PLoS ONE: Insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF-1R) som et mål af MIR-497 og Plasma IGF-1R der er forbundet med TNM fase af kræft i bugspytkirtlen

Abstrakt

Ekspressionsniveauerne og regulatoriske roller miR-497 i bugspytkirtelkræft er uklare. Den kliniske værdi af plasmainsulin vækstfaktor 1 receptor (IGF-1R) i pancreascancer er ikke undersøgt. I den foreliggende undersøgelse, vi viste, at miR-497 var signifikant nedreguleret i bugspytkirtelkræft væv. Opregulering af miR-497 i BxPC-3 og AsPC-1 bugspytkirtelkræft cellelinjer hæmmet spredning, forbedret apoptose, re-sensibiliserede celler til gemcitabin og undertrykte IGF-1R og p-AKT udtryk gennem direkte nedregulering af IGF-1R proteinekspression. Modsatrettede virkninger blev observeret efter nedregulering af MIR-497. Plasma IGF-1R niveauer hos patienter med kræft i bugspytkirtlen steget betydeligt, sammenlignet med patienter med kronisk betændelse i bugspytkirtlen, andre pancreas tumorer og pancreatiske neuroendokrine tumorer (

P = 0,006

,

P = 0,018

P = 0,004

henholdsvis), og viste potentielle værdier til at skelne bugspytkirtlen læsioner. Men niveauerne i bugspytkirtlen kræftpatienter var sammenlignelig med raske frivillige (

P = 0,095

). Den tumor steder og TNM stadie var forbundet med plasma IGF-1R-niveauer (

P = 0,013

P = 0,01

henholdsvis). Der var ingen signifikant forskel på total overlevelse mellem høje og lave IGF-1R ekspression grupper. Sammenfattende har vi vist, at MIR-497 svækket malignitet af bugspytkirtelkræftceller og fremmes følsomhed celler til gemcitabin ved direkte nedregulering af IGF-1R ekspression. Plasma-IGF-1R vises en potentiel værdi til at skelne læsioner i bugspytkirtlen og kunne være en ny biomarkør for at lede TNM stadium af kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Xu JW, Wang TX, Du L, Zheng LF, Shu H, Zhang TP, et al. (2014) Insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF-1R) som et mål af MIR-497 og Plasma IGF-1R der er forbundet med TNM fase af kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 9 (3): e92847. doi: 10,1371 /journal.pone.0092847

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: August 19, 2013; Accepteret: 27 februar 2014; Udgivet: 25 Mar 2014

Copyright: © 2014 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr 81.272.484, 81.141.027), Beijing Natural Science Foundation (nr 7.132.179), Beijing Municipal Natural Science Foundation (7.100.003) og forskning særlig fond for offentlig velfærd Industry of Health ( 201.202.007). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er en aggressiv og ødelæggende sygdom. PDAC har en meget dårlig prognose med en 5-års overlevelse under 5% [1]. Selvom mekanismerne i bugspytkirtlen carcinogenese har de nye markører for tidlig påvisning, og de nye terapeutiske strategier blevet bredt undersøgt [2], [3], [4], den samlede overlevelse ikke er blevet forbedret i de sidste 80 år [5] . De molekylære mekanismer i udviklingen af ​​PDAC, herunder proliferation, apoptose, lægemiddelresistens, er fortsat uklare.

miRNA er korte ikke-kodende RNA’er, som kan inhibere translation af messenger RNA (mRNA) til protein ved binding til 3′-utranslateret region (3′-UTR). MiRNA kan fungere som onkogener eller tumor undertrykkere i reguleringen af ​​carcinogenese, metastatisk kapacitet og resistens [6]. Nedregulering af miR-497 er blevet observeret i bryst-, tyktarms- og livmoderhalskræft [7], [8], [9]. Der er imidlertid ingen rapport om MIR-497 ekspressionsniveauer i bugspytkirtelkræft i øjeblikket. Insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF-1R) blev identificeret som et mål for miR-497. Nedregulering af MIR-497 bidrager til malignitet af colorektal cancer og livmoderhalskræft ved opregulering IGF-1R [8], [9]. Men de regulatoriske roller og mekanismer miR-497 i bugspytkirtelkræft er stadig uklart.

