PLoS ONE: BRCAness Profil af sporadisk kræft i æggestokkene forudser Disease Recurrence

Abstrakt

Baggrund

Konsekvenserne af defekte homolog rekombination (HR) er ikke forstået i sporadisk kræft i æggestokkene, og heller ikke har potentiale rolle andre end BRCA1 og BRCA2 HR proteiner blevet klart defineret. Men det er klart, at fejl i HR og andre DNA reparation veje er vigtige for effektiviteten af ​​de nuværende behandlinger. Vi hypotesen, at en delmængde af sporadiske ovariecarcinomer kan harbor uregelmæssigheder i HR veje, og at en BRCAness profil (fejl i HR eller andre DNA reparation veje) kunne påvirke responsrate og overlevelse efter behandling med platin narkotika. Klinisk tilgængeligheden af ​​en BRCAness profil i patienter og /eller tumorer bør forbedre behandlingsresultater.

Målsætning

For at definere BRCAness profil sporadisk ovariekarcinom og afgøre, om BRCA1, PARP, FANCD2, PTEN, H2AX, ATM, og P53 proteinekspression korrelerer med respons på behandling, recidiv og tilbagefald overlevelse.

Materialer og metoder

protein microarray analyse af kræft i æggestokkene væv blev anvendt til at bestemme protein ekspressionsniveauer for definerede DNA reparation proteiner. Korrelation med kliniske og patologiske parametre i 186 patienter med fremskreden stadie III-IV og grad 3 æggestokkræft blev analyseret ved hjælp af Chi square, Kaplan-Meier-metoden, Cox proportional hazard model, og kumulative incidens funktion.

Resultater

High PARP, FANCD2 og BRCA1 udtryk var signifikant korreleret med hinanden; dog blev forhøjet p53-ekspression er forbundet kun med høj PARP og FANCD2. Af alle patienter, 9% gentog sig inden for det første år. Blandt tidlige tilbagevendende patienter, 41% havde høje niveauer af PARP, FANCD2 og P53, sammenlignet med 19,5% af patienter uden tidlig recidiv (p = 0,04). Kvinder med høje niveauer af PARP, FANCD2 og /eller P53 havde første år kumulative kræfttilfælde på 17% sammenlignet med 7% for de andre grupper (P = 0,03).

Konklusioner

Patienter med samtidigt høje niveauer af PARP, FANCD2 og P53 proteinekspression har en øget risiko for tidlig kræft i æggestokkene tilbagefald og platin modstand

Henvisning:. Wysham WZ, Mhawech-Fauceglia P, Li H, Hays L, syrisk S, Skrepnik T, et al. (2012) BRCAness Profil af sporadisk kræft i æggestokkene forudser Disease Gentagelse. PLoS ONE 7 (1): e30042. doi: 10,1371 /journal.pone.0030042

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: May 9, 2011; Accepteret: 8. december 2011; Udgivet: 11 januar, 2012 |

Copyright: © 2012 Wysham et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Sherie Hildreth kræft i æggestokkene (SHOC) Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den anden mest almindelige gynækologisk malignitet og den mest almindelige dødsårsag blandt kvinder med en gynækologisk cancer. Omkring 21.000 kræft i æggestokkene tilfælde diagnosticeres årligt, og ca. 14.000 dødsfald som følge af kræft i æggestokkene opstår hvert år [1]. Selv om der er gjort betydelige forbedringer i de sidste adskillige årtier at forlænge median levetid efter kræft i æggestokkene diagnose, kan mindre end 30% af patienterne helbredes med optimal kirurgisk cytoreduktion og standard adjuverende kemoterapi med en platin-holdigt middel, og lang sigt overlevelse har ikke forbedret [2].

