PLoS ONE: TAE226, en Bis-anilino pyrimidinforbindelse, Hæmmer EGFR-mutantkinasen Herunder T790M Mutant til Vis Anti-tumor effekt på EGFR-Mutant Ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

TAE226, en bis-anilino pyrimidinforbindelse, er blevet udviklet som en hæmmer af fokal adhæsionkinase (FAK) og insulin-lignende vækstfaktor-i receptor (IGF-IR). I denne undersøgelse undersøgte vi effekten af ​​TAE226 på ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), især med fokus på

EGFR

mutationsstatus. TAE226 var mere effektiv mod celler med mutant EGFR, herunder T790M mutant, end mod celler med vildtype-en. TAE226 fortrinsvis hæmmede phospho-EGFR og dens downstream signalering mediatorer i cellerne med mutant EGFR end hos dem med vildtype-en. Phosphorylering af FAK og IGF-IR blev ikke hæmmet ved den koncentration, hvor udbredelsen af ​​

EGFR

-mutant celler blev hæmmet. Resultater af

in vitro

bindingsassay angivet signifikante forskelle i affiniteten for TAE226 mellem vildtype og L858R (eller delE746_A750) mutant, og den reducerede affinitet af ATP til L858R (eller delE746_A750) mutanten resulterede i god reaktionsevne L858R (eller delE746_A750) mutant celler til TAE226. Af interesse er L858R /T790M eller delE746_A750 /T790M mutant forbedret bindingsaffinitet for TAE226 forhold til L858R eller delE746_A750 mutant, hvilket resulterer i effektiviteten af ​​TAE226 mod T790M mutantceller trods for T790M-mutationen genoprette ATP affinitet for mutanten EGFR tæt på at for vildtypen. TAE226 viste også højere affinitet på ca. 15-fold for L858R /T790M mutant end for vildtypen en efter kinetisk interaktion analyse. Den anti-tumor virkning mod

EGFR

-mutant tumorer, herunder T790M-mutationen blev bekræftet i musemodeller uden nogen signifikant toksicitet. Sammenfattende viste vi, at TAE226 hæmmede aktivering af mutant EGFR og udviste anti-proliferativ aktivitet mod NSCLCs bærer

EGFR

mutationer, herunder T790M mutation

Henvisning:. Otani H, Yamamoto H, Takaoka M, Sakaguchi M, soh J, Jida M, et al. (2015) TAE226, en Bis-anilino pyrimidinforbindelse, Hæmmer EGFR-mutantkinasen Herunder T790M Mutant til Vis Anti-tumor effekt på

EGFR

-Mutant ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 10 (6): e0129838. doi: 10,1371 /journal.pone.0129838

Academic Redaktør: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italien

Modtaget: August 19, 2014 Accepteret: 13. maj 2015; Udgivet: 19 juni 2015

Copyright: © 2015 Otani et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev understøttet af en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning fra Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan (tilskud nummer : 18790993 til ST), https://www.mext.go.jp/english/. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Novartis Pharma AG ydet støtte i form af løn til forfattere SH og EK, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Selvom forfatterne af dette manuskript (SH og EK) er medarbejdere i Novartis Pharma AG, ændrer det ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker om datadeling og materialer. Novartis Pharma AG ydet støtte i form af løn til forfattere SH og EK, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion.

Introduktion

Lungekræft er den hyppigste årsag til kræft død på verdensplan [1]. Lungekræft er opdelt i to store histologiske kategorier, ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) og småcellet lungecancer. Trods store bestræbelser på at forbedre overlevelsen af ​​patienter med lungecancer, en tilfredsstillende overlevelsesrate endnu ikke blevet opnået, fordi de fleste patienter til stede med en fremskreden sygdom stadium og deres tumorer udviser en iboende resistens over for konventionel [2] kemoterapi. For at forbedre prognosen for patienter med lungekræft, mange kliniske og basale undersøgelser, herunder translationel forskning, er blevet gennemført [3, 4].

