PLoS ONE: Fas Signaling Fremmer Gastric Cancer Metastase gennem STAT3-Dependent opregulering af Fascin

Abstrakt

Baggrund

Fas signalering-aktiverede signal transducere og aktivatorer af transkription 3 (STAT3) er påkrævet for Fascin opregulering. Som en actin-bundling protein, kan Fascin mediere gastrisk cancer (GC) cellemigration.

Metoder

mavekræft AGS celler blev behandlet med anti-Fas (5 ug /ml) i 2 timer med henblik på at stimulere aktivering af Fas-signalering.

in vitro

migration af Fas signalering-aktiverede AGS celler blev vurderet ved hjælp af Transwell kamre. Niveauerne af Fascin og phosphoryleret STAT3 blev detekteret ved Western blot analyser. Nøgne mus blev injiceret intravenøst ​​med AGS celler behandlet med anti-Fas eller behandlet med STAT3 inhibitor uden anti-Fas; tumor lungemetastaser blev målt. Fascin proteinekspression i tumorvæv blev påvist ved immunhistokemi. De Fas og Fascin mRNA-niveauer i tumorvæv fra patienter med GC blev målt ved real-time PCR og deres korrelation blev analyseret.

Resultater

Aktiveringen af ​​Fas signalering fremmet celle migration og resulterede i STAT3-afhængig Fascin opregulering i AGS celler. STAT3 forbedret Fascin niveauer

in vivo

. Fascin var formidler af Fas-signalering-induceret AGS cellemigration

in vitro

in vivo

. Desuden var der en positiv korrelation mellem Fas og Fascin mRNA-niveauer i tumorvæv fra GC patienter.

Konklusioner

Fas signalering fremmer GC metastaser gennem STAT3 /Fascin vej, som kan give en ny mål for GC terapi

Henvisning:. Yang Y, Zhao Q, Cai Z, Cheng G, Chen M, Wang J, et al. (2015) Fas Signaling Fremmer Gastric Cancer Metastase gennem STAT3-Dependent opregulering af Fascin. PLoS ONE 10 (5): e0125132. doi: 10,1371 /journal.pone.0125132

Academic Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: Januar 6, 2015; Accepteret: 11. marts 2015; Udgivet: 18. maj 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China nr 81200014 til JLW (https://www.nsfc.gov.cn/); Natural Science Foundation i Zhejiang-provinsen No. LY14H160011 til YsY; Nej LY12C08002 at ZJC og nr LY12H13003 til MC (https://www.zjnsf.gov.cn/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er den fjerde mest almindelige kræftform og den anden hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan. Som de fleste kræftformer, metastase er den hyppigste årsag til svigt af klinisk terapi af GC. Diagnosticeret på et tidligt tidspunkt uden metastase, kan GC udryddes ved operation. Når metastase sker, prognosen for GC er betydeligt værre. Hos patienter med omfattende metastase, resultatet af kirurgi kombineret med kemoterapi og immunterapi er langt fra optimal, med en samlet 5-års overlevelse er kun 24% [1,2]. Derfor er der et presserende behov for en bedre forståelse af mekanismen for GC metastase for at udvikle en bedre terapeutisk strategi.

Fas-signalvejen er en af ​​de klassiske mekanismer til at inducere apoptose [3]. Efter ligering med dens naturlige ligand, FasL, Fas-receptoren danner død-fremkaldende signaler kompleks, forårsager aktivering af caspase-8, som igen aktiverer downstream caspaser, hvilket resulterer i apoptose [4]. Det er blevet rapporteret, at Fas-medieret celledrab er ansvarlig for den anti-cancer funktion af Fas signalvej i prostatacancer [5]. Men i de fleste tumorer, i stedet for at inducere apoptose, Fas signaleringsaktivering fremmer tumorprogression [6,7]. Tumorceller ofte svare Fas stimulering med forøget proliferation [8,9]. Flere undersøgelser har også vist, at Fas-signalering kan fremme tumorcellemigration og invasion [10-12]. I en nylig undersøgelse, har høj Fas ekspression i GC-celler blevet påvist at korrelere med forekomsten af ​​metastaser til regionale lymfeknuder [13], hvilket antyder, at Fas-signalering fremmer metastase af mavekræft.

