PLoS ONE: Ultrasonic nanobubbles Carrying Anti-PSMA Nanobody: Byggeri og Anvendelse i prostatakræft-Målrettet Imaging

Abstrakt

For at lette prostatakræft imaging hjælp målrettede molekyler, vi konstrueret ultralyd nanobubbles kombineret med specifikke anti-PSMA ( prostataspecifikt membran-antigen) nanobodies, og evalueret deres

in vitro

bindende kapacitet og

in vivo

imaging effekt. De “målrettede” nanobubbles, som blev konstrueret via en biotin-streptavidin-system, havde en gennemsnitlig diameter på 487,60 ± 33,55 nm og udføres anti-PSMA nanobody som påvist ved immunofluorescens. Mikroskopi afslørede målrettet binding af nanobubbles

in vitro

til PSMA-positive celler. Derudover blev ultralydsscanning indikatorer for nanobubble imaging (herunder ankomsttid, peak tid, peak intensitet og forbedret varighed) evalueret for ultralydsscanning i tre slags dyr xenografter (LNCaP, c4-2 og MKN45), og viste, at disse fire indikatorer for målrettede nanobubbles udstillet signifikante forskelle fra tomme nanobubbles. Derfor er denne undersøgelse ikke kun præsenterer en ny tilgang til at målrette prostatakræft ultralydsundersøgelse, men giver også grundlaget og metoder til konstruktion af små mellemstore og høj effektive målrettede ultralyd nanobubbles

Henvisning:. Fan X, Wang L, guo Y, Tu Z, Li L, Tong H, et al. (2015) Ultrasonic nanobubbles Regnskabsmæssig Anti-PSMA Nanobody: Byggeri og Anvendelse i prostatakræft-Målrettet Imaging. PLoS ONE 10 (6): e0127419. doi: 10,1371 /journal.pone.0127419

Redaktør: Serge Muyldermans, Vrije Universiteit Brussel, Belgien

Modtaget: 5. november 2014 Accepteret: 14. april, 2015; Udgivet: 25 juni 2015

Copyright: © 2015 Fan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde er blevet støttet økonomisk af National Natural Science Foundation (tilskud nummer: 30.970.830), Chongqing Science Foundation (tilskud nummer: cstc2012jjB0072) og Youth Science Foundation of Jiangxi Department Undervisningsministeriet (tilskud nummer: GJJ12142).

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

specifik identifikation af prostatakræft er et klinisk. presserende opgave [1]. I denne henseende har udviklingen af ​​ultralyd molekylær billeddannelse tilvejebragt en ny vej til tidlig prostatacancer diagnose. Denne teknik involverer mærkning billeddannende forbindelser med specifikke antistoffer eller ligander til at generere målrettede ultralydskontrastmidler kan binde til specifikke væv eller læsioner. Efter intravenøs administration disse molekylære prober aggregerer specifikt i målvævene via blodcirkulationen, således at ultrasonografi-baserede specifik billeddannelse af patogene ændringer på molekylært eller celleniveau. [2]. Imidlertid mikron-skala ultralydskontrastmidler (mikrobobler) i øjeblikket anvendes i de fleste relevante billeddannende undersøgelser har diametre på 1-10 um [3,4]. Tumor neovaskulære strukturer er ofte mangelfulde, fordi tumor blodkar har ufuldstændige basalmembraner, mangler glatte muskelceller lag og udviser dårlig lymfe cirkulation; derfor disse fartøjer udviser forøget permeabilitet i forhold til normale blodkar, en effekt, der er blevet kaldt den forbedrede permeabilitet og fastholdelse virkning (EPR). Trods denne permeabilitet, den maksimale vaskulære porediameter i området fra ca. 380-780 nm, og teoretisk kun partikler 700 nm i diameter kan passere gennem tumoren neovaskularisering; derfor, regelmæssig ultralydskontrastmidler kan ofte ikke passere gennem vaskulaturen til forskning tumorceller og lette specifik tumor imaging [5,6]. Efter disse EPR resultater, har nogle grupper nyopførte nanobubbles og undersøgt deres gennemtrængelighed. De nanobubbles udarbejdet af Yin

et al

. havde en gennemsnitlig diameter på 436,8 ± 5,7 nm og vises passiv tumortargeting [7]. I vores indledende undersøgelser, har vi også udviklet målrettede nanobubbles med en gennemsnitlig diameter på 644,30 ± 55,85 nm, der gennemføres monoklonale antistoffer mod prostata-specifikt membran-antigen (PSMA), og undersøgte billeddannende potentiale i disse nanobubbles i prostatacancer-xenotransplantater i nøgne mus. Vores resultater viste, at disse målrettede nanobubbles kunne forøge de xenograft spidsbelastningen og intensitetsværdier sammenlignet med blanke nanobubbles og derfor bidrager til tumorspecifik målrettet imaging [8].