Molekylær målretning terapi baseret på molekylære ændringer i kræft er en lovende strategi for behandling af lungekræft og andre maligne tumorer. For eksempel 4-anilinoquinazolin inhibitorer, såsom gefitinib og erlotinib, er designet til at inhibere tyrosinkinasedomæne af epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR), som er overudtrykt i NSCLC; sådanne inhibitorer øjeblikket anvendes til behandling af NSCLC [5-8]. Af særlig interesse, disse EGFR tyrosinkinasehæmmere (EGFR-TKI’er) producerer drastiske anti-tumor effekt mod NSCLCs transporterer fælles

EGFR

mutationer, små deletioner ved exon 19 og L858R mutation i exon 21. Ud over disse EGFR-TKI -følsom mutationer, er T790M mutation ved exon 20, kendt som EGFR-TKI-resistent mutation [9, 10]. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at fælles

EGFR

mutationer i tyrosinkinasedomænet er hyppigere hos patienter med adenocarcinom histologi, en aldrig ryge historie, og et østasiatisk etnicitet [11-13]. Hyppigheden af ​​fælles

EGFR

mutation i adenocarcinom, som afhænger af patienternes baggrund, spænder fra 15 til 45%, hvilket tyder på, at den fælles

EGFR

mutation er en hyppig og vigtig begivenhed af lunge adenokarcinomer [11, 13, 14]. I modsætning hertil iboende T790M mutationer er meget sjældne [15]. Imidlertid er T790M mutationer findes i ca. 50% tilfælde blandt NSCLCs der erhvervede resistens over for EGFR-TKI [16].

Udover EGFR-TKI’er målretning EGFR protein, forskellige former for forbindelser med små molekyler er blevet udviklet til at målrette kræft -specifikke molekylære ændringer. TAE226, en bis-anilino pyrimidinforbindelse, konkurrerer med ATP for fokal adhæsion kinase (FAK) og insulin-lignende vækstfaktor-I receptor (IGF-IR). Denne forbindelse angiveligt inhiberer celleproliferation, migration og invasion af mange cancere, såsom gliomer, Barretts esophageal adenocarcinom, ovarie-, tyktarms- og brystcancer [17-22].

FAK er en ikke-receptortyrosinkinase, at transducerer signaler fra integrinreceptor og deltager i flere cellefunktioner nødvendige for celleproliferation, overlevelse, bevægelighed og invasion [23]. IGF-IR er en transmembran receptor-tyrosinkinase, der deltager i signalering kaskader, der fører til aktivering af både AKT og mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) [24]. Disse tyrosinkinaser vides at være overudtrykt i mange maligne tumorer, herunder nogle NSCLCs og spille en onkogen rolle i cancerceller [25-27]. Disse fakta og baggrund opfordrede os til at undersøge anti-tumor effekt af TAE226 i NSCLC, og vi uventet, at TAE226 helst hæmmer udbredelsen af ​​

EGFR

-mutant NSCLC cellelinjer, herunder T790M mutant sammenlignet med

EGFR

-Wild-type NSCLC cellelinjer.

i denne undersøgelse beskriver vi den anti-tumor effekt af TAE226 på

EGFR

-mutant celler

in vitro

og

> og undersøgte anti-tumor mekanisme TAE226 i

EGFR

-mutant celler.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af Animal Care og brug Udvalg Okayama University (Permit nummer: OKU-2.007.232). Alle operation blev udført under ketamin og xylazin anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Reagenser

NVP-TAE226 blev venligst stillet til rådighed af Novartis Pharma AG (Basel, Schweiz). ZD1839 (gefitinib) blev venligst leveret af AstraZeneca (Wilmington, DE). Stamopløsningen af ​​disse forbindelser blev henholdsvis rekonstitueret i koncentration på 20 mM og 10 mM med dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) og opbevaret ved -20 ° C indtil anvendelse til

in vitro

eksperimenter

antistoffer

de primære antistoffer mod følgende proteiner blev anvendt til western blotting:. polyklonale anti-EGFR, phospho-EGFR (Tyr1068), IGF-IRβ, phospho-IGF -IRβ (Tyr1131), AKT, phospho-AKT (Ser473), p44 /p42 mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK), og phospho-p44 /P42 MAPK antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Monoklonalt anti-fokal adhæsionkinase (FAK), blev phospho-FAK (pY397) antistoffer købt fra Biosource (Berkeley, CA), og anti-actin-antistof, anvendes som ligeværdige loading kontroller blev indkøbt fra Sigma-Aldrich.