Fascin, en actin -bundling protein, er blevet identificeret som en central molekyle i tumormetastaser [14]. Fascin spiller en vigtig rolle i tumorcellemigration og ekspressionen af ​​Fascin er forøget i flere typer af cancere, herunder GC [15,16]. Fascin er en direkte STAT3 målgen som respons på IL-6 i både mus og humane brystcancerceller [17]. Fas-signalering er blevet rapporteret at være involveret i aktiveringen af ​​STAT3 [18-20]. Derfor er vi spekulere, at Fas signalering fremmer GC celle migration og efterfølgende tumor metastase gennem STAT3-afhængige opregulering af Fascin.

Den foreliggende undersøgelse er designet til at demonstrere inddragelse af Fas i reguleringen af ​​Fascin udtryk gennem STAT3 aktivering i AGS celler. Vi har forsøgt at knytte den forbedrede Fascin niveau med celle motilitet og metastase af AGS celler

in vivo

. Vi analyserede også sammenhængen mellem Fas og Fascin mRNA-niveauer i tumorvæv fra patienter med GC. Man håbede, at vores resultater ville afsløre en ny mekanisme til GC metastase, som grundlag for den fremtidige udvikling af Fas-baserede terapeutiske strategi for avanceret GC.

Materialer og metoder

Menneskelig vævsprøver

Menneskelig GC vævsprøver blev indsamlet fra 23 patienter (14 med metastaser og 9 uden metastaser) gennemgår operation før kemoterapi i Zhejiang Cancer Hospital (Hangzhou, Kina) mellem 2012 og 2014. Kliniske karakteristika af patienter med GC er opsummeret i tabel 1. undersøgelsen overholdt reglerne i Ministeriet for Sundhed Kina og World Health Organization Research Ethics bedømmelsesudvalg internationale retningslinjer for forskning med mennesket som forsøgsperson og Helsinki-erklæringen om etiske principper for medicinsk forskning med mennesker. Undersøgelsen Protokollen blev revideret og godkendt af Institutional Review Board of Zhejiang Cancer Hospital. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver af patienterne før studere påbegyndelse.

Reagenser

Mouse anti-human Fas (2R2) monoklonalt antistof blev købt fra eBioscience (San Diego, Californien , USA). Muse-anti-humant Fas (CH11) monoklonalt antistof og STAT3 inhibitor S3I-201 blev indkøbt fra Merck Millipore (Billerica, MA, USA). Kanin-anti-humant STAT3 (79D7) og anti-humant phosphoryleret STAT3 (D3A7) monoklonale antistoffer blev erhvervet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Den muse-anti-humant Fascin (D-10) monoklonalt antistof, humant Fascin siRNA, STAT3 siRNA, negativ kontrol siRNA (NC siRNA), og STAT3 inhibitor, Stattic, blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Den CCK8 proliferation kit blev købt fra Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan). Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Transwell kamre (8 um porestørrelse) blev indkøbt fra Costar (Cambridge, MA, USA).

Dyr

Seks uger gamle athymiske nøgne mus blev opnået fra SIPPR-BK Experimental Animal Co. (Shanghai, Kina). Musene blev huset i en patogenfri facilitet. De eksperimentelle protokoller blev revideret og godkendt af Animal Care og brug Udvalg Zhejiang Cancer Hospital.

Celler og cellekultur

De humane GC-cellelinier AGS og MNK-45 blev opnået fra den amerikanske Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) og opretholdt i 1640 dyrkningsmedium indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med 5% CO

2.

Western blot-analyse

i alt 20 ug rå proteiner ekstraheret fra cellelysater blev adskilt ved 10% natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese og overført til polyvinylidendifluorid-membraner (Millipore, Billerica, MA). Membranerne blev blokeret med 5% BSA i Tris-bufret saltvand plus 0,05% Tween-20 og derefter inkuberet med tilsvarende primære antistoffer ved 4 ° C natten over. Efter vask med Tris-pufret saltvand plus 0,05% Tween-20 blev membranerne inkuberet med tilsvarende HRP-konjugerede sekundære antistoffer. Proteiner blev visualiseret under anvendelse SuperSignal West Femto Maximum (Thermo, IL, USA).

