PLoS ONE: Subditine, en New monoterpenoid- Indol Alkaloid fra Bark af Nauclea subdita (Korth.) Steud. Inducerer apoptose i Human Prostata Cancer Cells

Abstrakt

I denne undersøgelse, en ny apoptotisk monoterpenoid- indol alkaloid, subditine (1), og fire kendte forbindelser blev isoleret fra barken af ​​

Nauclea subdita

. Komplet

1 H- og

13C- NMR-data for den nye forbindelse, blev rapporteret. Strukturerne af isolerede forbindelser blev belyst med forskellige spektroskopiske metoder såsom 1D- og 2D NMR, IR, UV og LCMS. Alle fem forbindelser blev screenet for cytotoksiske aktiviteter på LNCaP og PC-3 human prostatacancer cellelinjer. Blandt de fem forbindelser, den nye alkaloid, subditine (1), demonstrerede den mest potente cellevækstinhiberingen aktivitet og selektiv over for LNCaP med en IC

50 af 12,24 ± 0,19 uM og PC-3 med en IC

50 13.97 ± 0,32 uM, sammenlignet med RWPE humant normalt epitelcellelinie (IC

50 = 30,48 ± 0,08 uM). Subditine (1) behandling induceret apoptose i LNCaP og PC-3 som vist ved forøget celle permeabilitet, afbrydelse af cytoskeletale strukturer og øget nuklear fragmentering. Derudover subditine (1) forbedrede intracellulære reaktive oxygenarter (ROS) produktion, hvilket afspejles ved forøget ekspression af glutathion-reduktase (GR) til at fjerne skadelige frie radikaler i begge prostata cancer-cellelinjer. Overdreven ROS kan føre til ødelæggelse af mitokondrie membran potentiale (MMP), frigivelse af cytochrom c og efterfølgende caspase 9, 3/7 aktivering. Yderligere Western blot analyserne viste subditine (1) induceret nedregulering af Bcl-2 og Bcl-xl ekspression, hvorimod p53 var opreguleret i LNCaP (p53-vildtype), men ikke i PC-3 (p53-null) . Samlet set viste vores data, at den nye sammensatte subditine (1) udøver anti-proliferativ effekt på LNCaP og PC-3 humane prostata kræftceller via induktion af apoptose

Henvisning:. Liew SY, Looi CY, Paydar M, Cheah FK, Leong KH, Wong WF, et al. (2014) Subditine, en New monoterpenoid- Indol Alkaloid fra Bark af

Nauclea subdita

(Korth.) Steud. Inducerer apoptose i human prostatacancer Cells. PLoS ONE 9 (2): e87286. doi: 10,1371 /journal.pone.0087286

Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan

Modtaget: August 16, 2013; Accepteret: December 20, 2013; Udgivet: Februar 14, 2014

Copyright: © 2014 Liew et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev finansieret af University of Malaya Research Grant RP001 /2012; University of Malaya High Impact Research Grant UM.C /625/1 /HIR /MOHE /SC /37 og HIR: E00002-20001; French Nationale Center for Videnskabelig Forskning CNRS giver 57-02-03-1007; og Postgraduate forskningsmidler fra University of Malaya (PV050 /2012A). Dette arbejde blev udført inden for rammerne af en officiel aftale mellem CNRS og University of Malaya (Malaysia). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Rubiaceae familie (krap familie) er en af ​​de største af de dækfrøede med mere end 637 slægter og næsten 10.700 arter [1]. Slægten

Nauclea

som hører til denne familie, består af omkring 35 arter på verdensplan [2] og i Malaysia, er der to

Nauclea

arter;

N. officinalis

og

N. subdita

[3].

Nauclea subdita

(Korth.) Steud. er en tropisk plante, der vokser i lavlandet til bakke skove, i sumpede steder og ofte langs vandløb og floder [4]. Det er en lille eller mellemstor træ til 25 m høj og 60 cm omkreds [3]. Planterne fra denne slægt er kendt for at producere interessante monoterpenoid- indol alkaloider med høj strukturel diversitet såsom naucline [5], nauclealines B [6] og naufoline [7]. Mange af dem udviste signifikante biologiske aktiviteter; antikonvulsiv [8], anti-proliferativ [9] og vasorelakserende aktiviteter [5].