Patienter med mutationer af BRCA1 eller BRCA2, gener involveret i reparation af dobbeltstrengede DNA-brud ved homolog rekombination (HR), har øget følsomhed over for platin kemoterapi og dermed forbedre deres generelle overlevelse resultatet [3] – [5]. Derudover kan celler med allerede eksisterende defekter i HR pathway (BRCA 1 eller BRCA 2 mutation) blive ramt af en anden hit i form af en inhibering af basen excision reparation (BER) pathway, som fører til celledød. Dette koncept af syntetisk letalitet – kombinationen af ​​to genetiske ændringer, som i sig selv er ikke-dødelige, men samlet giver en dødelig fænotype – ført til interesse i inhibitorer af BER pathways. En sådan BER inhibitoren er poly-ADP ribose polymerase (PARP) -inhibitor, som gør HR deficiente celler særligt følsomme over for kemoterapi-induceret DNA skade [6] – [8]. Mens normale celler kan reparere skaderne og overleve, kan de BRCA-mangelfulde celler ikke aktivere HR-systemet, og derfor de dør (6). PARP-inhibitorer har vist lovende resultater hos patienter med BRCA1- eller BRCA2-positive ovariecancer [9] – [11].

Mens kun 10-15% af kvinder med ovariecancer har kimlinie BRCA1 eller BRCA2-mutationer, nylige data antyder, at sporadiske ovariecancere kan harbor erhvervet genetiske og epigenetiske defekter i BRCA og i andre DNA-reparation gener og proteiner, såsom PTEN, RAD51, og Fanconi anæmi (FA) gener [7], kan der bidrager til “BRCAness profil” . Grund af den fælles rolle, BRCA1 og BRCA2 have med andre DNA reparation gener, kan defekter i disse andre DNA reparation proteiner alene påvirke reaktionen på behandling, tilbagefaldsrater, og samlet overlevelse og forøge følsomheden til PARP-inhibitorer. Udfordringen er at definere BRCAness profiler i sporadisk kræft i æggestokkene og korrelere dette med kliniske resultat.

Således er formålet med denne undersøgelse er at definere BRCAness profil sporadisk kræft i æggestokkene. Konkret vi havde til formål at afgøre, om ekspressionen af ​​DNA reparation proteiner, herunder PARP, FANCD2, BRCA1, PTEN, H2AX, ATM, samt p53, korreleret med respons på behandling, tilbagefald sats, og overlevelse i kræft i æggestokkene.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle patienter gennemgik ovariecancer iscenesættelse eller debulking kirurgi på Roswell Park cancer Institute i Buffalo, New York. Alle patologi prøver blev indsamlet og gennemgået i vores institution, og tumorer blev klassificeret i henhold til WHO kriterier [12]. De medicinske optegnelser af patienterne blev efterfølgende revideret henhold til en godkendt Roswell Park Cancer Institute Institutional Review Board protokol, der kræver skriftlig patient samtykke. Gennemgangen omfattede ud- og døgnbehandling, herunder kirurgi og kemoterapi. Samlet overlevelse og tid til progression blev bestemt, hver målt fra diagnosetidspunktet (ved første operation). Progression blev defineret som objektiv indikation for tilbagefald. Varigheden af ​​den samlede overlevelse var intervallet mellem diagnose og død. Observation tid var intervallet mellem diagnose og sidste kontakt (død eller sidste opfølgning). Data blev censureret i sidste opfølgning for patienter uden tegn på tilbagefald, progression eller død.

Antistoffer

Seks kommercielt tilgængelige primære monoklonale antistoffer blev anvendt, specifik for ATM (Abcam, Boston, MA), BRCA1 (Biocare lab, Concord, CA), FANCD2 (Epitomics, San Francisco, CA), PARP (Abcam), p53 (Novacastra, Lică Microsystems, Buffalo Grove, IL), PTEN (Millipore, Billerica, MA ), og et polyklonalt antistof mod H2AX (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) (tabel 1). Detektion blev udført ved hjælp af avidin-biotin-peroxidase-kompleks metode (LASB-kit, DakoCytomation, Glostrup, Danmark).