Påvisning af celleapoptose

AGS celler (2 x 10

5 /ml) blev behandlet med 1 eller 5 pg /ml af anti-Fas monoklonalt antistof (anti-Fas) eller isotype antistof (ISO) i 24 timer blev de apoptotiske celler farvet med Annexin V-FITC og propidiumiodid i 5 minutter ved 4 ° C i mørke og derefter analyseret ved flowcytometri med en FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Kræft cellemigrationsassay

in vitro

AGS celler (1 x 10

6 /ml) blev behandlet med 5 pg /ml af anti-Fas eller ISO i 2 timer ved 37 ° C. Derefter 2 × 10

5 AGS tumorceller blev overført til 100 pi serumfrit medium og podet på den øverste kammer i Transwell kamre (8 um porestørrelse). Den nederste kammer blev fyldt med 800 pi 1640 dyrkningsmedium indeholdende 20% FBS. Efter en 48-timers inkubation ved 37 ° C blev cellerne fikseret med methanol i 20 minutter og vasket med PBS tre gange, 20 minutter hver. De fikserede celler blev farvet med 10 mg /ml DAPI i 30 minutter og vasket med PBS. De farvede celler blev undersøgt under et fluorescens mikroskop. At bestemme virkningerne af STAT3 på cellemigrering, blev 10 pM af Stattic tilsat til dyrkningsmediet. For at bestemme den rolle, Fascin i cellemigrering, før anti-Fas-stimulering, blev i alt 40 nM Fascin siRNA-duplexer transficeret ind AGS celler (2 x 10

5 /brønd) under anvendelse af 3 pi INTERFERin siRNA-transfektionsreagens ( POLYPLUS, NY, CA, USA) på en plade med 24 brønde. Effektiviteten af ​​Fascin transient silencing blev bekræftet ved Western blotting.

Celleproliferationsassay

AGS-celler blev behandlet med 5 ug /ml anti-Fas eller ISO i 24, 48 eller 72 timer, og 20 pi CCK8 blev tilsat til hver brønd, og cellerne blev inkuberet i yderligere 4 timer. Absorbansen af ​​hver brønd blev aflæst ved 450 nm. Celleproliferation blev beregnet ved at dividere OD’erne af de behandlede celler med OD’erne af kontrolcellerne.

Real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret med TRIzol reagens og cDNA blev syntetiseret ved anvendelse af en PrimeScript RT reagenskit (Takara Bio, Inc. Otsu, Shiga, Japan). De følgende PCR-betingelser blev anvendt: 1 cyklus ved 95 ° C i 30 s og derefter 40 cykler af 5 sekunder ved 95 ° C og 34 sekunder ved 60 ° C. Real-time PCR blev udført på en Applied Biosystems 7500 real-time PCR-system (Foster City, CA, USA). Resultaterne blev normaliseret mod β-actin RNA. Sekvenserne af PCR-primere var som følger: sense, 5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3 ‘og anti-sense, 5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′ for β-actin; sense, 5’-GTGAGGGAAGCGGTTTACGA-3 ‘og anti-sense, 5’AGATGCCCAGCATGGTTGTT-3′ for Fas; forstand, 5’-TGTCTGCCAATCAGGACGAG-3 ‘og anti-sense, 5′-CACGCCACTCGATGTCAAAG-3’ for Fascin.

lungemetastaseassay

in vivo

AGS celler ( 5 × 10

6 pr mus) forbehandlet med anti-Fas eller ISO i 2 timer blev injiceret i 6-uger gamle nøgne mus via en halevene. At bestemme virkningerne af STAT3 på tumormetastase og Fascin ekspression

in vivo

, AGS tumorceller (5 x 10

6 pr mus) blev intravenøst ​​injiceret i 6-uger gamle nøgne mus og 24 timer senere modtog musene intravenøs injektion af S3I-201 (5 mg /kg, hver 2 dage for i alt 3 gange). Tre uger efter celleinjektion blev musene bedøvet ved at inhalere chloralhydrat og aflivet, og lungerne blev fjernet og antallet af lungetumor foci blev talt under et dissektionsmikroskop.

Immunhistokemi

tumorfoci fra lungerne blev fikseret i 10% formalin, dehydreret i ethanol og indstøbt i paraffin. Vævssnit blev skåret ved 4 um, monteret på objektglas og tørret ved 60 ° C i 4 timer. Følgende korte proteolytisk fordøjelse og et peroxidase blok af væv objektglas ved anvendelse af 2,5% hydrogenperoxid i methanol i 30 minutter ved stuetemperatur, blev objektglassene inkuberet med anti-Fascin antistof natten over ved 4 ° C. Efter vask blev objektglassene inkuberet med peroxidase-mærket polymer og substrat chromogen. Endelig blev prøverne inkuberet i phosphatpufret saltvand indeholdende diaminobenzidin i 5 min. En Olympus mikroskop var ansat til at visualisere farvning af tumorvæv.