Prostatakræft er den hyppigst diagnosticerede kræftform blandt mænd i den udviklede verden. Det anslås 238,590 nye tilfælde vil blive diagnosticeret og 29,720 dødsfald vil være resultatet af prostatakræft i USA i 2013 (Cancer Tal 2013, American Cancer Society, 2013). Selvom de mekanismer, der driver prostatakræft ikke er blevet helt forstået, alder, race, og familiens historie af patienter de prostatacancer har vist sig at være de potentielle faktorer tæt forbundet med denne dødelige sygdom [10].

I vores fortsatte bestræbelser på at søge efter nye og bioaktive kemiske bestanddele fra Malaysia planter [11] – [15], en ny cytotoksisk og apoptotiske monoterpenoid- indol alkaloid, subditine (1), er blevet isoleret fra barken af ​​

Nauclea subdita

sammen med de fire kendte alkaloider; angustoline (2) [11], [16], [17], angustidine (3) [18], [19], angustine (4) [20], [21], nauclefine (5) [22], [23 ] (Figur 1). I det foreliggende papir, beskrives isoleringen og karakteriseringen af ​​subditine (1), de cytotoksiske aktiviteter af alkaloider 1-5 samt den apoptotiske mekanisme 1 mod humant prostatacancerceller LNCaP og PC-3.

strukturen af ​​nye forbindelser, subditine (1) blev belyst ved hjælp af forskellige spektroskopiske metode, som var 1D-NMR (

1 H,

13C, DEPT), 2D-NMR (HSQC, HMBC, NOESY), UV, IR og LCMS mens strukturen i de øvrige fire kendte forbindelser blev bekræftet gennem sammenligning af NMR-data med litteratur værdier.

Materialer og metoder

Generelle procedurer

1D – og 2D-NMR blev registreret i deutereret chloroform (CDC

3) (Merck, deuteringsgrad min 99,8%.) under anvendelse af JEOL LA 400 MHz FT NMR og JEOL ECA 400 MHz FT NMR-spektrometer. De massespektre blev opnået på et Shimadzu LCMS-IT-TOF. UV-absorbans-spektre blev opnået under anvendelse af Shimadzu UV-250 ultraviolet synligt Spectrometer. Opløsningsmiddel, der anvendes var methanol (CH

3OH). IR-spektre blev opnået på et Perkin Elmer Spectrum 400-FTIR spektrometer med CHC

3 som opløsningsmiddel. Alle opløsningsmidler, undtagen dem, der anvendes for bulk ekstraktion er AR kvalitet. Silicagel 60 (Merck, 0,040-0,063 mm) blev anvendt til søjlekromatografi (CC). Aluminium understøttet silicagel 60 F

254 plader 20 x 20 cm blev brugt til tyndtlagschromatografi (TLC) (Merck, Tyskland). Præparativ tyndtlagskromatografi (PTLC) silicagel 60 F

254 glasplader 20 × 20 cm (Merck, Tyskland) blev anvendt til adskillelse af forbindelser, som ikke kan adskilles ved konventionel kolonne. TLC pletter blev visualiseret under UV-lys (254 og 365 nm) efterfulgt af sprøjtning med Dragendorffs reagens til alkaloid detektion. Et positivt testresultat blev indikeret ved dannelsen af ​​orange pletter.

Plant Materiale

bark af

Nauclea subdita

blev indsamlet på Hutan Simpan Bukit Kinta, Chemor, Perak, Malaysia ved phytochemical gruppe af Kemisk Institut, det Naturvidenskabelige Fakultet, universitetet i Malaya. Voucher prøver (KL 5254) af disse planter blev deponeret i Herbarium af Kemisk Institut, University of Malaya, Kuala Lumpur, Malaysia. Plant samling er blevet godkendt af lederen af ​​Jabatan Perhutanan Negeri Perak (Perak State Forestry Department). De feltstudier ikke indebar truede eller beskyttede arter.