Alligevel monoklonale antistof-målrettede nanobubbles har to tydelige begrænsninger. Første, murine monoklonale antistoffer er immunogene i mennesker. For det andet, de store molekylvægte antistof-partikel-komplekser resulterer i lavt antal målrette komplekser nå de tilsigtede mål [9], og dermed kompromittere de billeddannende resultater. Derfor er identifikation af en lille størrelse antistof, som er praktisk, høj-effektivt og gennemtrængende er afgørende for tumor-målrettet molekylær billeddannelse. Opdagelsen af ​​nanobodies [10], forudsat en lovende strategi for at udvikle en ny type af ultralyd målrettet nanobubble fordi disse nanobodies er mindre i størrelse. Specifikt IgG2 og IgG3 (tung kæde-antistoffer) fra dyr i Camelidae familien naturligt mangler lette kæder og CH1-domænet; det er de mindste funktionelle aktuelt kendte antigene bindende fragmenter og er kendetegnet ved lav molekylvægt, praktisk udtryk, stabilitet og lav immunogenicitet

in vivo

. Derfor nanobodies er en lovende udsigter med hensyn til præcis diagnose og målrettede behandlinger [11-16]. meget få tumor-målrettede ultralyd nanobubbles kombineret med specifikke nanobodies blev imidlertid beskrevet. I det foreliggende arbejde, vi udviklede den lille størrelse og høj-effektive målrettet nanobubble formulering, som bar den anti-PSMA nanobody, at verificere den hypotese, at nanobody-belagte nanobubbles kan øge den diagnostiske værdi af ultralyd i prostatakræft.

Materialer og metoder

Celler og dyr

LNCaP, hvilket er den typiske humane androgen-afhængig prostatacancer celle, blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC). C4-2, som er en undertype af LNCaP-cellelinie og en human androgen-uafhængig prostatacancer-cellelinie, blev erhvervet fra ViroMed Laboratories på Johns Hopkins, USA. MKN45, et menneske mavekræft cellelinje som kontrol, blev opnået fra det kinesiske Academy of Medical Sciences Cancer Institute (Beijing, Kina). Fire- til 5 uger gamle BALB /c-nu nøgne mus (Experimental Animal Center, tredje Military Medical University) holdt i et specifikt patogenfrit miljø blev anvendt som beskrevet nedenfor. Alle dyreforsøg blev godkendt af Det Dyreetiske Komité The Third Military Medical University.

Western blotting i tre cellelinier

LNCaP, c4-2 og MKN45 celler blev dyrket til den logaritmiske fase, skyllet med phosphatbufret saltvand (PBS), anbragt på is, og suspenderet i 400 pi radioimmunpræcipitationsanalyse (RIPA) protein lyseringsbuffer. Derefter blev alle tumor cellelysater overført til et 1,5-ml rør og centrifugeret ved 15000 rpm og 4 ° C i 15 minutter. Den resulterende supernatant blev overført til et nyt 1,5 ml centrifugerør. En bicinchoninsyre (BCA) kit blev derefter anvendt til at bestemme proteinkoncentrationen. Derudover blev prøverne tilsat 5X natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) ladningsbuffer, blandet og kogt i 5 min til fuldt denaturere proteinerne. Tredive mikrogram totalt protein adskilles via SDS-PAGE og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran via halvtør blotting-metoden. Membranen blev blokeret med en 5% skummetmælk-buffer ved stuetemperatur i 2 timer og blev derpå probet successivt med en 1: 400 fortynding (2,5 ug /ml) af et anti-hPSMA monoklonalt antistof ved 4 ° C natten over og 1: 2000 fortynding af peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært antistof ved stuetemperatur i 2 timer; membranen blev vasket tre gange med PBST (PBS med 0,1% Tween-20) efter hvert antistof inkubation.