IGF-1R er en tyrosinkinasereceptor, som involverer i reguleringen af ​​proliferation, apoptose, differentiering og malign transformation af kræftceller [10]. Opregulering af IGF-1R i humane PDAC væv er blevet rapporteret [11] og associerede virksomheder med højere tumor kvalitet og dårlig overlevelse [12]. Alligevel blev plasma IGF-1R-niveauer i pancreas kræftpatienter ikke påvist i tidligere undersøgelser. De kliniske værdier af plasma IGF-1R i bugspytkirtelkræft er ukendte.

I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at MIR-497 blev signifikant nedreguleret i bugspytkirtelkræft væv. Opregulering af miR-497 hæmmede proliferation, forbedret apoptose og fremmet følsomhed over for gemcitabin gennem direkte at nedregulere IGF-1R udtryk i PDAC cancerceller

in vitro

. Vi viste også, at niveauet af plasma IGF-1R i bugspytkirtlen kræftpatienter var sammenlignelig med raske frivillige, men højere end hos patienter med kronisk pancreatitis, andre pancreas tumorer og bugspytkirtlen neuroendokrine tumorer, og viste værdier til at skelne bugspytkirtlen læsioner. Den tumor steder og TNM stadie var forbundet med plasma IGF-1R-niveauer. Der var ingen signifikant forskel på den samlede overlevelse tid mellem høj og lav IGF-1R udtryk grupper.

Metoder

Etik erklæring

Der blev udført i overensstemmelse med etik godkendelse fra Institutional Review Boards i Peking Union Medical College Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle fag.

Registrering af ekspressionen af ​​miR-497 ved in situ hybridisering (ISH)

10 formalinfikserede, paraffinindlejrede pancreas cancer prøver og matches tumor- tilstødende væv blev opnået og omdannet væv microarrays. Ekspressionsniveauerne af MIR-497 i væv blev påvist under anvendelse af miRCURY LNA detekteringsprobe for MIR-497 (Exiqon, Vedbæk, Danmark, produktnummer: 38.256-15). ISH blev udført som følgende beskrivelse. Kort fortalt blev objektglas inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter, afparaffiniseret i xylen og rehydreret med gradueret alkohol vaske. Derefter objektglas blev anbragt i 4% paraformaldehyd i 20 minutter i et stinkskab, og derefter vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) tre gange. Objektglassene blev derefter behandlet med 15 ug /ml proteinase K i 15 minutter ved stuetemperatur. Derefter vaskes objektglassene med PBS og fikseret dem i 4% paraformaldehyd i 15 minutter efter at. Efter skylning blev objektglassene præ-hybridiseret med hybridiseringsbuffer i 1 time ved stue 50 ° C og derefter hybridiseret natten over ved 4 ° C i hybridiseringspuffer indeholdende probe. Stringente vaskninger blev udført ved 50 ° C i 20 min, og derefter blev glassene inkuberet i en blokeringsopløsning i 1 time ved stuetemperatur. Efterfølgende blev objektglassene inkuberet i blokerende opløsning med alkalisk phosphatase-konjugeret anti-DIG Fab-fragment natten over ved 4 ° C. Den kolorimetriske påvisning reaktionen blev udført under anvendelse af NBT /BCIP kit (ThermoFisher Scientific) ifølge fabrikantens protokol. ISH Resultaterne blev registreret som procentdelen af ​​positive celler.