cellelinier og cellekultur

for at vurdere virkningen af ​​TAE226, følgende 17 NSCLC cellelinjer, en brystcancer-cellelinie (SK-BR-3), en gastrisk cancercellelinie (MKN45) og HEK -293T cellelinje blev brugt til

in vitro

og

in vivo

eksperimenter. HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820, NCI-H1819, NCI-H1666, NCI-H1395, NCI-H2228, NCI-H1648, NCI-H1993, NCI-H838 og NCI-H1299-cellelinjer var venligst stillet til rådighed af Dr. Adi F. Gazdar (University of Texas Southwestern Medical center på Dallas, Dallas, TX, USA), der etablerede de NSCLC cellelinjer med Dr. John D. Minna [28-30] med undtagelse af NCI-H3255, som blev etableret af Dr. Bruce E. Johnson [11, 31]. Disse cellelinjer blev vist sig at have individuelle genetiske oprindelse af Powerplex 1.2-systemet (Promega, Madison, WI) ved University of Texas Southwestern Medical Center på Dallas, før vi opnåede disse cellelinjer [29]. PC-9 (katalog nummer: 37012) blev indkøbt fra Immuno-Biological Laboratories (Takasaki, Japan). MKN45 (katalog nummer: JCRB0254) blev købt fra japansk Indsamling af Research Bioressourcer Cell Bank, National Institute of Biomedical Innovation (Ibaraki, Japan). SK-BR-3 (katalognummer: HTB-30), A549 (katalognummer: CCL-185), Calu-3 (katalognummer: HTB-55) og HEK-293T (katalognummer: CRL-3216) blev købt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA). Den gefitinib-resistente PC-9 cellelinje (RPC-9) blev oprettet ved en af ​​forfatterne (K.K.) [32]. PC-9, HCC827, HCC4006, NCI-H3255, NCI-H1975, NCI-H820 og RPC-9 har EGFR-TKI’er-følsomme mutationer. Desuden, NCI-H1975, NCI-H820 og RPC-9 cellelinier har også T790M EGFR-TKI’er-resistent mutation. Detaljerne i genetiske ændringer i disse cellelinjer med undtagelse af HCC4006 (delL747_A750, P ins) er og NCI-H820 (delE746_E749 /T790M) vist i tabel 1.

NCI-H3255 blev dyrket i ACL- 4 medium [33, 34] suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og de øvrige cancercellelinier blev opretholdt i RPMI-1640 medium (Sigma-Aldrich) suppleret med 10% FBS, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich). HEK-293T-cellelinien blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Sigma-Aldrich) suppleret med 10% FBS. Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C i en fuldt befugtet atmosfære af 5% CO

2 i luft. Alle

in vitro

forsøg blev udført med omkring 80% sammenflydende kulturer.

Effekten af ​​TAE226 på IGF-IR efter serum-udsultning

For at vurdere effekten af ​​TAE226 på IGF-IR under ligand-fri tilstand, analyserede vi den inducerede IGF-IR phosphorylering efter serum-udsultning efterfulgt af TAE226 behandling. Efter cellelinjer var serum-udsultet i tre timer og behandlet med øget koncentration af TAE226 i to timer, blev de stimuleres af 100 ng /ml IGF-I rekombinant (Sigma-Aldrich) i 15 minutter og derefter blev analyseret ved western blotting.

Bestemmelse af lægemiddelfølsomhed til TAE226 og gefitinib i forskellige cellelinier