Generering af specifikke og biotinyleret nanobody

Den ekstracellulære region af PSMA blev først udtrykt i eukaryote human embryonisk nyre (HEK) -293-celler, hvorefter det rekombinante protein blev anvendt som coatingmaterialet til at screene et tidligere konstaterede naturlig nanobody bibliotek betegnet NA-PDL. Tilsvarende opnåedes nanobody fager stand til specifikt at binde til PSMA på det molekylære og cellulære niveauer [17]. Disse fager blev efterfølgende sekventeret, og de følgende primere blev designet i henhold til sekventeringsresultaterne: forward primer, CGCGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTG (indeholdende en

BamHI

site) og revers primer, CCCAAGCTTTTATTGTGGTTTTGGTGTCTTGGGTT (indeholdende en

HindⅢ

websted ). En polymerasekædereaktion (PCR) blev derefter udført under anvendelse af den positive fag-klon som template til amplifikation af target-genet; reaktionsproduktet blev efterfølgende klonet ind i

BamHI

og

Hindlll Salg stederne i pET28a-ekspressionsvektor (Novagen /EMD Millipore, Billerica, MA, USA), som indeholder en seks-histidinmærke. Den rekombinante vektor blev omdannet til

E

.

coli

DH5a stamme. De resulterende positive kloner blev sekventeret for at identificere dem med den korrekte sekvens; de korrekte kloner blev omdannet til

E

.

coli

Rosseta ekspression stamme (DE3; Novagen /EMD Millipore) til opnåelse af en højt ekspressionsniveau. Ni-agarose (Qiagen, Venlo, Holland) blev efterfølgende anvendt til at oprense histidin-mærket nanobody. Dernæst vi mærket den nanobody med opløsningen af ​​biotin. I detaljer blev to milligram sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce /Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) fuldt solubiliseret i 360 pi sterilt ddH

2O. Denne opløsning blev inkuberet med nanobody ved 4 ° C i 72 timer, efterfulgt af dialyse ved 4 ° C natten over. UV-spektroskopi blev anvendt til at bestemme koncentrationen antistof. Specifikt den teoretiske ekstinktionskoefficient fra sekvensen af ​​nanobody var 21555 M

-1 · cm

-1, og absorbansen ved 280 nm blev målt for at beregne koncentrationen antistof ifølge formlen “Absorbans = ε ( ekstinktionskoefficient, M

-1 · cm

-1) X vejlængde (cm) X-koncentration (M) “. En biotin kvantificering kit (Pierce /Thermo Scientific) blev anvendt til beregning af biotin koncentrationerne i prøverne og generere biotin /antistofkonjugering forholdet

Validering af nanobody affinitet via enzymkoblet immunosorbentassay (ELISA)

for at opnå affinitet biotinylerede nanobody blev en standard kompetitiv ELISA anvendes. Hver brønd af en mikrotiterplade blev coatet med 1 mM rekombinant PSMA-antigen, blokeret med 3% bovint serumalbumin (BSA) -PBST ved stuetemperatur i 2 timer og derefter skyllet tre gange med PBST. Derefter blev 1 nM biotinyleret nanobody inkuberet med stigende koncentrationer af antigen ved koncentrationer i området fra 0,1 nM til 100 pM i parallelle eppendorfrør. Efter 30 minutters inkubation blev 90 pi af reaktionsblandingerne anvendt til brøndene i det antigen-coatede mikrotiterplade. Efter 10 minutters inkubation blev blandingerne kasseret, og brøndene blev skyllet med PBST. Dernæst 100 pi HRP-streptavidin konjugeret-biotin (Kangwei Century, Beijing, Kina) ved en 1: blev 2000 fortynding tilsat til hver brønd, efterfulgt af inkubation ved 37 ° C i 1 time. Hver brønd blev derefter skyllet 5 gange med PBST før tilsætning af 100 pl /brønd af en 3,3 ‘, 5,5’-tetramethylbenzidin (TMB) arbejdsopløsning (Beyotime, Shanghai, Kina) og inkubere pladen ved stuetemperatur i 15 min . Reaktionerne blev afsluttet ved tilsætning af 50 pi af en 2 M svovlsyre til hver brønd. Absorbansen ved 450 nm blev efterfølgende bestemt for hver brønd. Derfor bør er blevet observeret den højeste optiske densitet (OD)

450 nm ved lave koncentrationer af antigen. Koncentrationen af ​​antigen, hvor halvdelen af ​​den maksimale ELISA signal svarer til dissociationskonstanten K

D.