Statistisk analyse

Resultaterne blev sammenlignet ved hjælp af en-vejs ANOVA. Spearman rank rækkefølge korrelation test blev anvendt til at undersøge korrelationer mellem niveauerne af Fas og Fascin mRNA i tumorvæv fra GC patienter. En p-værdi på 0,05 blev anset for at være statistisk signifikant

Resultater

Aktivering af Fas signalering fremmer migrationen af ​​AGS celler

Først bekræftede vi udtryk for. Fas-receptoren i AGS og MNK-45 celler ved realtids-PCR og Western blotting analyser og fundet MNK-45 celler udtrykte højere Fas receptor end AGS celler gjorde (fig 1A). Begge cellelinier viste også en høj grad af FasL-ekspression (data ikke vist). Vi undersøgte dernæst, om ligering af Fas-receptoren kunne inducere apoptose i AGS og MNK-45-celler. Efter stimulering med anti-Fas eller ISO ved en koncentration på 1 ug /ml eller 5 ug /ml, var det MNK-45, men ikke AGS celler viste koncentrationsafhængig forøgelse af apoptose (fig 1B). Derfor undersøgte vi, om aktiveringen af ​​Fas signalering kan forårsage andre effekter på AGS celler i stedet for apoptose induktion i de følgende forsøg. Den AGS cellemigrationsassay blev udført

in vitro

og vi fandt migration af AGS celler var signifikant forøget efter stimulering med 5 pg /ml af anti-Fas (Fig 1C). For at udelukke, at øget migration af AGS celler var forårsaget af deres forhøjede proliferation efter, at anti-Fas stimulation, vi undersøgte udbredelsen af ​​ACS celler og fandt ingen tydelig forskel mellem celler behandlet med eller uden anti-Fas (Fig 1D), tyder på, at stigningen i cellemigrering var ikke et resultat af de proliferative egenskaber efter anti-Fas-stimulering. Taget sammen indikerer disse resultater, at Fas-signalering kan øge motiliteten af ​​GC celler

in vitro

.

(A) Fas ekspression i AGS og MNK-45-celler blev detekteret ved real-time PCR (øvre) og Western blot (ned). (B) Modtagelighed for AGS og MNK-45 celler til Fas-induceret apoptose blev målt ved farvning med Annexin V og PI efter begge celler blev stimuleret med anti-Fas eller ISO i de angivne koncentrationer i 24 timer (venstre) og de apoptotiske celler analyseredes statistisk (højre) (n = 3). (C) Efter stimuleret med 5 ug /ml anti-Fas eller ISO i 2 timer blev AGS celler opsamlet og udsået i topkammeret. Otteogfyrre timer senere blev antallet af celler på bunden af ​​Transwell filter afbildes (venstre) og kvantificeret (højre) (n = 5). Forstørrelse: 200 ×. (D) Spredningen af ​​AGS-celler blev målt ved CCK8 assay efter stimulering med 5 pg /ml af anti-Fas eller ISO i den angivne tidspunkterne. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (* P 0,05, *** p 0,001)

Aktivering af Fas signalering opreguleret Fascin udtryk i AGS celler gennem aktivering af STAT3

