumor celle migration i forskellige typer af kræft, såsom sarkomer og kolon tumorer [32]. Det synes derfor, at mir-183 i den foreliggende undersøgelse kunne have spillet en temmelig tumor suppressor rolle ved sandsynligvis aktivere ekspression af tumorsuppressorgener, der styrer celledifferentiering eller apoptose, som tidligere beskrevet [33].

ekspressionsprofilen, samt den funktionelle rolle af mIR-98 i neurologiske sygdomme, såsom skizofreni, er ikke blevet belyst endnu. Den eneste henvisning til en sådan sammenslutning er blevet gjort i en nylig undersøgelse, hvor ekspressionen af ​​miR-98 var opreguleret i tilfælde af prænatal stress ændre, således de inflammatoriske reaktioner i hjernen [1]. I AD, miR-98 vises signifikant forskellige udtryk hos patienter sammenlignet med kontroller [34]. MIR-98 har også vist sig at målrette molekyler, der er blevet forbundet med forskellige former for kræft, såsom HMGA2, som udøver en transformerende virkning på lungecancerceller [35], IRS2, et protein, som opreguleres i kolorektal kræft, fører til en stigning i Wnt signalering [36] og IGF2BP som er dokumenteret at fremme hepatocellulært carcinom [37]. Andre molekyler, der er involveret i tumorigenese og er målrettet af miR-98 omfatter N-Ras [38], SNAP23 [39], IMPDH1 [40] og mange andre.

Som tidligere nævnt, den temmelig lille stikprøve eventuelt udgør en begrænsende faktor for den foreliggende undersøgelse. Det skal dog anføres, at det i lyset af den alvorlige vanskeligheder med at rekruttere patienter, der udviser skizofreni og kræft som komorbiditet, dette var den første kliniske undersøgelse, der forsøgte at give nogle indledende indsigt om den mulige lav risiko for kræft hos skizofrene patienter ved analysere et stort antal miRNA i patienter med begge sygdomme og patienter med enten skizofreni eller kræft alene. Desuden blev niveauet af ekspression af miRNA analyseret i blodet og ikke i hjernen, der repræsenterer således en indirekte analyse for hjernen miRNA ekspressionsniveauer og som en konsekvens, data om en generel genetisk disposition ved konsekvensen af ​​lad-7, miR -98 og miR-183 i co-morbiditet af skizofreni og kræft blev indsamlet.

Som konklusion nærværende undersøgelse yderligere styrket den vigtige rolle, lad-7, miR-98 og miR-183 i carcinogenese, men ingen miRNA fandtes at være involveret i co-forekomst af kræft og skizofreni, som var målet. Yderligere undersøgelser med større stikprøvestørrelser stadig berettiget for at undersøge den rolle, miRNA og andre molekylære veje i forholdsvis lav co-forekomst af kræft og skizofreni.