Forberedelse og validering af målrettede nanobubbles

Blandinger indeholdende specifikke forhold mellem dipalmitoylphosphatidylglycerol cholin (DPPC; Genzyme Pharmaceuticals, Bromma, Sverige), biotinyleret distearoylphosphatidylethanolamin (Bio-DSPE; Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, AL, USA) og diphenylphosphorylazid (DPPA; Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Tyskland) blev vejet og frysetørret ved hjælp af en frysetørrer (Shanghai Pudong Freeze Drying Equipment Co, Shanghai, Kina). Portioner af disse blandinger blev anbragt i hætteglas; octafluoropropan (C

3F

8) gas blev langsomt indsprøjtet at erstatte luften overlays i hætteglas. Før anvendelse en blandet opløsning af 1 del glycerol: blev 9 dele PBS tilsat til hætteglasset efterfulgt af opvarmning til 37 ° C for at lette solubilisering. Præparaterne blev horisontalt blandet i en omvendt måde ved hjælp af en ST-serie amalgamator (AT M Biomaterialer Co, LTD, Beijing, Kina) med følgende specifikke arbejdsforhold parametre: vibrationsfrekvens, ≥4500 /min; vibrationsamplitude, 15 ± 1 mm og vibrationer varighed, 60 s [8]. Disse præparater blev derefter lov at hvile ved 4 ° C for at lette faseadskillelse. Den nedre fase mælkeagtig suspension blev centrifugeret ved 300 rpm i 3 min for at adskille de biotinylerede nanobubbles nederst fra mikroboblerne i toppen. Dernæst 3 ug avidin blev tilsat pr 10

7 nanobubbles, efterfulgt af inkubation ved 4 ° C i 1 time. Præparaterne fik lov til at hvile for at lette faseseparation; det øverste lag blev efterfølgende opsamlet og centrifugeret ved 300 rpm i 3 min. Prøven blev skyllet tre gange for at fjerne overskydende avidin. Dernæst blev 1 pi biotinyleret nanobody tilsat pr 10

7 nanobubbles, efterfulgt af inkubation, centrifugering og skylning for at fjerne den overskydende biotinyleret nanobody. De resulterende nanobubbles blev udpeget de målrettede bemyndigede organer, mens nanobubbles uden antistof tilskud blev udpeget de Blanke bemyndigede organer. De partikler af de 2 produkter blev analyseret på en Malvern Zetasizer nano ZS90 analysator (Malvern Instruments Ltd., Malvern, UK), og en tællekammer blev anvendt til at bestemme koncentrationerne af de 2 produkter. deres

in vitro

imaging virkninger ved de forskellige koncentrationer blev undersøgt med en agarose model på betingelse af en mekanisme indeks på 0,12 og en gevinst på 60%.

For at undersøge, om denne metode kunne være anvendes til at fastgøre biotinyleret nanobody til nanobubbles blev Blanke eller Målrettede bemyndigede organer inkuberet med et muse-anti-His-antistof i 1 time, efterfulgt af centrifugering, skylning og inkubering i mørke med en fluoresceinisothiocyanat (FITC) -konjugeret gede-anti-muse-antistof i 3 timer ved 4 ° C. Prøverne blev centrifugeret og skyllet for at fjerne ubundet sekundært antistof. Prøverne blev derefter observeret under et fluorescensmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) for at evaluere den fluorescerende binding.

nanobubbles og

in vitro

cellebindingsassayet

LNCaP , c4-2 og MKN45 celler dyrket til den logaritmiske fase blev centrifugeret og podes på dækglas i brøndene i en 24-brønds plade med en tæthed på 1,5 × 10

4 celler /brønd. Cellerne blev dyrket natten over, fikseret med 4% paraformaldehyd og skyllet tre gange med PBS. To grupper af dækglas fremstilledes pr celletype; 1 gruppe blev suppleret med 30 pi Målrettet NBS (1,0 x10

8 /ml) og den anden med Blank NBS hvorefter blandingerne blev inkuberet ved 4 ° C i 3 timer. Efterfølgende blev dækglassene skyllet tre gange med PBS, placeret med forsiden nedad på dias og observeret under et lysmikroskop (Olympus) undersøge nanobubbles. Adhæsionen procentdel, defineres som den procentdel af celler mærket med ≥ 4 målrettede nanobubbles i en given tilfældig område, blev beregnet til at indikere binding. Dette forsøg blev gentaget 4 gange.