Cell kultur og reagenser

BxPC-3 og AsPC-1 PDAC cellelinjer blev venligst stillet til rådighed af professor Helmut Freiss (Heidelberg University, Tyskland ), der opnået fra American Tissue Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) [13], [14], [15]. PDAC celler blev dyrket i en befugtet inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C i RPMI-1640-medium suppleret med 10% føtalt bovint plasma (FBS, Hyclone). De primære antistoffer blev anskaffet fra Cell Signaling Technology, herunder IGF-I receptor β (D23H3) XP Kanin mAb (# 9750), β-actin (13E5) Kanin mAb (# 4970), Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XPRabbit mAb (# 4060), Akt (pan) (11E7) Kanin mAb (# 4685), Caspase-3 Antibody (# 9662) og PARP Antibody (# 9542).

miRNA transfektion

mIR-497 efterligner (5’CAGCAGCACACUGUGGUUUGU-3 ‘, 5′-AAACCACAGUGUGCUGCUGUU-3′), efterligner kontrol (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘, 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′), mIR-497 inhibitor (5’- ACAAACCACAGUGUGCUGCUG-3 ‘) og hæmmer kontrol (5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’) blev syntetiseret ved Genepharma (Shanghai, Kina). MiRNA ved 50-100 nM blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 transfektionsreagens (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol.

Cellular RNA-ekstraktion og kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) assay

Celler blev transficeret i 6-brønds plader. Efter 48 timers transfektion blev totalt RNA ekstraheret under anvendelse af TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge fabrikantens protokol. For IGF-1R kvantitativ assay blev totalt RNA revers transkriberet under anvendelse af revers transkription-kittet (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. Real-time PCR blev udført under anvendelse af SYBR Green Master Mix (Takara, Japan). GAPDH blev serveret som den endogene kontrol

IGF-1R Forward primer:. 5′-TCTGGCTTGATTGGTCTGGC-3 ‘

Reverse primer: 5′-AACCATTGGCTGTGCAGTCA-3′

GAPDH forward primer: 5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3 ‘,

Reverse primer: 5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′

i mIR-497 kvantitativ assay blev TaqMan miRNA assay anvendt ifølge producentens protokol (Applied Biosystems). U6 blev anvendt som en endogen kontrol. Fold ændringer blev beregnet under anvendelse af 2

-ΔΔCT metode.

Proliferation analyse

In vitro

proliferation blev analyseret under anvendelse af en celletælling kit (CCK-8). BxPC-3-celler og AsPC-1-celler blev transficeret i plader med 6 brønde (5 x 10

5cells /brønd). Efter 24 timer blev cellerne trypsiniseret og podet i plader med 96 brønde (1000 celler /brønd). 10 pl /brønd CCK-8-reagens blev tilsat ved 0, 24, 48, 72 timer, henholdsvis og inkuberet i 2,5 timer ved 37 ° C. Optisk densitet (OD) blev målt ved 450 nm og 630 nm ved en mikropladelæser (Wellscan MK3, Thermo /Labsystems, Finland).

kemosensitivitet analyse

BxPC-3 og AsPC-1 celler blev transficeret i 24 timer, udplades i 96-brønds plader (4000 celler /brønd), og behandles med seriefortyndet gemcitabin (Eli Lilly and Company) i triplikater. Efter 48 timers inkubation blev 10 pl /brønd CCK-8 reagens tilsat og inkuberet i 2,5 timer ved 37 ° C. Optisk densitet (OD) blev målt ved 450 nm og 630 nm under anvendelse af en mikropladelæser.

Western blotting

Efter 48 timers transfektion i 6-brønds plader blev celler fordøjet med trypsin opløsning og lyseret med RIPA buffer (Applygen, Beijing). Totale proteiner blev adskilt ved natriumdodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) -membran (Millipore, Billerica, MA). Efter blokering med 5% fedtfri tørmælk ved stuetemperatur i 1 time, blev membranerne inkuberet natten over ved 4 ° C med primære antistoffer. Membranerne blev derefter vasket og inkuberet med et peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Applygen, Beijing) ved stuetemperatur i 1 time. Proteinbånd blev visualiseret med echochemiluminescence (ECL) detektionssystem, og ekspressionsniveauerne af disse proteiner blev vurderet ved anvendelse Image-Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics, USA).