Udvinding og isolation

Tørret blev jordet bark af anlægget (1,7 kg) først affedtet med hexan (17 liter) i 3 dage ved stuetemperatur. Hexanekstrakten blev filtreret og tørret ved stuetemperatur. Så de tørrede plantematerialer blev fugtet med ammoniakopløsning og gennemvædet i 2 timer. De blev re-ekstraheret med CH

2Cl

2 (17 liter) to gange for en periode på 3 dage. Den opnåede supernatant blev koncentreret under anvendelse af rotationsfordamper under reduceret tryk til et volumen på 500 ml og undersøgt for dens alkaloid indhold (ved hjælp TLC og bekræftet ved sprøjtning med Dragendorffs reagens). Ekstrakten blev endelig opkoncentreret til opnåelse af dichlormethan råekstrakt (5,0 g). Den rå ekstrakt blev udsat for CC over silicagel 60 under anvendelse CH

2Cl

2 og MeOH opløsningsmiddel (100:0, 99:1, 98:2, 97:3, 96:4, 95:5, 94 :6, 90:10, 83:17, og 75:25) og endelig med 100% MeOH blev anvendt som eluent. Ved at sammenligne TLC mønstre af disse fraktioner, blev femten fraktioner endelig opnået.

Rensning af Forbindelse

Yderligere oprensning af fraktion 5 ved PTLC gav alkaloid 1 (10,6 mg, MeOH-CH

2Cl

2; 98:2: mættet med NH

4OH). Begge kendte forbindelser af 3 (5,5 mg, MeOH-CH

2Cl

2; 98:2: mættet med NH

4OH) og 5 (6,2 mg, MeOH-CH

2Cl

2 ; 98:2: mættet med NH

4OH) blev opnået efter rensning ved PTLC fra fraktion syv, mens forbindelser 2 (7,5 mg, MeOH-CH

2Cl

2; 95:5: mættet med NH

4OH) og 4 (12,5 mg, MeOH-CH

2Cl

2; 98:2: mættet med NH

4OH) blev opnået fra brøkdel af tolv og seks henholdsvis

Alkaloid. 1

Gullig amorft fast stof; UV (MeOH) λ

max (log ε): 393, 377, 210 nm; IR (CHC

3) ν

max: 3430, 1640 cm

-1; for

1 H- og

13C-NMR-spektroskopiske data, se tabel 1; LCMS -IT-TOF på

m /z

330.1018 [M + H]

+ for C

20H

15N

3 O

2 (Beregnet. For C

20H

15N

3 O

2:330.1237).

Cell Culture

menneskelig prostata normal cellelinje (RWPE-1) og human prostatacancer celle linjer; LNCaP og PC-3, blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, Virginia, USA). LNCaP og PC-3-celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 1% penicillin og streptomycin. RWPE-1-celler blev opretholdt i keratinocyt serumfrit medium (K-SFM, ATCC) suppleret med ekstrakt fra bovin hypofyse (BPE) og human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF). Medier blev suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (Sigma.), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin (Flowlab, Sydney, Australien). Alle celler blev holdt i en befugtet atmosfære af 5% CO

2 i luft ved 37 ° C inkubator.

celleproliferationsassay

antiproliferative aktivitet blev vurderet ved at udføre MTT-assays som tidligere beskrevet med mindre modifikationer [24]. Kort fortalt blev cellerne podet 24 timer før behandling i en 96-brønds plade ved 5 × 10

4 celler /brønd for at opnå 70% til 80% konfluente kulturer. Forbindelserne blev opløst i DMSO (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) efterfulgt af en 2 × seriel fortynding i 10 point varierede fra 0,825 pM til 100 pM. Pladen med 96 brønde blev inkuberet i 24 timer ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Ved slutningen af ​​inkubationen, 50 pi MTT-opløsning (2 mg /ml; Sigma) blev tilsat til hver brønd. Pladen blev derefter inkuberet i 4 timer. Alle Mediet blev fjernet, og den lilla formazan krystal dannet ved bunden af ​​brøndene blev opløst med 200 pi DMSO i 20 minutter. Absorbansen ved 570 nm blev aflæst på en spektrofotometrisk pladelæser (Hidex). Andelen af ​​overlevende celler blev beregnet som:.

Dosis-respons-kurver blev konstrueret til opnåelse af IC

50 værdier. Eksperimentelle data blev afledt fra 3 uafhængige eksperimenter. Den selektivitet indekset blev opnået ved gennemsnitlig IC

50 RWPE-1 /betyde IC

50 af LNCaP eller PC-3.

Cellomics Multiparameter Assay

cytotoksicitet 3 kit (Thermo Scientific ) blev anvendt som tidligere [25] beskrevne. Kort fortalt, 24 timer efter subditine (1) behandling, MMP farvestof og cellen permeabilitet farvestof blev tilsat til levende celler og inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C. Cellerne blev fikseret, permeabiliseret, blokeret med 1x blokerende buffer inden probing med primær cytochrom c og sekundær DyLight 649 konjugeret gede-anti-muse-IgG-antistoffer i 1 time hver. Hoechst 33342 blev tilsat til farveopløsningen. Pladerne blev derefter analyseret ved anvendelse af ArrayScan højt indhold screening (HCS) -system (Cellomics, PA, USA). Data blev taget til fange, ekstraheret og analyseret med ArrayScan II dataopsamling og Data Viewer version 3.0.