Drug følsomhed blev bestemt ved en modificeret MTS assay med CellTiter 96 Aqueous One Solution-reagens (Promega, Madison, WI). Celler blev generelt podet på plader med 96 brønde ved en densitet, der ville udbytte 80% sammenløb ved afslutningen af ​​eksperimentet, som varierer efter hver cellelinje 3000-4000 per brønd. Derefter blev mediet i brøndene erstattet med medium indeholdende fortyndede lægemiddelopløsninger af TAE226 eller gefitinib i en 4-log rækkevidde eller komplet medium, som blev fordelt i 8-replikere brønde. Celler blev inkuberet i nærvær af hver koncentration af TAE226 i 48 timer og af gefitinib i 72 timer ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 i luft. Efter dette blev MTS farvestof tilsat til hver brønd. Kulturerne blev inkuberet i endnu 1 time ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Optiske tætheder af prøverne blev målt ved 490 nm under anvendelse af Immuno Mini NJ-2300 (Nalge Nunc International KK, Rochester, NY). Mean optisk densitet ved hver koncentration lægemiddel blev beregnet efter kassere de højeste og laveste værdier. De antitumorvirkninger af TAE226 og gefitinib for hver cellelinje blev vist med hensyn til inhiberende koncentration på 50% (IC

50), som blev bestemt ved at afbilde grafen for procentdelen af ​​cellevækstinhibering (Y-akse) versus medikamentkoncentration (X-aksen). IC

50 værdier blev udtrykt som gennemsnit og standardafvigelser. Analyserne blev gentaget, indtil standardafvigelsen blev mindre end middelværdien. Salg

Western blot-analyse

Celler blev dyrket i 60 mm skåle natten over, og derefter, behandlet med DMSO eller hver koncentration af TAE226 og gefitinib. Derefter blev de vasket med koldt PBS og lyseret i 1 × cellelysebuffer [20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 150 mM NaCl, 1 mM Na

2EDTA, 1 mM EGTA, 1% Triton, 2,5 mM natriumpyrophosphat, 1 mM beta-glycerophosphat, 1 mM Na

3VO

4, 1 pg /ml leupeptin] (Cell signalering Technology) suppleret med Complete, Mini (Roche, Basel, Schweiz) til at udtrække protein. Efter proteinkoncentrationen blev målt, blev lige store mængder af totalt protein (30 ug) separeret ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Proteinerne på membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med de primære antistoffer. De følgende sekundære antistoffer blev anvendt: ged antikanin eller antimus IgG-konjugeret peberrodsperoxidase (HRP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). For at påvise specifikke signaler blev membranerne inkuberet ved ECL plus Western blot Detection Reagenser (Amersham Biosciences UK Limited, Buckinghamshire, UK).

In vitro

bindende assay af varianten EGFR-TK-domæner

Den bindende evne TAE 226 for variant EGFR-TK-domæner blev undersøgt med

in vitro

bindingsanalyse. Variant EGFR-TK-domæner bestod af vildtype, delE746_A750, L858R, delE746_A750 /T790M, og L858R /T790M. Den detaljerede fremgangsmåde er beskrevet i S1 Method.

Kinetisk interaktion analyse af TAE226 og gefitinib mod vildtype EGFR og L858R /T790M EGFR mutant

For at karakterisere den mekanisme af virkningen af ​​TAE226 på EGFR udførte vi kinetisk interaktion analyse af TAE226 og gefitinib (som en kontrol) mod vildtype EGFR og L858R /T790M EGFR-mutant af Proteros Reporter Displacement Assay (Proteros BIOSTRUCTURES GmbH, Munchen, Tyskland), der blev anvendt til bestemmelse af følgende parametre: K

d,

k

på,

k

off og opholdstid. Den Proteros Reporter Displacement Assay blev udført som tidligere [35, 36] beskrevet. Detaljeret fremgangsmåde blev beskrevet i S1 Method.

Animal xenotransplantat musemodel

I dette forsøg anvendte vi BALB /c-nu /nu nøgne hunmus ved 4-6 ugers alderen, der blev købt fra Charles River Laboratories Japan, Inc (Yokohama, Japan). De blev holdt under specifik patogenfrie betingelser i overensstemmelse med retningslinjerne i Animal Care og brug Udvalg på Okayama University. PC-9 og RPC-9 cellelinjer (4,0 × 10

6/100 pi) blandet med 100 pi Matrigel (Corning Life Sciences, Tewksbury, MA) blev inokuleret subkutant i 24 nøgne mus [4 forskellige grupper (n = 6 i hver gruppe) med koncentrationen af ​​TAE226], som havde ca. 20 g legemsvægt. TAE226 blev fortyndet ved methylcellulose i koncentrationen af ​​0 mg /kg (vehikel), 30 mg /kg, 60 mg /kg og 90 mg /kg. Efter tumorvolumen har nået 200-400 mm

3, TAE226 blev administreret oralt til hver nøgen mus en gang dagligt i serielle 14 dage. Hver tredje dag, blev kropsvægten af ​​mus og storaksen og lilleaksen af ​​hver tumor målt og beregnet tumorvolumen ved hjælp af følgende formel; (Storakse) × (lilleaksen)

2 × 1/2 [37, 38]. For de 14 dage blev tumor volumen, tumor vækst og kropsvægt analyseres som et gennemsnit af hver gruppe.