Dual-luciferase reporter assay

pmiR-RB-rapport-IGF-1R-3′-UTR vektorer indeholdende vildtype eller muteret målsekvens blev bygget af RiboBio Co., Ltd (Guangzhou, Kina). BxPC-3-celler blev udpladet i 12 brønds plader (1 × 10

5 celler /brønd) og co-transficeret med MIR-497 efterligner og vektorer, der udtrykker muterede målsekvens, eller co-transficeret med efterligninger og vektorer, der udtrykker vildtype mål sekvens under anvendelse af Lipofectamine 2000. efter transfektion i 48 timer blev luciferaseaktivitet målt ved anvendelse af Dual-luciferase Reporter Assay System (Promega) ifølge fabrikantens protokol.

Patienter og plasma IGF-1R ekspression

Plasmaprøver blev indsamlet fra 42 patienter med pancreascancer. Plasma prøver fra patienter med andre pancreas tumorer (29 patienter, herunder serøs cystadenoma (7 sager), mucinøs cystadenoma (8 sager), fast pseudopapillary tumor (10 tilfælde) og papillære mucinøs neoplasma intra-duktalt (4 tilfælde)), kronisk betændelse i bugspytkirtlen ( CP, 19 patienter), pancreas neuroendokrin tumor (PNET, 19 patienter) og raske frivillige (30 sager) blev indsamlet som kontroller. Kræft i bugspytkirtlen, PNET og andre pancreas tumorer blev diagnosticeret gennem patologisk undersøgelse. CP blev diagnosticeret i henhold til de kliniske diagnostiske kriterier. Blodprøver centrifugeres ved 3000 omdrejninger per minut (rpm) i 10 minutter. Plasma blev opsamlet og opbevaret ved -80 ° C før brug. De plasma IGF-1R-niveauer blev påvist under anvendelse human IGF-1R ELISA Kit (Katalognummer: CSB-E13766h, CUSABIO, Kina). Efter fabrikantens protokol

Statistisk analyse

SPSS v.13.0 software (SPSS, Inc., Chicago, IL) blev anvendt til statistiske analyser. Kontinuerlig data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) og sammenlignet med variansanalyse (ANOVA), studerendes

t

test eller Mann-Whitney

U

test. Kategoriske data blev præsenteret som procent og sammenlignet ved hjælp af en Pearson χ

2 test eller Fishers eksakte test, når celletal var 5. Kaplan-Meier-metoden blev anvendt for overlevelse analyse under anvendelse af log-rank test. Statistisk signifikans blev defineret som

P 0.05

.

Resultater

MIR-497 blev nedreguleret i bugspytkirtelkræft væv

blev opdaget MIR-497 niveauer i 10 pancreas cancer prøver og matchede tumor-tilstødende væv hjælp ISH. Den gennemsnitlige procentdel af positive celler i bugspytkirtelkræft væv var 30,0% ± 35,4%, hvilket var væsentligt lavere end i tumor-tilstødende væv (93.5.0% ± 2,4%) (

P = 0,000

). ( figur 1)

MIR-497 niveauer i pancreas væv blev påvist under anvendelse af ISH (200 ×). (A) Negativ kontrol. (B) ISH for miR-497 i bugspytkirtelkræft væv. (C) ISH for MIR-497 i tumor-tilstødende væv. (D) Den gennemsnitlige procentdel af positive celler i bugspytkirtelkræft væv var 30,0% ± 35,4%, hvilket var væsentligt lavere end i tumor-tilstødende væv (93.5.0% ± 2,4%). Dataene blev vist som gennemsnit ± SD.