Tissue Microarray Forberedelse

Paraffin-indlejrede væv fra 202 patienter med ovariecancer blev anvendt til konstruktion væv microarrays som tidligere beskrevet af Kononen et al. [13]. Kort fortalt, efter omhyggeligt at vælge den morfologisk repræsentative region fra hematoxylin-eosin (HE) sektion, 0,6 mm kerner blev udstanset fra de enkelte paraffinindlejrede blokke (donorblokke), og overført til modtageren paraffinindlejret blok (receiver blok). For at overvinde tumor heterogenitet, blev core biopsier udføres fra tre forskellige områder af hver tumor. Et afsnit blev farvet med H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Patient karakteristika ved baseline er sammenfattet i tabel 2. I alt 186 202 patienter blev undersøgt. Gennemsnitsalderen for den undersøgte population var 62 år (spændvidde 33-89) og median follow-up for tilbagefald var 22 måneder (interval 20 dage til 3 år). Som forventet, var størstedelen af ​​patienterne dårligt differentieret, grad 3 kræftformer (161/186, 86,6%), stadie III eller IV sygdom (174/186, 93,5%), og serøs histologiske (164/186, 88,2%). Ved operationen havde 59 patienter ingen residual sygdom, mens 125 patienter havde mindst minimal residual sygdom. Alle patienter fik platinbaseret første linje kemoterapi. Den mediane skønnede samlede overlevelse for alle patienter var 40,7 måneder (95% CI, 36.8-45.0 måneder). Den efterladte mellem patienter med fravær af residual tumor (58,1%) og tilstedeværelse af resterende tumor (59,7%) var ens.

Angivelse af DNA reparation proteiner i epitelial ovariekræft

protein udtryk for ATM, FANCD2, PARP, PTEN, H2AX, BRCA1 og p53 i epitelial æggestokkene tumor prøver blev undersøgt ved immunocytokemi og deres sammenslutninger med ovariecancer tilbagefald i 3 år er opsummeret i tabel 3. PARP var positiv i 111 (60%) af tilfældene, FANCD2 var positiv i 68 tilfælde (39%), H2AX var positiv i 59% og p53 i 55% af tilfældene. I modsætning hertil fleste tumorer var negative for BRCA1 (87%), PTEN (i 89%) og ATM (92%). Selvom det ikke er statistisk signifikant, KM anslået 3-årige gentagelse-fri overlevelse, for patienter med forhøjet PARP (56,5% vs. 67,5%) og høj FANCD2 (55,5% vs. 66,9%) var mere end 10% lavere end deres lave farvning modstykker. Patienter med høje niveauer af PARP og /eller FANCD2 var mere tilbøjelige til også har høj p53, 66% i både positiv, 53% i enten positiv, og 43% i både negativ blev fundet har positive p53 (p for trend = 0,01, figur 1). Samlet set udtryk for enten FANCD2 eller PARP blev observeret i 35% af prøverne. Co-ekspressionen af ​​PARP og FANCD2 blev påvist i 56 af 173 (32%) prøver. Høj ekspression af PARP, FANCD2 og BRCA1 var signifikant forbundet med hinanden, mens ingen sammenhæng mellem BRCA1 og p53 blev fundet (data ikke vist).

associering mellem PARP, FANCD2, og P53. Patienter med positiv PARP eller positiv FANCD2 var mere tilbøjelige til at have en positiv P53. Patienter positive for både PARP og FANCD2 var statistisk mere tilbøjelige til at plette positive for P53.