Det er blevet rapporteret, at Fas signalering er involveret i aktiveringen af ​​STAT3 [18-20]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om aktivering af Fas signalering ville forårsage STAT3-aktivering i AGS celler. Som vist i figur 2A, efter stimulering med anti-Fas i en kort periode blev phosphoryleret STAT3 signifikant forøget i AGS celler. Det er også blevet dokumenteret, at Fascin kan øge motilitet af tumorceller og er en direkte målgen af ​​STAT3 [17]. Således detekteres vi ekspressionen af ​​Fascin i AGS celler efter stimulering med anti-Fas. Som vist i fig 2B, blev mRNA-niveauer af Fascin steg på en tidsafhængig måde og kulminerede efter 12 timer af anti-Fas-stimulering i AGS celler. For yderligere at bekræfte opregulering af Fascin, vi har registreret proteinniveauet af Fascin og fundet stigende Fascin proteinniveauer i anti-Fas men ikke ISO behandlet AGS-celler (fig 2C). For at demonstrere forholdet mellem STAT3 og Fascin i AGS celler efter Fas signaleringsaktivering behandlede vi AGS celler med Stattic, en specifik inhibitor af STAT3, før anti-Fas-stimulering og fandt, at anti-Fas-induceret stigning i Fascin protein blev fuldstændig ophævet i nærvær af Stattic (fig 2D). Vi kunne også påvise aktivering af STAT3 i AGS celler efter anti-Fas-stimulering i 24 timer, men det aktiverede omfang var lidt lavere end den, der 2h anti-Fas-stimulering (Fig 2C og 2D). For yderligere at bekræfte, at STAT3 var involveret i reguleringen af ​​Fascin udtryk efter, at anti-Fas stimulation, vi bankede ned STAT3 udtryk ved hjælp af STAT3 specifikke siRNA før anti-Fas stimulation og opdaget STAT3-knockdown effekt ved Western blotting-analyser. Som vist i fig 2E, STAT3 siRNA men ikke NC siRNA transfektion inhiberes markant af STAT3 ekspression i AGS celler. Forventeligt blev Fascin protein ikke induceret i STAT3-knockdown AGS celler efter anti-Fascin stimulation (Fig 2F). Disse resultater antyder, at aktiverede STAT3 er påkrævet for opregulering af Fascin ekspression forårsaget af Fas signaleringsaktivering i AGS celler.

AGS-celler blev stimuleret med 5 pg /ml af anti-Fas i de angivne tider. (A) Det phosphorylerede STAT3 blev detekteret ved Western blot. (B) Ekspressionen af ​​Fascin mRNA blev analyseret ved real-time PCR. (C) efter stimulering med 5 ug /ml anti-Fas i 24 timer, proteinniveauet af phosphoryleret STAT3 og Fascin i AGS celler blev detekteret ved Western blot. (D) De AGS-celler blev forbehandlet med 10 uM Stattic i 2 timer og efterfulgt af 5 pg /ml af anti-Fas-stimulering i 24 timer; proteinniveauet af phosphoryleret STAT3 og Fascin blev påvist ved Western blot. Efter transfektion med STAT3 siRNA eller NC siRNA i 36 timer, (E) den STAT3 ekspression i AGS celler blev detekteret ved Western blot; (F) den AGS celler blev derefter stimuleret med 5 pg /ml af anti-Fas i 2 timer, og den Fascin ekspression i cellerne blev påvist ved Western blot. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Fas signalering-forfremmet celle migration afhænger STAT3 /Fascin vej

Det er vist, at Fascin medierer tumorceller migration [17]. I den foreliggende undersøgelse, vi undersøgte, om knockdown af Fascin ville hæmme Fas signalering-induceret cellemigration

in vitro

. Vi fandt, at der kunne påvises et fald i Fascin protein i AGS celler transficeret med Fascin siRNA men ikke NC siRNA (Fig 3A). Derefter udførte vi tumorcellemigration assays til påvisning motilitet Fascin-knockdown AGS celler efter anti-Fas-stimulering. Som vist i fig 3B, når anti-Fas-stimulering markant fremmet migrationen af ​​AGS-celler, denne effekt var naturligvis inhiberet i celler behandlet med Fascin siRNA, men ikke NC siRNA. Da STAT3 er påkrævet for Fas signalering inducerede Fascin ekspression i AGS celler, vi næste analyseret virkningerne af STAT3 om Fas signalering medieret cellemigration i AGS celler. Som vist i fig 3C, efter behandling med Stattic, Fas-signalering-forstærket cellemigrering var helt afskaffet. I overensstemmelse med dette resultat, STAT3 siRNA også signifikant inhiberede Fas-signalering-forstærket AGS cellevandring (fig 3D). Disse resultater indikerer, at Fas-signalering fremmet cellevandring og det afhænger af aktiveringen af ​​STAT3 /Fascin pathway.

(A) AGS celler blev transficeret med Fascin siRNA eller NC siRNA i 36 timer, og Fascin ekspression i cellerne blev påvist ved Western blot. Efter (B) inhibering af Fascin ekspression ved siRNA; eller (C) behandlet med 10 pM Stattic i 2 timer; eller (D) inhibering af STAT3-ekspression ved siRNA, og stimuleret med 5 pg /ml af anti-Fas i 2 timer, blev antallet af AGS celler, som migrerede til undersiden af ​​Transwell filteret kvantificeres (n = 5). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (** P 0,01)

Fas signalering fremmer celle metastase in vivo gennem aktivering STAT3 /Fascin vej