ROS Assay

Produktionen af ​​intracellulær ROS blev detekteret som tidligere beskrevet [26]. DHE farvereagens omdannes til fluorescerende ethidium og interkalerer i DNA i afhængighed intracellulære ROS. Kort beskrevet blev 10 mM DHE stamopløsning (i methanol) fortyndet 500 gange i HBSS uden serum eller andre additiver til opnåelse af en 20 pM arbejdsopløsning. Efter eksponering for subditine (1), blev cellerne i 96-brønds sort plade vasket to gange med HBSS og derefter inkuberet i 100 pi arbejder opløsning af DHE ved 37 ° C i 30 minutter. Fluorescens af DCF i hver celle blev fanget, ekstraheret og analyseret med ArrayScan II dataopsamling og Data Viewer version 3.0 (Cellomics).

genekspressionsprofilering

LNCaP og PC-3 celler blev behandlet med subditine (1) (12,5 uM) i 18 timer. RNA blev ekstraheret fra PC-3 eller LNCaP-celler ved anvendelse af RNeasy plus mini kit (Qiagen). 1 ug RNA blev revers transkriberet til cDNA ved hjælp af RT2 første streng kit (SA Biosciences, Qiagen) .cDNA blev blandet med RT2 Real Time ™ SYBR Green /fluorescein PCR mester-mix og indlæses i hver 96 brønde i Human oxidativt stress og antioxidant Defense qPCR array ifølge fabrikantens protokol (SA Biosciences, Qiagen). Kort fortalt blev et samlet volumen på 25 pi PCR-blanding, som omfattede 12,5 pi mastermiksens, 11,5 pi dobbelt destilleret vand, og 1 pi cDNA fyldt i hver af 96wells. qPCR blev udført under anvendelse StepOne PLUS realtids-PCR-maskine (Applied Biosystems). PCR-amplifikation blev udført ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 15 sek og 60 ° C i 1 min. MRNA-ekspression for hvert gen blev normaliseret ved hjælp af den gennemsnitlige udtryk for fem husholdning gener:

β-actin (ACTB), β-2-mikroglobulin (p2m), hypoxanthin phosphoribosyltransferase en (HPRT1), ribosomale protein L13a ( RPL13A) og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH). Den ΔΔCt metode blev anvendt til dataanalyse. Fold ændringer blev beregnet for hvert gen som forskellen i genekspression mellem subditine (1) eller ikke-behandlet kontrol ved hjælp af RT Profiler qPCR-array-data analyse software.

Real-time qPCR analyse

Totalt RNA blev ekstraheret fra PC-3 eller LNCaP-celler ved anvendelse af RNeasy plus mini kit (Qiagen). RNA (1 ug) blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse iScript cDNA syntesekit (Biorad). QPCR blev udført på den StepOne PLUS real-time PCR-maskine (Applied Biosystems) under anvendelse SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad) ifølge fabrikantens protokoller. Primere blev kommercielt syntetiseret af integrerede DNA Technologies (IDT). Mål-mRNA-værdier blev normaliseret under anvendelse af β-actin mRNA og data blev udtrykt i forhold til normaliserede værdier af tilsvarende kontroller. Prøver blev analyseret i tre uafhængige eksperimenter i tredobbeltbestemmelse. Primere anvendte anført nedenfor,

GR Forward primer, AACATCCCAACTGTGGTCTTCAGC

GR Reverse primer, TTGGTAACTGCGTGATACATCGGG

β-actin Forward primer, GATGACCCAGATCATGTTTGAGACC

β-actin Reverse primer, AGTCCATCACGATGCCAGTGGT

Bioluminescent Analyser af caspase-3/7 -8 og -9

En tidsafhængig undersøgelse af caspase-3/7 -8, og -9 aktiviteter var udført i triplikater under anvendelse assaykits Caspase-Glo 3/7, 8 og 9 (Promega Corp., Madison, WI, USA) på hvid mikroplade med 96 brønde som tidligere beskrevet [27]. I alt 10.000 celler pr brønd blev podet og behandlet med 12,25 uM subditine (1) til 6, 12, 18, 24 og 30 timer. Derefter blev 100 pi af caspase-Glo-reagens tilsat, inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter og målt ved anvendelse af Tecan Infinite 200 Pro (Tecan, Mannedorf, Swizerland) mikropladelæser.