Korrelation af FANCD2 og PARP Expression med kliniske resultater

Patienterne blev delt i fem gensidigt eksklusive grupper baseret på deres ekspression af PARP, FANCD2, og p53 (figur 2). Prøver farves negative for alle tre proteiner i 31 patienter (18%), positive for p53 alene i 51 patienter (30%), og positiv for FANCD2 og PARP kun i 19 patienter (11%). Over 40% af patienter med positiv PARP og /eller FANCD2 havde p53-protein-overekspression, herunder 37 (22%) med overekspression af alle 3-proteiner, og 32 (19%) med p53 og PARP eller FANCD2 overekspression. KM anslået 3-årige gentagelse-fri overlevelseskurver for disse gensidigt udelukkende grupper af p53, PARP og FANCD2 vises i figur 3, og virkningen af ​​den BRCAness profil på tilbagefald-fri efterladte er vist i tabel 4. Forskelle i overlevelse mere end blev observeret 10% ved 12 måneder og næsten 20% ved 24 måneder mellem gruppen med positiv farvning for alle tre proteiner (p53, PARP og FANCD2) og gruppen med alle tre negativ farvning. Overlevelsen trended mod at være kortere i alle tre positive grupper sammenlignet med de andre grupper, selv om dette ikke var statistisk signifikant i denne lille stikprøve (figur 3A). Vi yderligere anslået 3 års gentagelse-fri overlevelse kurver mellem patienter med høje niveauer af alle tre proteiner (p53, PARP, FANCD2) og “andre” patienter som vist i figur 3B. Patienter med alle høje niveauer var mere tilbøjelige til at have tidligere tilbagefald inden for 3 år i forhold til alle andre patienter (p = 0,03). Efter 12 måneder efter diagnosen, gentagelse overlevelse var 81% for patienter med alle positive niveauer af PARP, FANCD2 og p53, mens de resterende patienter havde en gentagelse overlevelse på 92%. På 18 måneder, gentagelse overlevelse var 64% for gruppen med alle tre positive proteiner og 81% for alle andre, og den kumulative gentagelse incidensrate var 16,5% for patienter med alle høje niveauer af PARP, FANCD2 og p53 i forhold til 31,8% for de andre patienter. Patienter med samtidige høje niveauer af PARP, FANCD2 og p53 var dobbelt så tilbøjelige til at have tilbagefald inden for 3 år, efter justering for alder og kræft status på tidspunktet for diagnosen (tabel 4). blev regnskabsmæssigt efter multivariat analyse Den potentielle effekt af resterende tumor og andre baseline kliniske faktorer på tidlig recidiv. Især blev tilstedeværelsen af ​​resterende tumor ikke forbundet med recidiv. Men patienter med residual tumor efter første operation tendens til at have en positiv PARP, FANCD2, og P53 udtryk sammenlignet med gruppen uden residual tumor (26% vs. 14%, p = 0,07).

Fordeling af fem udelukker hinanden grupper af P53, PARP, og FANCD2. 37 patienter (22%) var positive for alle tre af proteinerne.

Kaplan-Meier anslået 3-årige gentagelse-fri overlevelse kurver. A: Ingen forskel i recidiv overlevelse, når hver af de 5 gensidigt udelukkende grupper ved ekspression af PARP, FANCD2, og P53 blev undersøgt uafhængigt af hinanden. B: Patienter positive for alle tre PARP, FANCD2, og P53 havde lavere recidiv overlevelse sammenlignet med patienter, der ikke er positive for alle tre

I denne undersøgelse vi definerede platin resistent sygdom som. sygdom tilbagevendende inden for 12 måneder primær behandling afslutning, men erkender samtidig, at jo mere standard definition ville markere platin modstand som tilbagefald efter 6 måneder. Derfor Figur 4 udforsker den samtidige ekspression af PARP, FANCD2 og P53 i patienter med og uden 6-måneders og 12 måneders tilbagefald. Blandt de 4 patienter, som havde tilbagefald inden for 6 måneder, 2 (50%) havde alle 3 positive, mens 34 ud af 162 (21%) uden tilbagefald havde alle 3 positive niveauer. Blandt de 17 patienter, der gik igen inden for det første år af diagnose, ca. 41% (7/17) havde tumorer med høje niveauer af alle 3 proteiner, sammenlignet med 19% (29/149) med alle tre positiv på ingen gentagelse (P = 0,04). Derfor er tidlig gentagelse, som er repræsentativ for platin resistent sygdom, synes at være præget af samtidige høje niveauer af PARP, FANCD2 og p53.

associering mellem positiv P53, PARP, og FANCD2 i patienter med og uden tidlig recidiv . Patienter med tidlig recidiv på både 6 og 12 måneder efter diagnosen var langt mere tilbøjelige til at have høje niveauer af alle 3 proteiner (50% efter 6 måneder og 41,2% på 12 måneder).