MIR-497 hæmmede spredning

Efter 48 timers transfektion med miR-497 efterligner eller hæmmer, miR-497 niveauer blev signifikant opreguleret eller nedreguleret (fig S1 A, B). Endvidere MIR-497 opregulering signifikant inhiberede proliferation af PDAC celler (figur 2 A, B). I modsætning hertil MIR-497 nedregulering fremmet proliferation (figur 2 C, D).

Proliferation blev analyseret ved CCK-8 assay. (A, B) Transfektion med MIR-497 efterligner undertrykte PDAC celleproliferation i AsPC-1 og BxPC-3-celler, hhv. (C, D) Transfektion med MIR-497 inhibitor fremmes PDAC celleproliferation. (*

P

0.05

)

MIR-497 forfremmet følsomhed over for gemcitabin

Efter gemcitabin behandling i 48 timer, den. hæmning satser PDAC celler transficeret med mIR-497 efterligner var betydeligt højere end celler transficeret med efterligner kontrol (figur 3 A, B). Celler transficeret med MIR-497-inhibitor var mere resistente over for gemcitabin end celler transficeret med inhibitor kontrol. (Figur 3 A, C).

(A) AsPC-1-celler blev transficeret i 24 timer og derefter behandlet med 100 nM gemcitabin i 48 timer. Opregulering af MIR-497 ved transfektion af efterligninger re-sensibiliserede celler til gemcitabin. Nedregulering af MIR-497 ved transfektion af inhibitor faldt følsomheden af ​​celler til gemcitabin. (B) BxPC-3-celler blev transficeret i 24 timer, og behandles med seriefortyndet gemcitabin (1 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM). Celler transficeret med MIR-497 efterligner var mere følsomme over for gemcitabin. (C) Celler transficeret med MIR-497-inhibitor var mere resistente over for gemcitabin. (*

P

0.05

).

MIR-497 forøget ekspression af kløvet caspase-3 og PARP aktiveres af gemcitabin

caspase-3 og poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) er afgørende for apoptose. Transficerede celler blev behandlet med gemcitabin i 48 timer, og derefter niveauerne af spaltet caspase-3 og PARP blev detekteret ved western blotting. Vi fandt, at opregulering af MIR-497 forøgede niveauerne af spaltet caspase-3 og spaltet PARP (Figur 4 A, B, figur S2). Omvendt nedregulering af MIR-497 faldt niveauerne af spaltet caspase-3 og spaltes PARP. (Figur 4 A, B, figur S2).

Celler blev transficeret ind 6-brønds plader. Ved 24 timer efter transfektion blev AsPC-1 og BxPC-3-celler behandlet med 10 pM og 10 nM gemcitabin henholdsvis. Efter yderligere 48 timer blev cellerne høstet og totalt protein blev ekstraheret. (A) opregulering af MIR-497 ved transfektion af efterligninger i AsPC-1-celler forøget ekspression af spaltet caspase-3 og PARP, hvorimod inhibering af MIR-497 ved transfektion af inhibitor nedsat ekspression af spaltet caspase-3 og PARP, uden nogen virkning på niveauer af total caspase-3 og PARP. (B) Samme resultater blev observeret i BxPC-3-celler.

MIR-497 undertrykte IGF-1R-proteinekspression ved binding til 3′-UTR

Ifølge forudsigelse af åben adgang databaser (Targetscan, miRBase mål, PicTarget, microRNA.org) blev IGF-1R betragtes som kandidat mål for miR-497. For at bekræfte denne forudsigelse, udførte vi en luciferase reporter assay. Vi fandt luciferaseaktivitet var signifikant reduceret efter co-transfektion af MIR-497 efterligner og vektorer, der udtrykker vildtype målsekvens i BxPC-3-celler, sammenlignet med i celler co-transficeret med efterligninger og vektorer, der udtrykker muterede målsekvens (