Western Blotting

for at bestemme proteinekspression, 1

×

10

6 celler /ml blev udsået og behandlet med subditine (1) eller paclitaxel i 24 timer. Hele celleekstrakter blev fremstillet som tidligere beskrevet [28]. Kort beskrevet blev celler opsamlet, lyseret og forsvandt ved 10% SDS-polyacrylamidgeler. Efter elektroforese blev proteinerne overført til PVDF-membraner (Millipore), blokeret med 5% fedtfri tørmælk i PBS-T (0,05% Tween 20) i 1 time ved stuetemperatur. Membraner blev probet med primær kanin-anti-Bcl-2, Bcl-XL eller p53-antistoffer efterfulgt af peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundært anti-kanin-antistof (Cell Signaling Technology Inc., CA, USA). Membraner blev strippet og testet igen med musen anti-

β

actin antistof som lastning kontrol (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Protein-antistof-komplekser blev påvist med Amersham ECL prime Western blotting påvisningsreagens (GE Healthcare, USA).

Statistical Analysis

Alle værdier blev udtrykt som middel ± S.D. Statistiske analyser blev vurderet ved Students t-test. Sandsynlighedsværdier * p 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater og Diskussion

Dichlormethanekstraktet af barken af ​​

Nauclea subdita

blev underkastet søjlekromatografi over silicagel 60. med gradientelueringssystem af dichlormethan (CH

2Cl

2) og methanol (MeOH), hvilket giver 15 fraktioner. Yderligere oprensning af fraktionerne ved hjælp af præparativ tyndtlagskromatografi gav subditine (1) og fire kendte alkaloider; angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5). Strukturel identifikation af 1 blev gjort ved 1D-, 2D-NMR, UV, IR og LCMS mens strukturen af ​​kendte forbindelser (2-5) blev identificeret ved sammenligning af NMR-data med værdier fra litteraturen.

Karakterisering af Subditine (1)

Subditine (1) blev isoleret som et gulligt, amorft faststof. Den LCMS-IT-TOF spektrum afslørede en pseudomolekylære ion peak [M + H]

+ på

m /z

330,1018, svarende til den molekylære formel C

20H

15N

3 O

2 (calc. 330,1237). IR-spektret af 1 udviste et absorptionsbånd ved 1645 cm

-1, angiver en konjugeret lactam carbonylfunktionalitet [18].

I

1 H-NMR-spektrum, tilstedeværelsen af ​​to dubletter ved δ

H 7,62 (1H,

d

,

J

= 7,8 Hz, H-9) og δ

H 7,47 (1H,

d

,

J

= 8,2 Hz, H-12), to dublet af dubletter ved δ

H 7,34 (1H,

dd

,

J

= 8,2, 7,1 Hz, H-11) og δ

H 7,19 (1H,

dd

,

J

= 7,8, 7,1 Hz, H-10), to methylener ved δ

H 4,51 (1H,

m

, H-5) og δ

H 3,16 (1H,

m

, H-6), hvilket antyder en naucleamide derivat med substitutionsmønster i ring a og C [29]. Desuden er denne tetrahydro-

β

carbolin skelet (ring A, B, og C) er blevet identificeret med HMBC korrelationer af H-5 til C-3 (δ

C 139,4) og C-7 ( δ

C 117,1), H-6 til C-2 (δ

C 127,3) og C-7, H-9 og H-11 til C-13 (δ

C 138,7) (figur 2 ). En bred singlet ved δ

H 8,94 indebar nærvær af en NH-enhed. Den

13C-NMR og DEPT-spektre af 1 anførte alt tyve carbonsignaler; en methyl-, to methylen, seks methan, ni kvaternært carbonatom og to carbonyl (tabel 1). Carbonylgruppen af ​​lactamringen genklang ved δ

C 161,7. Desuden viste HMBC spektrum korrelation mellem H-14 (δ

H 7,97) og C-3, H-14 og C-16 (δ

C 119,3), H-5 (δ

H 4.51) og C-20 (δ

C 161,7), hvilket understøtter tilstedeværelsen af ​​en δ lactam ring. Endvidere HMBC korrelationer af H-14 til C-16 og C-21 (δ