For yderligere at demonstrere forholdet mellem Fas signalering og GC metastase, overførte vi anti-Fas-stimulerede AGS celler intravenøst ​​i nøgne mus og detekteret tumorfoci i lungerne. Vi fandt en stigning i tumorfoci i lungerne hos mus, der overføres med celler forbehandlede med anti-Fas men ikke ISO (Fig 4A). For at afklare forholdet mellem Fascin og Fas signalering-medieret tumor metastasering, vi udførte immunhistokemi påvisning af Fascin i tumorvæv. Vi observerede en højere Fascin ekspression i tumorvæv fra mus, der modtog anti-Fas-stimulerede AGS celler end det fra mus, der fik ISO eller un-stimulerede AGS-celler (Fig 4B). Da STAT3 er påkrævet til den anti-Fas-induceret opregulering af Fascin og øget motilitet i AGS celler undersøgte vi virkningerne af STAT3 på AGS celle metastase

in vivo

. Efter behandling med S3I-201, en kemisk sonde inhibitor af STAT3 aktivitet [21], tumor foci i lungerne faldt betydeligt (figur 4C). Derudover blev Fascin ekspression i tumorvæv fra S3I-201 behandlede mus også inhiberet (fig 4D), hvilket antyder kontrol med Fascin af STAT3

in vivo

. Tilsammen indikerer disse resultater, at Fas signalering kan fremme celle metastaser

in vivo

, afhængig af aktivering af STAT3 /Fascin vej.

2 × 10

6 AGS tumorceller præ- stimuleret med anti-Fas eller ISO i 2 timer blev injiceret intravenøst ​​nøgne mus. (A) Antallet af lungetumor foci blev talt (n = 5). (B) Ekspression af Fascin i tumorvæv fra lunge blev påvist ved immunhistokemi. 2 × 10

6 AGS tumorceller blev intravenøst ​​injiceret i nøgne mus og 24 timer senere modtog musene intravenøs injektion af S3I-201 ved 5 mg /kg hver 2 dage for alt 3 gange. (C) Antallet af lungetumor foci blev talt (n = 5). (D) Ekspressionen af ​​Fascin i tumorvæv fra lunge blev påvist ved immunhistokemi (forstørrelse: x 100). Data er repræsentative for to uafhængige forsøg. (* P 0,05, *** p 0,001)

Fascin udtryk er korreleret med Fas udtryk i tumorvæv fra patienter med GC

Da Fas signalering fremmer Fascin udtryk, vi afgjort, om der var en sammenhæng mellem Fas og Fascin udtryk i tumorvæv fra GC patienter. Vi analyserede mRNA niveauer af Fas og Fascin i tumorvæv fra GC patienter. Som vist i figur 5, mRNA-niveauerne af Fas og Fascin viste en positiv korrelation. Dette resultat giver evidens for den tanke, at Fas-signalering fremmer Fascin ekspression i GC.

Fas og Fascin mRNA-ekspression blev målt ved real-time PCR og normaliseret for p-actin mRNA (n = 23). Positiv korrelation blev opnået ved Spearman korrelationsanalyse.

Diskussion

Generelt efter trimerisering af Fas efter ligation med FasL, apoptose påbegyndes. Fas klynge rekrutterer den FADD adapter protein og danner død-fremkaldende signaleringskompleks, forårsager aktivering af caspase-8. Caspase-8 på sin side aktiverer downstream caspaser, såsom caspase-3, kulminerende i apoptose [4]. Ud over at inducere celledød, Fas transmitterer også sprednings- og aktiveringssignaler i tumorceller [22]. Det er blevet rapporteret, at Fas mediere astric slimhindecelleproliferation er ERK afhængig [23], men aktivering af ERK-signalvejen kan ikke inducere proliferationen af ​​B16 murine melanomaceller [24]. Derfor kan Fas inducere proliferation af nogle, men ikke alle tumorceller og den relevante mekanisme er stadig ukendte. Heri fandt vi Fas var ugyldig inducere AGS celleproliferation. Fas-signalering er også blevet demonstreret at inducere motilitet af apoptose-resistente tumorceller via urokinaseplasminogenaktivator [10]. I den foreliggende undersøgelse, vi unraveled en hidtil ukendt mekanisme af Fas-medierende tumorcellemotilitet, som afhang af opregulering af Fascin via aktivering af STAT3.