Diskussion

for nylig rolle af DNA reparation gener og proteiner i æggestokkræft, begrebet BRCAness af ovariecancer samt mekanismen for syntetisk letalitet er opstået som afgørende for forståelsen af ​​kræft i æggestokkene patogenese og veje til nye behandlinger [7], [8]. Som 20% af høj kvalitet serøse sporadiske ovariecarcinomer har BRCA1 og BRCA2 mutationer, har rollen som HR i kræft i æggestokkene blevet veletableret [15], [16]. Men mange arvelige og sporadiske æggestokkene ikke i besiddelse af BRCA mutationer eller ændret BRCA udtryk og dermed vi begrundet, at tab af andre HR proteiner kan bidrage til kræft i æggestokkene. Faktisk epigenetisk inaktivering af FANCF via promotor methylering [17] og et lavt FANCD2 [18] er tidligere blevet påvist i ovariecancer. Vi yderligere begrundede, at overekspression af forskellige HR proteiner kan tegne sig for erhvervet platin-modstand og derfor kan bruges som en potentiel skærm til (i) identificere patienter med en højere risiko for recidiv og (ii) identificere nye terapeutiske mål. For at måle BRCAness (dvs. HR) profil af sporadiske ovariecancere, anvendte vi immuncytokemi (ICH) at undersøge protein ekspression af DNA-skade respons proteiner FANCD2, BRCA1, PARP, H2AX og pengeautomat, samt PTEN og p53, tumorsuppressor gener, der også har en funktion i at bevare genomisk stabilitet ved at indgå i DNA-reparation [19] – [25]. i et panel af sporadiske ovariecarcinomer

Så vidt vi ved, har der ikke været nogen forudgående systematisk analyse af ATM og H2AX ekspression i ovariecancere. Her fandt vi, at proteiner blev udtrykt i 46% og 59% af vores prøver henholdsvis, hvilket kan indikere deres potentielt kompenserende udtryk i HR manglende celler.

Støtte rolle p53 og PTEN som tumorsuppressorer, flertallet af ovariecarcinomer testede var positive for p53 (55%), som antistoffet detekterer både vildtype og muterede former af p53, og negativ for PTEN ekspression (89%). Disse resultater svarer til andre undersøgelser med fremskredne kræftformer [21] – [22].

Interessant, fandt vi, at 86,7% af tilfældene havde negativ BRCA1 ICH. De fleste af de tidligere undersøgelser på BRCA1-mangel i sporadisk ovariecancer har fokuseret på mutationsanalyse, methylering undersøgelser, og genekspression, med kun få immuncytokemiske undersøgelser. En nylig rapport fra Skytte et al. afslørede negativ BRCA ICH i kun 20% af ovariecancere [26]. Disse forskelle kan forklares ved anvendelse af forskellige antistoffer til påvisning af BRCA protein [27]. I virkeligheden, i en sammenlignende undersøgelse af 84 tilfælde med sporadisk brystkræft med fire forskellige anti-BRCA-antistoffer, Al-Mulla et al. detekteret BRCA1 protein ekspression tab i 83% af tilfældene under anvendelse af samme BRCA antistof AB-1, mod den N-terminale epitop [28]. I NCIC undersøgelse, som korrelerede BRCA1 protein ekspression ved ICH med tilsvarende kliniske data, blev 251 ovariecancer prøver analyseret under anvendelse af et monoklonalt muse BRCA1 antistof (MS110, Calbiochem, Tyskland) og 65% af tumorerne udviste ingen farvning eller meget mild farvning [29 ]. Antistoffet anvendt i vores studie var forskellig fra antistofferne anvendt i de tidligere undersøgelser. På grund af den lille prøvestørrelse i vores undersøgelse og ligeledes i NCIC undersøgelsen, vores scoring grupperet farvningsresultaterne af fire kategorier til negativ (ingen eller svag) og positive (moderat eller stærk) baseret på farvningsintensitet. Det er derfor fortsat nødvendigt, at fremtidige undersøgelser klart skitsere retningslinjerne for BRCA1 farvning og scoring i undersøgelser af denne markør. Alligevel tabet af BRCA1 i de fleste tumorer i vores undersøgelse koblet med den forøgede ekspression af PARP i de fleste cancere (nævnt nedenfor) tyder på, at PARP opregulering kan være en kompenserende mekanisme, ved cancerceller til at modstå platin-terapi-induceret død .