C 127,6), H-17 (δ

H 9,57) til C-15 (δ

C 141,1) og C -16, H-18 (δ

H 2,98) til C-22 (δ

C 165,9), H-19 (δ

H 10,72) til C-21 (δ

C 127,6) indikerede, at ring D er forbundet til en nicotinaldehyd ring (ring E) med en methylgruppe danner en 2-methylnicotinaldehyde enhed. Subditine (1), har en nauclefine type skelet [30], og det er meget lig den kendte forbindelse, angustidine (3), bortset fra, at førstnævnte har en yderligere carbonylgruppe ved C-21.

1 H og

13C værdier for begge forbindelser er angivet i tabel 1. Komplet

1 H og

13C-NMR opgaver blev oprettet ved grundig analyse af COSY, HMBC, HSQC og NOESY data.

Biologisk Assay

Subditine (1) kraftigt hæmmet celle-vækst i LNCaP og PC-3 prostatacancerceller.

Den anti-cancer effekt dichlormethan rå, subditine ( 1), angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5) og blev vurderet på humane prostatacancerceller LNCaP og PC-3 ved MTT-assays. IC

50 værdier (dosis, som kræves for at inhibere det proliferative respons med 50%) for hver forbindelse blev vist i tabel 2. Subditine (1) viste stor inhibitorisk virkning i retning LNCaP-celler på IC

50 12.24 ± 0,19 uM, mens IC

50 for angustoline (2), angustidine (3), angustine (4), nauclefine (5) var 58,09 ± 0,05 uM, 140,27 ± 0,10 uM, 149.16 ± 0,09 uM og 86,35 ± 0,09 uM hhv. Lignende resultater blev opnået på PC-3-celler, hvor subditine (1) udviste den højeste aktivitet (IC

50 = 13,97 ± 0,32 uM) sammenlignet med de andre forbindelser. Disse resultater understøtter, at subditine (1) er den mest potente cytotoksiske forbindelser blandt de fem testede.

Efterfølgende testede vi cytotoksicitet effekt af subditine (1) om RWPE-1 (humane normale prostata epitelceller ). MTT-assay viste en højere IC

50 værdi på 30,48 ± 0,08 uM, hvilket indikerer, at subditine (1) er 2,5 og 2,2 folder mere potent mod LNCaP og PC-3 (selektivitet (SI): [LNCaP /PC-3] = 2.49 /2.18) prostata cancer celler end de normale prostata celler; RWPE-1. I modsætning hertil udviste standard lægemiddel paclitaxel mindre selektivitet (SI: [LNCaP /PC-3] = 1,24 /1,19) ved at udvise IC

50 værdier på 1,27 ± 0,04 pM, 1,33 ± 0,02 uM og 1,58 ± 0,06 pM imod LNCaP, PC-3 og RWPE-1 hhv.

Subditine (1) induceret cytoskelet omlejring og nuklear fragmentering.

Siden subditine (1) signifikant hæmmet LNCaP og PC-3 cellevækst, dette stof var udvalgt til yderligere mekanistiske undersøgelser. Cytoskeletal og nukleare morfologiske ændringer af LNCaP og PC-3-celler blev undersøgt ved phalloidin (registrerer F-actin) og Hoechst 33342 farvning. Resultaterne viste, at nogle subditine (1) behandlede-celler viste celle krympning med punktformig farvning af F-actin ved den perifere membran (figur 3). Ved koncentration 12,5 uM og 25 uM, blev påvist cellekernekondensation og fragmentering 24 timer efter subditine (1) behandling (figur 4). Det nukleare intensitet, svarende til apoptotiske kromatin ændringer blev væsentligt forøget efter subditine (1) behandling i LNCaP og PC-3 celler (figur 4,

P

0,05). Disse resultater antyder, at subditine (1) behandling induceret apoptose i LNCaP og PC-3 prostatacancerceller.

LNCaP og PC-3-celler blev behandlet med subditine (1) ved forskellige koncentrationer i 24 timer. Celler blev fikseret og farvet med Hoechst (blå) og phalloidin (rød) farvestof, som farves kerne og polymeriseret actin (F-actin), hhv. Søjlediagram, der viser gennemsnitlige fluorescerende intensitet phalloidin (gennemsnit ± standardafvigelse .; * p 0,05). Dosisafhængig forøget af phalloidin intensitet i LNCaP-celler blev observeret efter subditine behandling.