Statistisk analyse

Studerendes

t

test blev anvendt at sammenligne data mellem to grupper. Data blev repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD).

P

0,05 blev betragtet som værende statistisk signifikant.

Resultater

Anti-proliferative effekt af TAE226 på NSCLC cellelinjer

Vi evaluerede anti-tumor effekt af TAE226 bruge en MTS assay i 15 NSCLC cellelinjer, en brystcancer-cellelinie og en gastrisk cancer cellelinje (tabel 1). Antal MTS assays og hver IC

50 værdien opnået fra uafhængige assays er vist i S2 tabel. Tre NSCLC cellelinier (PC-9, HCC827, og NCI-H3255) med kun EGFR-TKI-sensitive

EGFR

mutationer og to NSCLC cellelinier (RPC-9 og NCI-H1975) med både TKI-følsomme og TKI-resistente

EGFR

mutationer viste lignende IC

50 værdier, der spænder fra 0,086 til 0,31 uM. I modsætning hertil IC

50 værdier for

EGFR

vildtype NSCLC cellelinier (n = 10: varierede fra 0,28 til 6,2 uM) var højere end

EGFR-

mutant NSCLC cellelinjer selv om to

BRAF

mutant cellelinjer og en

EML4

–

ALK

translokeres cellelinje viste mellemliggende niveau af IC

50-værdier (interval, 0,28 til 0,48 uM). Disse resultater antydede, at TAE226 var mere effektivt i

EGFR

-mutant cellelinier, uanset tilstedeværelsen af ​​TKI-resistente

EGFR

T790M mutation, end i

EGFR

vild -typen cellelinjer, især som ikke har

BRAF

eller

EML4

-.

ALK

ændringer

Vi undersøgte også den anti-tumor effekt af gefitinib mod 14 NSCLC cellelinier (tabel 1). Tre NSCLC cellelinjer huser kun EGFR-TKI-sensitive

EGFR

mutation var følsomme over for gefitinib (IC

50 værdier blev varierede fra 0,0014 til 0,0028 uM), mens andre NSCLC cellelinjer huser vildtype

EGFR

(n = 9) eller TKI-resistente

EGFR

mutation (n = 2) var resistente (IC

50 blev varierede fra 5.3 til 32,6 uM). Disse data var i overensstemmelse med de tidligere rapporter [10, 28].

Deregulering af FAK, IGF-IR, og EGFR-relaterede proteiner efter TAE226 behandling i NSCLC cellelinjer

Vi undersøgte effekt af TAE226 på FAK, IGF-IR, og EGFR-relaterede proteiner ved hjælp af 6 cellelinier (PC-9, HCC827, NCI-H1975, RPC-9, NCI-H1299, og NCI-H1819). Phosphorylering af FAK (Thy397) og IGF-IR (Tyr1131), der er mål for TAE226, blev ikke signifikant inhiberet op til en koncentration på 5 uM i alle 6 testede cellelinjer (Fig 1). For FAK, blev phosphorylering inhiberes ved en koncentration på 20 uM (data ikke vist). For IGF-IR, blev phosphorylering fuldstændigt inhiberet af TAE226 efter serum-udsultning i alle 4 testede cellelinjer (PC-9, RPC-9, NCI-H1299, og NCI-H1819), uanset ligand stimulation (S1 Fig). Dette resultat viste, at TAE226 hæmmede phoshorylation af IGF-IR som forventet.