Nanobubble billeddannelse i forskellige xenotransplantater

Logaritmisk-fasede LNCaP-prostatacancerceller og c4-2 celler blev anvendt til at fremstille cellesuspensioner ved en tæthed på 5 x 10

7 celler /ml; MKN45 gastrisk kræftceller i logaritmisk vækstfase blev anvendt til fremstilling cellesuspensioner på 1 × 10

7 celler /ml. To hundrede mikroliter af hver cellesuspension blev efterfølgende blandet med 200 pi BD Matrigel (BD Biosciences, USA); de resulterende blandinger blev subkutant inokuleret i 4-5 uger gammel mand BALB /c-nu nøgne mus med en legemsvægt på 18-20 g. Fem dyr blev anvendt til hver xenograft tumortype. De xenotransplantater blev overvåget dagligt med en skydelære, indtil tumorerne nåede en omtrentlig diameter på 1 cm.

Tumor-bærende nøgne mus blev bedøvet via intraperitonealt indgivet 1% natriumpentobarbital. Til billeddannelse blev overfladerne af både proben og tumor dækket med et 5 mm tykt koblingsmiddel. En 50-mm L12-5 bredbånd lineær ultralydsonde tilsluttet et iU22 ultralydssystemet (Philips, Amsterdam, Holland) blev anvendt til at udføre B-mode ultralydsscanning af xenotransplantater. Når tværsnittet af en xenograft var fuldt afsløret, blev proben immobiliseret for at muliggøre opsætning af ultrasonografi mode (mekanisk indeks, 0,12; gain, 90%). Ultralyd blev indledt, da omdrejningspunktet center blev placeret i tumoren centrum. Hvert forsøgsdyr modtog 200 pi Blank eller målrettet NBS (3 × 10

7 partikler) via haleveneinjektion, hvorefter rørledningen blev skyllet med 100 pi saltvand. Dynamiske billeder blev indsamlet indtil tumoren område var helt fri NBS. Derudover blev 200 pL af en ækvivalent mængde af en anden type nanobubbles og 100 pi saltvand administreres på en måde svarende til lette ultrasonografi under identiske betingelser; de billeddannende data indsamlet fra de samme nøgne mus blev analyseret under anvendelse Qlab8.1 software (Philips) for at sammenligne de 4 billeddannende parametre (ankomsttid, spidsbelastning, peak intensitet og forbedret varighed) i xenograft området med de 2 kontrastmidler. Ankomsttiden blev defineret som intervallet fra indsprøjtning færdiggørelse og det første tidspunkt, hvor 10% topintensiteten var opnået. Forbedret varighed blev defineret som intervallet mellem de 2 tidspunkter, hvor 10% topintensiteten blev opnået. Peak tid blev defineret som intervallet mellem injektion tid og tidspunktet for maksimal intensitet [18].

statistiske analyser

Statistisk Package for Social Science (SPSS) 16,0 software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) blev anvendt til at udføre de statistiske analyser. Alle de kvantitative data blev udtrykt som middel ± standardafvigelser. Den Målrettet NB og Blank NB ultralyd indikatordata i

in vitro

in vivo

imagings blev opnået og analyseret ved hjælp af en parret prøve T-test. De ultralyd indikatorer for nanobubbles at målrettet de 3 xenograft typer blev analyseret ved hjælp af en variansanalyse (ANOVA). En P-værdi 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Histogrammer og kurven med ikke-lineær regression blev plottet ved hjælp af GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Resultater

PSMA udtryk i forskellige cellelinjer og forberedelse af PSMA-specifikke nanobody

Western blotting blev brugt til at undersøge PSMA udtryk i LNCaP, c4-2 og MKN45 celler. Resultaterne viste, at blandt disse cellelinjer, LNCaP-celler udtrykte det højeste niveau af PSMA, efterfulgt af c4-2 celler; MKN45 mavekræft celler udviste ingen tilsyneladende PSMA udtryk (figur 1).