LNCaP og PC-3-celler blev behandlet med subditine (1) (12,5 uM og 25 uM) i 24 timer. Celler blev derefter fikseret og farvet med Hoescht 33342 (blå). Røde cirkler angiver DNA svind eller fragmentering. Billeder blev taget med Cellomic arrayscan system.

Subditine (1) fremmes Reactive Oxygen Species (ROS) produktion.

ROS er naturlige biprodukter af den normale metabolisme af ilt. Dog kan ROS niveau stige dramatisk på miljø- eller kemisk stress (fx tilstedeværelsen af ​​cytotoksisk middel). For at undersøge, om eksponering af subditine (1) fremmer ROS produktion, vi farvede levende celler med DHE farvestof, 24 timer efter subditine (1) behandling. DHE hurtigt oxideres til DCF af ROS og de fluorescerende intensiteter blev kvantificeret med Cellomics High Content Screening. Som vist i figur 5, niveauerne af DCF fluorescens i LNCaP og PC-3-celler behandlet med subditine (1) blev signifikant forøget i en dosis-afhængig måde.

LNCaP og PC-3-celler blev behandlet med subditine (1) (12,5 uM, 25 uM, 50 uM) i 24 timer. Celler blev derefter fikseret og farvet med DHE farvestof. ROS niveauer blev indirekte bestemt ved at måle DHE farvestof inkorporering i den nukleare hjælp Cellomic HCS arrayscan. Øget DHE farvestof intensitet i cellekernen blev påvist ved behandling af subditine. Hoechst (blå) og DHE farvestof (grøn). Søjlediagram, der viser den gennemsnitlige fluorescerende intensitet DHE plet (gennemsnit ± standardafvigelse .; * p 0,05)

associering mellem prostatakræft risiko og oxidativ stress er blevet godt anerkendt.. Der er betydelige beviser tyder oxidativ stress bidrager til etiologien og patogenese af prostatacancer. Eftersom mitokondrierne er en væsentlig kilde af ROS, kan ændrede mitokondrielle bioenergetik grund for udvikling af prostatacancer. Endvidere er der fundet høje niveauer af ROS i adskillige humane cellelinier såvel som i forskellige humane væv. Nogle understøttende beviser tyder på, at øget ROS-generering kan være et resultat af oncogen transformation. Iboende oxidativt stress kan påvirke flere funktioner i cancerceller eller tumorvæv, såsom celleproliferation, fremme af mutationer og genetisk ustabilitet, ændringer i cellulær følsomhed til anti-cancer midler, invasion og metastase. Målretning ROS produktion snarere end ROS neutralisering kan tilbyde en ny mekanisme i bekæmpelsen af ​​prostatacancer og måske andre maligniteter.

Subditine (1) induceret gluthation reduktase genekspression.

Som vi viste, at subditine (1 ) har vist, at det kunne fremkalde ROS i celler, besluttede vi at bruge menneskelige oxidativ stress og antioxidant forsvar realtid profiler qPCR array at kvantificere genekspression ændringer i PC-3 eller LNCaP celler behandlet med subditine (1). Dette qPCR array indeholder 84 gener involveret i cellulær stress respons og redox kontrol og omfatter alle seks medlemmer af antioxidant peroxiredoxin (PRDX) familie.

Den oxidative stress og antioxidant-relaterede gener udtrykkes forskelligt i PC-3 eller LNCaP-celler som respons på subditine (1). Interessant, bemærkede vi, at glutathion reduktase (GR) var signifikant opreguleret (

P

0,05) i begge prostatakræft celle-linjer i forhold til at styre celler (Fig 6A.). Den fold ændring er mere drastisk i LNCaP ( 100 gange) sammenlignet med PC-3 ( 20-fold) celler. Efterfølgende uafhængig qPCR-analyse viste også, at dette gen er up-reguleret i subditine (1) -behandlede celler, i overensstemmelse med vores qPCR array-resultater (fig. 6B).

LNCaP og PC-3-celler blev behandlet med subditine (1) (12,5 uM) i 18 timer. (A) Humant oxidativt stress og antioxidantforsvar qPCR array blev anvendt til at identificere gener signifikant op- eller nedreguleret i subditine (1) -behandlede LNCaP eller PC-3-celler. Gene profilering analyser blev udført tre gange i uafhængige forsøg. (Pil indikerer placeringen af ​​GR i scatter plots) (B) Transkriptionelle ændringer af GR blev evalueret ved brug af kvantitativ real-time-PCR. Niveauer af GR-mRNA blev normaliseret under anvendelse af β-actin housekeeping-gen og udtrykt som fold ændring i forhold til ubehandlet kontrol.