P

0.05

). (B) mRNA niveauer af IGF-1R blev påvist ved QRT-PCR. GAPDH blev serveret som en intern kontrol. Transfektion med efterligninger i BxPC-3-celler ikke undertrykke ekspressionen af ​​IGF-1R-mRNA. (C) Ekspressionsniveauerne af IGF-1R, p-AKT og AKT blev påvist. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Opregulering af MIR-497 ved transfektion af efterligninger i aspC-1cells inhiberede signifikant niveauerne af IGF-1R og p-AKT, hvorimod nedregulering af MIR-497 ved transfektion af inhibitor forøgede niveauerne af IGF-1R og p-AKT, uden nogen effekt på niveauerne af total AKT. (D) Samme resultater blev vist i BxPC-3 celler.

For yderligere at bekræfte, blev western blotting udført. Vi fandt, at opregulering af MIR-497 undertrykte ekspressionen af ​​IGF-1R-protein uden ændring af ekspressionen af ​​IGF-1R-mRNA (figur 5 B, C, D, figur S3). I modsætning hertil nedregulering af MIR-497 forøgede IGF-1R-proteinekspression (fig 5 C, D, figur S3). Derudover undersøgte vi niveauet p-AKT medieret af IGF-1R. Vi observerede, at niveauet af p-AKT faldt signifikant opregulering af MIR-497. Tværtimod hæmning af miR-497 øget niveau af p-AKT (

P 0,05

). (Figur 5 C, D, figur S3)

De plasma IGF-1R-niveauer hos patienter med kræft i bugspytkirtlen

Plasma IGF-1R-niveauer blev detekteret ved ELISA. Plasmaniveauerne af IGF-1R hos patienter med kræft i bugspytkirtlen, kronisk pancreatitis, andre pancreatiske tumorer, PNET- og raske frivillige var 0,823 ± 0,57 ng /ml, 0,472 ± 0,42 ng /ml, 0,562 ± 0,3 ng /ml, 0.460 ± 0,21 ng /ml, 1,004 ± 0,50 ng /ml. Niveauerne i patienter med kræft i bugspytkirtlen steget betydeligt, sammenlignet med patienter med kronisk betændelse i bugspytkirtlen, andre pancreas tumorer og PNET (

P = 0,006

,

P = 0,018

, og

P = 0,004

henholdsvis.). Der var ingen signifikant forskel af plasma IGF-1R-niveauer mellem patienter med kræft i bugspytkirtlen og raske frivillige (

P = 0,095

). (Figur 6).

Plasma IGF-1R-niveauer blev detekteret ved ELISA. Niveauerne af plasma IGF-1R i bugspytkirtlen kræftpatienter var sammenlignelig med raske frivillige, men højere end hos patienter med kronisk pancreatitis, andre pancreas tumorer og PNET. Andre pancreas tumorer omfattede serøs cystadenoma, mucinous cystadenoma, solid pseudopapillary tumor og intra-ductal papillære mucinøs neoplasme. PNET, pancreas neuroendokrine tumorer.

Den diagnostiske værdi af plasma IGF-1R

Den diagnostiske værdi af plasma IGF-1R blev evalueret ved hjælp af ROC-kurve. Vi viste, at plasma IGF-1R vises en værdi for at skelne kræft i bugspytkirtlen af ​​kronisk pancreatitis og PNET (AUC = 0,713, 95% CI: 0,564-0,862,

P = 0,008

; AUC = 0,711, 95% CI: 0,581-0,840,

P = 0,009

henholdsvis). Når afskæringsværdi defineret på 0,257 ng /ml, følsomheden og specificiteten til at skelne kræft i bugspytkirtlen af ​​kronisk pancreatitis var 95,2% og 47,3%. Når afskæringsværdi defineret på 0,699 ng /ml, følsomheden og specificiteten til at skelne kræft i bugspytkirtlen fra PNET var 47,6% og 89,5%. Plasma IGF-1R kan også bruges i differentiere bugspytkirtelkræft fra andre pancreas tumorer (AUC = 0,634, 95% CI: 0.504-0.763,

P = 0,057

). Når afskæringsværdi defineret på 0.925 ng /ml, den sensitivitet og specificitet for at differentiere bugspytkirtelkræft fra pancreas godartede tumorer var 33,3% og 89,7%.