LNCaP celler udtrykte et højere niveau af PSMA end c4-2 celler, mens MKN45 celler udviste ingen udtryk.

den fag-klon vælges via prokaryot panorering blev brugt til rekombinant ekspression og lettet købet af His-mærket PSMA-specifikke nanobody (molekylvægt, 18 kD). Efter biotinylering af nanobody, blev UV spektrometri udført for at afsløre, at koncentrationen af ​​antistoffet var 0,59 mg /ml, og biotin /nanobody konjugation forholdet var ca. 3,6: 1 ifølge en biotin kvantificering kit. Baseret på princippet om kompetitiv binding, dissociationskonstanten er lig med koncentrationen ved halvmaksimal værdi i ELISA. Derfor K

D af biotinyleret nanobody mod rekombinant PSMA var 519 nM, mens den ikke-lineær regression havde en god tilpasning med R

2 = 0,978 (Fig 2).

Kurven med ikke-lineær regression om koncentrationen af ​​recombint PSMA spænder fra 0,1 nM til 100 pM er obbtained.

Målrettet NB Karakterisering ved fluorescens mikroskopi

de nanobubbles og biotinyleret nanobody blev konjugeret med streptavidin Biotin. Et lysmikroskop og Malvern Zetasizer nano ZS90 analysator blev anvendt til at undersøge morfologier og diametre for de målrettede bemyndigede organer og Blank bemyndigede organer og afslørede, at begge udviste regelmæssige sfæriske former, og det målrettede NB præparat havde en gennemsnitlig diameter på 487,60 ± 33,55 nm, hvorimod blank NB præparat havde en gennemsnitlig diameter på 445,30 ± 32,96 nm; deres

in vitro

imaging effekter, nemlig ultralyd signaler, havde ingen forskelle på den samme koncentration (P = 0,06, figur 3). Immunofluorescens senere afsløret, at de målrettede bemyndigede organer udsendte grøn fluorescens signaler under mikroskopet (figur 4). I modsætning hertil Blank nanobubbles, som ikke blev mærket med biotinyleret nanobody, viste ikke en tilsyneladende fluorescenssignal, hvilket indikerer, at nanobubbles specifikt bundet den nanobody via biotin-avidin interaktioner.

A Malvern Zetasizer analysator blev anvendt til undersøge partikelstørrelser. Datoer NBS (uden biotinyleret nanobody) havde en gennemsnitlig diameter på 445,30 ± 32,96 nm (A), hvorimod Målrettet NBS (med biotinyleret nanobody) havde en gennemsnitlig diameter på 487,6 ± 33,55 nm (B). Og der er ingen forskel i deres

in vitro

billedbehandling ved de samme koncentrationer (C).

Mikroskopisk observation af målrettet NBS (A og B). De ringlignende strukturer med tykke membraner er NBS (B). Resultaterne viste, at målrettet bemyndigede organer specifikt kunne indarbejde nanobody via biotin-avidin interaktioner.

Binding af målrettede nanobubbles til celler

Cell-nanobubble binding blev undersøgt via mikroskopi (figur 5). De målrettede nanobubbles klæbet bedst til LNCaP-celler, som hver ansat i gennemsnit 7,27 ± 1,70 nanobubbles til opnåelse af en vedhæftning procentdel af 98,00 ± 2,31%, efterfulgt af c4-2 celler, som hver ansat 5,67 ± 1,61 nanobubbles til opnåelse af et adhæsion procentdel af 92,00 ± 8,64%. I modsætning hertil blev der ikke signifikant binding observeret mellem de nanobubbles og MKN45 celler, med en bindende frekvens på 0,72 ± 0,87 nanobubbles per celle. Endelig ingen tilsyneladende binding blev identificeret mellem de Blank bemyndigede organer og hver af de 3 typer af celler, som det fremgår af de tilsvarende bindende antal 0,74 ± 0,92, 0,65 ± 0,95 og 0,68 ± 0,94 per celle, hhv.

under et lysmikroskop, både LNCaP-celler og c4-2 celler synligt bundet til målrettet NBS (a og B), hvorimod MKN45 celler ikke bandt til målrettet NBS (C). Ingen af ​​de 3 typer af celler vises fremtrædende binding til Blanke NBS (D, E og F). Scale, 5 um.