GR er et vigtigt enzym involveret i scavenging af aktive oxygenarter. Vores resultater tyder på, at øget ROS produktion af subditine (1) kunne stimulere GR

de novo

syntese. GR er kendt for sin anti-oxidant funktion og sædvanligvis anvendes som en indikator for oxidativt stress. Opregulering af GR kunne være en af ​​den cellulære antioxidant forsvarsmekanisme som reaktion på stigende ROS. overflødig generering af reaktive oxygenarter, kunne imidlertid overvælde antioxidant system, som udløser en kaskade af begivenheder, der fører til beskadigelse lipid-protein, frakobling af oxidativ phosphorylering og i sidste ende resulterer i apoptose.

Subditine (1) øget membran permeabilitet, reduceret mitokondriemembranen Potential (MMP) og øget cytochrom c frigivelse.

for at få et bedre indblik i den mekanisme af subditine (1) induceret cytotoksicitet, ændringer i membran permeabilitet, mitokondrie membranpotentiale (MMP) og cytochrom c lokalisering efter subditine (1) behandlinger blev målt. Som forventet subditine (1) -behandlede LNCaP og PC-3-celler demonstrerede højere permeabilitet membran sammenlignet med kontroldyr som mest behandlede celler undergår apoptose grund cytotoksiske aktivitet af forbindelsen (figur 7A og 7B). Desuden viste resultaterne, at subditine (1) behandling forårsaget tab af MMP, hvilket tyder på en plausibel mekanisme til celledød. Som vist i figur 6A, MMP farvestof farves kraftigt i cytoplasmaet i kontrolceller sammenlignet med subditine (1) -behandlede celler. LNCaP og PC-3-celler behandlet med subditine (1) i 24 timer udviste dosisafhængig reduktion af MMP fluorescensintensitet (figur 7B), hvilket afspejlede sammenbruddet af MMP. På den anden side viste subditine (1) behandlet-LNCaP og PC-3 forøget fluorescerende-farvning i cytosolen sammenlignet med kontrolgruppen, hvilket indikerer cytochrom c-frigivelse (figur 7A og 7B). Disse resultater antyder, at subditine (1) udløste tabet af MMP og efterfølgende translokation af cytochrom c fra mitokondrier i cytosolen i LNCaP og PC-3-celler.

LNCaP og PC-3-celler blev behandlet med subditine (1 ) i 24 timer. Celler blev derefter fikseret og farvet med membranpermeabilitet farvestof, MMP, cytochrom c og Hoechst som beskrevet i Materialer og Metoder. (A) farvede celler blev visualiseret ved hjælp af HSC arrayscan system til at kontrollere nukleare morfologi, permeabilitet membran, MMP integritet, cytochrom c-frigivelse; Blå (nuklear), Grøn (Membranpermeabilitet), Rød (MMP), cyan (cytochrom c release). (B) Bar skema, der viser de gennemsnitlige fluorescerende intensiteter af membranpermeabilitet, MMP og cytochrom c (gennemsnit ± SD, * p 0,05)

Subditine (1) aktiveret caspase 9 og 3/7..

frigivelsen af ​​cytochrom c fra mitokondrier aktiverer downstream caspase molekyler og føre til apoptotisk celledød. For at undersøge dette, bioluminescerende intensiteter af caspase-3/7 -8, -9 aktiviteter subditine (1) -behandlede LNCaP og PC-3-celler ved 6, 12, 18, 24, eller 30 timer tidspunkter blev målt . Som vist i figur 8, væsentlig stigning i caspase-3/7 -9 blev påvist i såvel LNCaP og PC-3-celler efter 12 og 24 timer efter subditine (1) eksponering. Den højeste aktivitet for caspase-9 i begge cellelinier blev observeret efter 24 timers behandling med subditine (1). På den anden side, caspase-3/7 Aktivitetsmenutast nåede til en top efter 18 timers behandling og nedtrappes på senere tidspunkter (24 og 30 timer). Hverken LNCaP eller PC-3 celler udviste nogen induktion af caspase-8 aktivitet under 30 timers subditine (1) behandling.