Vores resultater med PARP er også i overensstemmelse med tidligere undersøgelser. Vi fandt høj ekspression af PARP i 60% af enheder, der ligner tidligere rapporter tyder positiv PARP proteinfarvning i 76% af ovariecarcinomer [26]. Moderat FANCD2 farvning blev fundet i de fleste (85%) fase I serøse carcinomer i æggestokkene [Pejović, upublicerede data], mens der i denne serie finder vi, at 40% af avancerede serøse carcinomer overudtrykker FANCD2. Således overekspression af FANCD2 foruden PARP kan øge kapaciteten af ​​celler til at reparere DNA dobbelt- og enkeltstrenget strengbrud bidrager til platinmodstandstermometer.

Synergi mellem PARP, FANCD2 og p53-protein-ekspression er en af ​​den slående resultater i vores studie. Tumorer med høj ekspression af PARP og /eller FANCD2 var mere tilbøjelige til at vise overekspression af p53. Proteinprofilen defineret ved høj ekspression af alle tre proteiner PARP, FANCD2, og p53 er forbundet med en høj risiko for tilbagefald. Ikke kun var recidivraten til tre år dobbelt så høj i denne gruppe, men det er særligt bemærkelsesværdigt, at over halvdelen af ​​patienterne tilbagevendende inden for de første 12 måneder efter primær behandling (platin resistent sygdom) havde signifikant forhøjet ekspression af disse tre proteiner. Denne undergruppe af patienter med særlig vanskelig at behandle kræft i æggestokkene ikke tidligere er blevet identificeret af protein eller andre molekylære profilering. Således er disse resultater give både identifikation af kvinder større risiko for tilbagefald og foreslå potentielle terapeutiske mål. For nylig blev der lovende resultater rapporteret i en klinisk fase II forsøg med PARP-inhibitor BSI-201 (iniparib) i kombination med gemcitabin og carboplatin i 19 patienter med platin resistente ovariecancer [30].

Vores undersøgelse har flere begrænsninger . Først, selvom vi undersøgte 186 patienter, er det stadig en begrænset stikprøve for alle kliniske sammenhænge undersøgte. For det andet, har patienter, der er BRCA1 og BRCA2 mutation luftfartsselskaber ikke blevet identificeret i denne undersøgelse. De strenge retningslinjer for prognostiske undersøgelser med anvendelse af immuncytokemi ved hjælp af standardiserede kriterier stadig under udvikling. Også undersøgte vi kun en delmængde af DNA-reparationsmekanismer proteiner, mens optagelsen af ​​andre proteiner involveret i HR såsom ATR, CHK2 eller RAD51, og funktionelle studier af RAD51 foci formation for at vurdere følsomheden af ​​disse celler til PARP (og FANCD2) inhibering er øjeblikket i gang.

Endelig mens vi mener, at de vigtigste resultater af denne undersøgelse er (i) identifikation af en BRCAness profil, der ikke er forbundet med BRCA1 og (ii) forening af denne triple-positive kræft i æggestokkene ( FANCD2 + /PARP + /P53 +) med meget tidlig tilbagevenden af ​​kræft i æggestokkene, og derfor platin modstand. Disse patienter kan have gavn af dobbelt hæmning af FANCD2 og PARP og /eller små molekyler rettet mod muteret p53. Faktisk inhibering af FA /BRCA pathway i sporadiske cancere hos forskellige forbindelser, herunder circumin, har vist sig at sensibilisere cancertilfælde platinstoffer [31]. Således kan kombineret behandling af FA /BRCA pathway hæmmere og PARP-inhibitorer allerede i kliniske forsøg være en effektiv behandling for patienter med tilbagefald, som er identificeret at overudtrykke FANCD2 og PARP.