Ultralyd xenograft imaging

Qlab8.1 software blev brugt til at analysere og sammenligne de billeddiagnostiske indikatorer (ankomsttid, peak tid, peak intensitet og forbedret varighed) af de målrettede bemyndigede organer og Blank bemyndigede organer i de 3 xenograft grupper (fig 6 og tabel 1). I prostatacancer-xenotransplantater (LNCaP og c4-2), resultaterne viste, at de maksimale intensitetsværdier (P-værdier, 0,003 og 0,002, henholdsvis) og et forstærket varigheder (P-værdier, 0,001 og 0,004, henholdsvis) af de målrettede NBS, blev signifikant højere og længere, end hos de Blanke bemyndigede organer. Men ankomsttider og spidsbelastningsperioder var ikke til at skelne mellem de 2 typer nanobubbles. I kontrolgruppen MKN45 mavekræft xenograft gruppe, målrettet bemyndigede organer og Blank bemyndigede organer udstillet ingen klare forskelle med hensyn til de 4 indikatorer. En sammenligning af de 3 typer xenografter med hensyn til de målrettede nanobubble imaging egenskaber afslørede, at c4-2 xenografter udstillet markant forskellige peak intensitet værdier, forbedrede varigheder, ankomsttider og spidsbelastningsperioder sammenlignede MKN45 xenografter, med respektive P-værdier på 0,024, 0,007, 0,000 og 0,050. Endvidere er de LNCaP xenotransplantater viste også signifikant forskellige ankomsttider og spidsværdier sammenlignet med dem af MKN45 xenotransplantater (p-værdier på 0,000 for begge), selv om de resterende 2 indikatorerne var ikke signifikant forskellige. Derfor bruger ultralydsscanning billeddannelse med målrettet bemyndigede organer, både androgenafhængige LNCaP prostatacancerceller og androgen-uafhængige c4-2 celler manifesteret større spidsværdier og senere ankomsttider end kontrol- mavekræft implanteret. Endvidere, når de LNCaP og c4-2 xenografter blev sammenlignet, og ankomsttidspunktet (P = 0,026), peak tid (P = 0,005) og spidsværdi (P = 0,008) afveg væsentligt mens den forbedrede varighed ikke var signifikant forskellige (P = 0,261). Men for at de små forskelle (kun mindre end et sekund) i ankomst igen og toppe mellem to tumorer eller to slags kontrastmidler er ikke let, der skal overholdes, så den maksimale værdi og billedbehandling varighed bør være fokus i de fleste bekymring .

Paneler B, E og G viser de klassiske tværsnit af 3 typer xenografter under B-mode ultralydsundersøgelse. Paneler A, D og H viser bindingen af ​​Blank bemyndigede organer til xenotransplantater på toppen intensitet. Paneler C, F og I viser bindingen af ​​målrettede bemyndigede organer til xenotransplantater på toppen intensitet. De ultralydsundersøgelser billeder i både LNCaP og c4-2 xenografter viste, at den billeddannende intensiteten var tilsyneladende højere end den billeddannende intensitet opnås med de Blanke bemyndigede organer på toppen nanobubble niveau. I de MKN45 xenotransplantater, de billeddannende resultaterne af de målrettede bemyndigede organer og Blanke bemyndigede organer var sammenlignelige på toppen nanobubble niveau. Af alle, blå områder repræsenterer exnografts, mens røde og gule områder henholdsvis repræsenterer de forskellige billeddiagnostiske områder i LNCaP og c4-2 exnografts.