Det menes generelt, at for at undslippe apoptose forårsaget af FasL-positive T celler, har tumorceller udviklet adskillige måder at modstå FasL-induceret celledrab effekter. Tumorceller er blevet påvist at nedregulere eller endda miste Fas receptorekspression [25] eller ophæve den intracellulære Fas signalvejen gennem mutation i Fas [26]. Tumorceller kan også opregulere cellulær FADD-like IL-1β-omdannende enzym-inhiberende protein eller phosphorylere caspase-8 til at inhibere aktiveringen af ​​caspase-8 og blokere nedstrøms signalering pathway af Fas [27,28]. I nærværende undersøgelse fandt vi aktiveringen af ​​STAT3 i AGS celler efter anti-Fas stimulation. Aktiveringen af ​​STAT3 har vist sig at beskytte cancerceller fra apoptotiske stimuli udgår fra Fas-receptoren [29]. Forbehandling af STAT3 inhibitor kunne ikke initiere AGS celle apoptose efter Fas signalering aktivering (data ikke vist), hvilket antyder, at aktivering af STAT3 ikke er involveret i forebyggelse AGS celler fra Fas-induceret apoptose.

Det har været rapporterede, at Lewis lunge carcinomaceller var konstitutivt resistente over for Fas-medieret apoptose, men overekspression af Fas på disse celler tillader Fas-medieret apoptose efter tværbinding med agonist anti-Fas-antistof [30], hvilket antyder, at der er en kvalitativ forskel i de aktiverede signalering celler modtager, der bestemmer deres skæbne efter Fas signalering ligation. Niveauet af FAS udtrykkelse er moderat i AGS celler og stimuleret med høj dosis af anti-Fas (20 ug /ml); Vi fandt, at AGS celler viste let øget apoptose (data ikke vist). Dette indikerer, at apoptose induktion og migration fremme signalering begge kan aktiveres efter Fas receptor ligering, hvilket kan være relateret til niveauet af anti-Fas anvendes i sådanne forsøg. Hvis høje niveauer af Fas-signalering levering kan ikke opnås under fysiologiske betingelser, vil migrationen promotion signalering tage over efter Fas receptor ligation og forårsage øget GC metastaser.

For at implementere remote metastase, kraftfuld motilitet er nødvendig for tumorcellerne . Fascin, som en actin-bundling protein, er vigtigt for opretholdelsen og stabiliteten af ​​filamentøse bundter actin, og derfor involveret i cellemotilitet [31]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at Fas-signalering var involveret i opregulering af Fascin ekspression. IL-6 er rapporteret at opregulere Fascin ekspression af GC-celler [32]. Fas-signalering er også blevet vist at fremme IL-6-sekretion i tumorceller [33]. Disse beviser indikerer, at Fas-signalering sandsynligvis forstærker virkningen af ​​Fascin opregulering gennem IL-6. Vi endvidere dokumenteret, at Fas og Fascin udtryk blev nært beslægtet i GC patienter, idet betydningen af ​​Fas-Fascin akse i processen med GC metastase.

I overensstemmelse med tidligere undersøgelser, vi demonstreret, at Fas-induceret aktivering af STAT3 var påkrævet for opregulering af Fascin. I den nøgne mus lunge metastase, det STAT3 inhibitor, S3I-201, kunne hæmme Fascin ekspression i tumorvæv. Murin rekombinant FasL var ikke i stand til at aktivere STAT3-aktivering (data ikke vist), hvilket antyder, at aktiverede signalering initieres af FasL på AGS celler selv er tilstrækkeligt til at mediere STAT3-aktivering og nedstrøms Fascin opregulering. Udover at regulere Fascin udtryk, er STAT3 også involveret i celledeling og overlevelse, onkogenese, og kræft metastaser i GC [34-36]. En oralt biotilgængelig små-molekyle STAT3 inhibitor er blevet opdaget og kunne være et potentielt terapeutisk middel til human cancer [37]. Vi spekulere, at STAT3-inhibitoren er et lovende middel, der kan anvendes i klinisk GC terapi i den nærmeste fremtid.

Som konklusion viser vi, at Fas-signalering er involveret i GC metastase gennem STAT3-afhængig opregulering af Fascin. Vores resultater tyder også Fas /STAT3 /Fascin vej kan være et molekylært mål for GC terapi.

Tak

Vi værdsat Dr. Hua Wang for at give cDNA udvundet tumorvæv af GC patienter . Vi værdsat også redaktør af Medjaden til ændring af dette manuskript.