Sammenhængen mellem plasma IGF-1R niveauer og klinisk-patologiske parametre og overlevelse analyse

Patienterne blev delt i høje og lave udtryk grupper ved hjælp af 75

percentil af plasma IGF-1R-niveauer. Tumor steder og TNM stadie var forbundet med plasma IGF-1R-niveauer (

P = 0,013

,

P = 0,01

henholdsvis. Tabel 1). Den mediane overlevelse var 18 måneder, og 1-, 3-års overlevelsesrater var 64% og 23,1%, hhv. De median overlevelse i høje og lave udtryk grupper var 11 og 18 måneder. blev ikke observeret nogen signifikant forskel i den samlede overlevelse tid mellem høj og lav ekspression grupper (

P = 0,366

).

Diskussion

Nedsat miR-497 udtryk har været påvist i bryst, tyk- og livmoderhalskræft [7], [8], [9]. Der er imidlertid ingen rapport om MIR-497 ekspressionsniveauer i pancreas cancer væv. Opregulering af miR-497 kan undertrykke kræft celler spredning, fremme apoptose, fald migration og invasion kapacitet og øge kemosensitivitet [16], [17], [9]. Men roller og mekanismer miR-497 i bugspytkirtelkræft fortsat ukendt. I den aktuelle undersøgelse, viste vi miR-497 var signifikant nedreguleret i bugspytkirtelkræft væv. Opregulering af MIR-497 inhiberede celleproliferation, øget apoptose og fremmet følsomhed over for gemcitabin ved direkte at nedregulere IGF-1R-proteinekspression.

Vores undersøgelse identificerede rolle MIR-497 i reguleringen af ​​malignitet af pancreascancer. Resultaterne understøttes, at MIR-497 inhiberede kræftceller spredning, fremmet apoptose og øget kemosensitivitet, som rapporteret af litteraturen [9], [16], [17].

Så undersøgte vi mekanismerne i miR-497 i regulering af progressionen af ​​pancreascancer. Vi fandt IGF-1R var et direkte mål for MIR-497 ved en luciferase reporter assay, som også blev rapporteret i kolorektale cancere og livmoderhalskræft [8], [9]. Vi udførte også western blotting for yderligere bekræftelse. Vi viste, at opregulering af MIR-497 faldt IGF-1R-proteinniveauer uden ændring i mRNA-ekspression. Nedregulering af MIR-497 forøgede IGF-1R proteinniveauer. Derudover undersøgte vi ekspressionen af ​​IGF-1R-medieret nedstrøms molekylære. Vi fandt niveauet p-AKT faldt signifikant opregulering af MIR-497. Inhibering af MIR-497 forøgede ekspressionen af ​​p-AKT. Derfor vi spekuleret på, at miR-497 svækket malignitet af kræft i bugspytkirtlen ved delvis undertrykke IGF-1R /AKT-vejen.

IGF-1R /AKT-vejen er blevet identificeret til at inddrage i reguleringen af ​​flere biologiske processer af kræft [18], [19]. AKT kan aktivere BAD ved fosforylering på Ser136 [20] eller aktivere NF-KB via regulering af kB-kinase (IKK) [21], således resulterer i anti-apoptotiske virkninger. AKT vej involverer også i kemoresistens. AKT2 hæmning modvirker gemcitabin-induceret aktivering af AKT2 og NF-KB, og øger gemcitabin-induceret PUMA (p53-opreguleret modulator af apoptose) opregulering, hvilket resulterer i chemosensitization af pancreascancer med gemcitabin-[22]. I overensstemmelse med disse undersøgelser, vore data viste, at inhiberingen af ​​IGF-1R /AKT pathway delvis kunne forklare virkningerne af MIR-497 på bugspytkirtelkræftceller. Dog kan miR-497 også dæmpe malignitet af kræft ved at regulere andre mål, såsom TARBP2, DICER, BCL2, CCND1, CCNE1, Cdc25A, CCND3, CDK4. [23], [24], [25].