NSCLC cellelinier med EGFR-TKI-følsomme (exon 19 sletninger) mutation (PC-9 og HCC827), cellelinjer med både EGFR- TKI-følsomme og resistente (T790M) mutationer (NCI-H1975 og RPC-9), og cellelinier med vild type EGFR (NCI-H1299 og NCI-H1819) blev behandlet med TAE226 i flere koncentrationer og western blotting-analyse blev udført . De phosphoryleringer af FAK og IGF-IR ikke undertrykt i alle testede NSCLC cellelinjer. I modsætning hertil blev phosphoryleringer af EGFR og dens downstream proteiner, AKT og MAPK, undertrykt ved lavere koncentration af TAE226 i

EGFR

-mutant cellelinjer uanset tilstedeværelsen af ​​T790M mutation sammenlignet med

EGFR

-Wild-type cellelinier. Vi inkuberes membranen for Actin (42 kDa) efter vi inkuberet MAPK (42 og 44 kDa) og stripping buffer blev brugt til at membranen.

Af særlig interesse, phosphorylering af EGFR var overvejende hæmmet ved TAE226 i alle fire

EGFR

-mutant cellelinier (PC-9, HCC827, NCI-H1975, og RPC-9), uanset tilstedeværelsen af ​​TKI-resistente mutationer. Derudover phosphoryleringer af AKT og MAPK, som er nedstrøms molekyler af EGFR, blev også inhiberet i disse

EGFR

-mutant cellelinier. I modsætning hertil blev phosphoryleringer af EGFR, AKT, og MAPK ikke inhiberet i cellelinjer med vildtype

EGFR

(NCI-H1299 og NCI-H1819) (figur 1). Disse data antydede, at TAE226 kan have en stærkere virkning på mutant EGFR end vildtype EGFR.

Vi bekræftede ekspressionsniveauet for FAK, p-FAK, IGF-IR, og p-IGF-IR i cellelinier uden narkotika eksponering ved hjælp ti NSCLC cellelinier (

EGFR

-mutant cellelinjer, PC-9, HCC827, NCI-H3255, HCC4006, NCI-H1975, NCI-H820 og RPC-9;

EGFR

vildtype cellelinjer, NCI-H1819, NCI-H1299 og A549). Ingen signifikant forskel i ekspressionsniveauet af hver af proteinerne blev observeret blandt de cellelinier (S2 Fig).

Virkning af TAE226 på mutant EGFR-transficerede HEK-293T cellelinie

Vi undersøgte anti-proliferative effekt af TAE226 på to HEK-293T-cellelinier stabilt transficeret med vildtype-EGFR eller mutant EGFR (L858R), som vi tidligere havde etableret [39]. HEK-293T med mutant EGFR var mere følsom over for gefitinib end HEK-293T med vildtype-EGFR (IC

50 værdier var 0,38 ± 0,087 og 18,2 ± 3,9 pM, henholdsvis) (tabel 1). TAE226 udøvede en højere antitumorvirkning på HEK-293T med det mutante EGFR end på HEK-293T med vildtype-EGFR (IC

50 værdier var 0,41 ± 0,06 og 3,0 ± 0,11 uM) ( tabel 1). TAE226 inhiberede de phosphoryleringer af EGFR og AKT i HEK-293T celle med mutant EGFR men ikke i HEK-293T celle med vildtype-EGFR (S3 Fig). Disse resultater viste også, at TAE226 hæmmede væksten celle eller overlevelsen af ​​

EGFR

-mutant celler ved at undertrykke mutant EGFR protein.

Bindende affinitet TAE226 til mutant EGFR

For at vurdere bindingsaffiniteten af ​​TAE226 til EGFR kinaser, udførte vi en

in vitro

bindingsassay af varianten EGFR kinaser (fig 2). Supernatanten fraktion indeholdt EGFR-kinase, der ikke binder til perle-modificeret ATP på grund af interferens fra TAE226 (eller eksogen ATP). Det udfældede fraktion indeholdt EGFR-kinase, der var bundet til perle-modificeret ATP, hvilket indikerer, at TAE226 (eller exogent ATP) ikke interfererer med ATP-binding. Således bandet intensitet ved hver TAE226 (eller eksogen ATP) koncentration afspejler evne TAE226 (eller eksogen ATP) til at konkurrere med perle-modificeret ATP for EGFR kinaser.