Diskussion

I øjeblikket prostata kræft er fælles og alvorligt kompromitterer sundhed ældre mænd, hvilket ofte fører til døden [19,20]. Selvom transrektal ultrasonografi er blevet en rutinemæssig undersøgelse værktøj, der spiller en vigtig rolle i sygdom biopsi, overvågning og behandling, har kliniske undersøgelser vist, at denne procedure er begrænset af utilstrækkelig følsomhed og specificitet [21-23]. Den nye inden for molekylær billeddannelse med ultralyd integrerer ultralydsscanning, molekylærbiologi og andre discipliner og dermed introducerer en ny vej, som at diagnosticere og behandle tumorer; det giver også mulighed for specifik prostatacancer billeddannelse på molekylært niveau og tilsvarende tidlige diagnoser [24]. I øjeblikket har den konstruktion og design af prostata-cancer-målrettede mikrobobler meste fokuseret på target molekyler impliceret i angiogenese, herunder målrettede mikrobobler, der bærer vaskulær endotel vækstfaktor receptor type 2 (VEGFR2) antistof. Men denne konstruktion har 2 tilsyneladende ulemper: i) de meste micron skala kontrastmidler har dårlig permeabilitet og kan ikke rejse på tværs af tumor blodkarrene til at indtaste de interstitielle rum og dermed målrettet bobler kan ikke direkte klæbe til prostata cancer celler; ii) denne metode har en lav specificitet, der fører til en manglende evne til at gennemføre specifikke prostatacancer væv imaging [25]. Den EPR indsats af tumorer gør det teoretisk muligt at bruge nanobubbles i molekylær billeddannelse af tumor ekstravaskulære matrix og tumor parenkymceller. Tidligere ved hjælp af lys og elektronmikroskopi, viste vi, at nanobubbles med en gennemsnitlig diameter på 435,20 ± 60,53 nm kunne passere gennem de vaskulære endotel huller i xenografter, hvilket giver en eksperimentel grundlag for at opnå målrettet billeddannelse af tumor ekstravaskulære strukturer [26]. Imidlertid bliver denne metode tager også fuld fordel af nogle af de attributter af nanobubbles, såsom det relativt store overfladeareal, stærk friktion kapacitet og langtidsholdbare billeddannelse

in vivo

.

PSMA er et prostata cancer biomarkør med en højere specificitet og følsomhed end andre lignende molekyler. PSMA er særlig højt udtrykt i hormon-refraktær prostatacancer og prostatakræft metastaser [27]. Derudover den ekstracellulære region af PSMA, som omfatter 707 aminosyrer, kan rumme flere antigene epitoper. Derfor har PSMA blevet et forskningsfokus i forhold til immun-målrettede tumor terapier og molekylær tumor imaging [28,29]. Sanna

et al

. konjugeret urinstof-baserede PSMA inhibitor DCL til mikroboblen kuvert komponent poly (mælke-co-glycolsyre-polyethylenglycol (PLGA-PEG), hvorved der genereres et målrettet ultralydkontrastmidlet skal anvendes til prostatacancer cellebindende evalueringer

i vitro

[30]. i vores tidligere undersøgelse, den vedtagne monoklonale antistof var immunogen, som sammen med de store molekylvægte af antistoffet-paticle komplekser, førte til dårlig vævspenetration. Følgelig efter venøs administration, koncentrationen i det pågældende område var lav. Dette problem alvorligt begrænset den større kliniske anvendelse af mikrobobler til målrettede diagnostiske og billeddannende modaliteter. Alternativt specifikke små molekyler peptider anvendes ofte i molekylær billeddannelse undersøgelser. Selv om disse forbindelser let syntetiseres og har lave molekylvægte høje niveauer af vævsinfiltration og lav immunogenicitet, udviser de også problemer såsom kort halveringstid (tilbøjelighed til hydrolyse og renal clearance) og flygtige affiniteter, som i væsentlig grad skader stabiliteten af ​​korte peptid-bærende målrettede nanobubbles. I modsætning hertil nanobodies er meget stabile og udviser høj antigen affiniteter. Desuden har de meget lav immunogenicitet, som det fremgår af dyreeksperimentelle resultater, hvor ingen humorale eller cellulære immunresponser blev påvist efter gentagen administration [31]. Derfor har de forskellige egenskaber af nanobodies leveres overbevisende beviser vedrørende muligheden for at målrette og koncentrere nanobubbles inden målvæv

in vivo

. Selvom nanobodies angiveligt er blevet anvendt i molekylær billeddannelse undersøgelser, herunder nogle molekylære medicin applikationer nukleare [32-34], anvendelsen af ​​denne teknologi i forbindelse med ultralyd har været begrænset til ultralyd mikrobobler [35]; til vores viden, har kun få undersøgelser vedrørende nanobody-mærkede nanobubbles blevet rapporteret i dette område.

Derfor har vi brugt en biotin-avidin system til at integrere fordelene ved nanobubbles og nanobody ved at generere nanobubbles der nærede PSMA nanobody.