Øget IGF-1R udtryk er blevet fundet i mange kræftformer [26] og viser prognostiske værdier [27]. Høj udtryk for IGF-1R i humane PDAC væv er også blevet rapporteret [11] og associerede virksomheder med højere tumor kvalitet og dårlig overlevelse [12]. Er imidlertid ikke blevet påvist, plasma IGF-1R-niveauer i pancreas kræftpatienter. Vores undersøgelse viste, at plasma IGF-1R-niveauer i patienter med kræft i bugspytkirtlen steg betydeligt, sammenlignet med patienter med kronisk pancreatitis, andre pancreatiske tumorer og PNET. Men der var ingen signifikant forskel på plasma IGF-1R niveauer mellem pancreas kræftpatienter og raske frivillige, som til dels kan blive belyst ved at IGF-1R blev generelt udtrykt i normale væv, såsom lever, endometrium og neurale celler [28]. Værdien af ​​plasma IGF-1R ved diagnosen pancreascancer blev vurderet i den aktuelle undersøgelse. Der var en potentiel værdi til at skelne kræft i bugspytkirtlen af ​​kronisk pancreatitis, PNET og andre pancreas tumorer. Men den diagnostiske sensitivitet eller specificitet var ikke perfekt, blev detekteringer stor prøve nødvendig for yderligere at identificere den diagnostiske værdi af plasma IGF-1R.

TNM fase var associeret med plasma IGF-1R niveauer i vores undersøgelse. Patienter med fremskredne stadie tumorer havde høje niveauer af plasma IGF-1R. Plasma IGF-1R kunne være en ny biomarkør til føring TNM stadie af pancreascancer. Overraskende høj ekspression af plasma IGF-1R var ikke en negativ prognostisk faktor i nærværende undersøgelse.

Konklusion

MIR-497 var signifikant nedreguleret i bugspytkirtelkræft væv. Opregulering af MIR-497 undertrykte malignitet af bugspytkirtelkræft og re-sensibiliserede PDAC celler til gemcitabin ved direkte at nedregulere IGF-1R proteinekspression. Plasma IGF-1R niveauer i bugspytkirtlen kræftpatienter steget, og vises mulige værdier til at skelne bugspytkirtlen læsioner. IGF-1R kunne også være en ny plasma biomarkør for at lede TNM stadium af kræft i bugspytkirtlen.

Støtte Information

Figur S1.

Ekspressionsniveauet af MIR-497 efter transfektion af efterligninger eller inhibitor. MIR-497-ekspression blev påvist ved QRT-PCR. U6 blev serveret som en intern kontrol. (A) BxPC-3-celler transficeret med MIR-497 efterligner viste en stigning i MIR-497-ekspression. (B) Celler transficeret med MIR-497 inhibitor viste et fald i MIR-497-ekspression. Data blev vist som middelværdi ± SD. (*

P 0,05

)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0092847.s001

(TIF)

Figur S2. Salg Relative ekspressionsniveauer af spaltet caspase-3 og PARP. Data blev vist som middelværdi ± SD. (A) De relative ekspressionsniveauer af proteiner i AsPC-1-celler. (B) De relative ekspressionsniveauer af proteiner i BxPC-3-celler. (*

P 0,05

)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0092847.s002

(TIF)

Figur S3. Salg Relative ekspressionsniveauer af IGF-1R og p-AKT. Relative ekspressionsniveauer blev vist som middelværdi ± SD. (A) De relative niveauer af IGF-1R og p-AKT i AsPC-1 celler. (B) De relative niveauer af proteiner i BxPC-3-celler. (*

P 0,05

)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0092847.s003

(TIF)