A) fælles EGFR mutant kinaser og B ) T790M indeholdende EGFR mutantkinaser. De fem typer af EGFR kinaser, vildtype, exon 21 L858R mutation (L858R) eller exon 19 deletion (delE746_A750), T790M i tandem med L858R mutationen (L858R /T790M), og T790M i tandem med delE746_A750 (delE746_A750 /T790M) , som kompetitivt binder til ATP eller TAE226, blev ekstraheret og blev inkuberet med perlerne-modificerede ATP. TAE226 eller den rekombinante ATP blev tilsat for at konkurrere med perler-modificeret ATP for binding til EGFR-kinaser. EGFR-kinase binging med perlerne-modificerede ATP var til stede i udfældning, og EGFR-kinase binding med TAE226 (eller rekombinant ATP) var til stede i supernatanten. Western blotting blev udført for at detektere EGFR kinaser i hver komponent ved anvendelse af en HA-antistof. *, Ved en koncentration på 10 uM til ATP; ** Ved koncentration på 0,005 pM for TAE226.

Blandt variant EGFR kinaser, der blev testet (vildtype, L858R, delE746_A750, L858R /T790M og delE746_A750 /T790M), ingen forskel i mængderne af EGFR kinaser, der er bundet til perlen-modificerede ATP blev bemærket under kontrol tilstand (fig 2A og 2B). Exogent ATP svagt bundet til EGFR kinaser ved en koncentration på 1000 pM i alle de testede varianter (fig 2A). I modsætning hertil TAE226 begyndt at binde til vild type EGFR-kinase i en koncentration på 0,1 pM og ved lavere koncentrationer for mutante EGFR’er, hvilket indikerer, at TAE226 har en højere affinitet til EGFR kinaser end ATP. Vi vurderede bindingsaffiniteten af ​​TAE226 til EGFR varianter ved at sammenligne forholdet mellem semikvantificeret båndintensitet mellem supernatantfraktionen, og det udfældede fraktion ved 0,1 uM TAE226 blandt vildtype, L858R, eller delE746_A750 (S4A Fig). Kvantificering ved hjælp ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD) viste, at bindingsaffiniteten af ​​TAE226 var ca. 7,5 gange højere for begge mutante EGFR’er end med vildtype-EGFR (S4A Fig). Virkningen af ​​erhvervet T790M mutation på bindingsaffiniteten for TAE226 til fælles mutante EGFR kinaser (L858R eller delE746_A750) blev også evalueret ved en koncentration på 0,005 uM til TAE226 og 10 uM for ATP (figur 2B). Interessant nok bindingsaffinitet for TAE226 var højere i T790M indeholdende EGFR mutantkinaser (L858R /T790M eller delE746_A750 /T790M) end i almindelige EGFR mutante kinaser (L858R eller delE746_A750) (s4b Fig). Salg

Interaktion kinetik TAE226 og gefitinib med vildtype-EGFR og L858R /T790M EGFR-mutant

IC

50 og K

d-værdier for TAE226 og gefitinib mod vildtype EGFR og L858R /T790M EGFR-mutant blev vist i tabel 2. IC

50 og K

d-værdier for TAE226 var 0,326 pM og 0,163 pM i vild type EGFR og 0.0193 uM og 0,00966 uM i L858R /T790M EGFR mutant, hhv. Med hensyn gefitinib, der var 0,0244 uM og 0,0122 pM i vild type EGFR og 0,927 pM og 0,463 pM i L858R /T790M EGFR mutant, hhv. Gefitinib viste en højere affinitet på ca. 40 gange for vild type EGFR end for L858R /T790M EGFR-mutant. Tværtimod viste TAE226 højere affinitet på ca. 15 gange til L858R /T790M EGFR-mutant end for vildtype-EGFR. Værdierne for

k

på og

k

off kunne ikke beregnes i TAE226 for både type af EGFR og i gefitinib til L858R /T790M EGFR mutant grund af kort opholdstid ( 1,4 min).

Anti-tumor effekt af TAE226 på NSCLC mus xenograftmodeller

Baseret på vores

in vitro

data vi undersøgte den anti-tumor effekt af TAE226 på mus xenograftmodeller. Efter den subkutane tumor volumen af ​​de inokulerede PC-9 og RPC-9 cellelinier i nøgne mus havde nået et volumen på 200-400 mm

3 behandlede vi den nøgne mus med oral indgivelse af TAE226 (30 mg /kg , 60 mg /kg eller 90 mg /kg) eller methylcellulose som køretøj i 14 dage. Tumoren volumen og kropsvægt af både xenografter blev målt på dagen før oral administration af TAE226 og hver tredje dag derefter. Indlysende bivirkninger, herunder tab af kropsvægt, ikke forekomme i bilen-behandlede gruppe eller i de grupper, der blev behandlet med 30 mg /kg eller 60 mg /kg af TAE226, mens der blev observeret et tab af kropsvægt i mus behandlet med 90 mg /kg af TAE226. Tumorvolumenet i begge xenotransplantater faldt betydeligt over tid og i en dosis-afhængig måde i forhold til den vehikel-behandlede mus (figur 3). Endvidere begge xenografter af EGFR-TKI-sensitive (PC-9) og EGFR-TKI-resistente (RPC-9) cellelinier viste lignende antitumorvirkninger i respons til TAE226

in vivo

.

den orale indgivelse af TAE226 i 14 dage inhiberede signifikant tumorvækst af subkutant inokuleret mus xenotransplantater med PC-9 (exon19 deletion) eller RPC-9 (exon19 deletion og T790M mutation) ved hver dosis (30, 60 og 90 mg /kg). Desuden viste TAE226 lignende anti-tumor effekt på begge xenograftmodeller uanset tilstedeværelsen af ​​EGFR T790M mutation.

Diskussion

Som vist i forholdet mellem små EGFR-TKI og

EGFR

mutation [40], evne TAE226 til at konkurrere med ATP, hvilket resulterer i sin anti-tumor potentiale, er bestemt af to faktorer: 1) den bindende evne til TAE226 til mutant EGFR og 2) affinitet for ATP til mutant EGFR. Det er velkendt, at den affinitet for ATP er lavere til fælles EGFR mutanter end vildtype EGFR [40].

Der synes at være en anden vigtig faktor, der har stor indflydelse virkningerne af molekylære målretning narkotika på kræftceller . Ifølge begrebet “onkogen afhængighed”,

EGFR

-mutant cellelinjer er stærkt afhængige af mutant EGFR for celledeling og overlevelse [41]. Henviser årsagen til dårlig inhibering til FAK eller IGF-IR-aktivitet i NSCLC er ikke klart, vores resultater viste, at TAE226 stærkt hæmmet mutanten EGFR, sammenlignet med FAK og IGF-IR, i celler, der er “afhængige” mutant EGFR, resulterer i anti-tumor aktivitet af TAE226. Notatet var der nogle uoverensstemmelser mellem IC

50

in vitro

ikke-cellulær kinase assay og cellulære inhiberingsassay for nogle onkogener. Dette fænomen synes at kunne forklares ved begrebet “onkogen addition”, at graden af ​​afhængighed til bestemte onkogener kan være forskellige blandt tumorer og onkogener. IC

50 værdier for c-Src (0,91), HER2 (0,95), FGFR-1 (0,75), c-Met (0,16) og ALK (0,15), som ofte aktiveres i NSCLC, er mindre end for EGFR (1,7) (S1 Table, opdaterede data fra ref. 20), hvilket indikerer, at TAE226 også kan hæmme disse kinaser i tillæg til EGFR i NSCLCs, især hvis tumorer er “afhængige” til disse kinaser.

med hensyn til den mekanisme, hvormed T790M-mutationen menes at påvirke små molekyler TKI’er såsom gefitinib og erlotinib har T790M-mutationen blevet anset for at forårsage resistens ved sterisk blokerer bindingen af ​​TKI’er [9, 10, 42]. Desuden Yun og kolleger rapporterede, at en stigning i ATP affinitet er den primære mekanisme, hvormed T790M-mutationen forårsager resistens overfor TKI’er; mens den indre L858R mutation reducerer bindingsaffiniteten af ​​ATP med omkring 30 gange sammenlignet med vildtype-EGFR, indførelse af den yderligere T790M-mutationen genskaber bindingsaffiniteten af ​​ATP sammenlignelig med vildtype-EGFR [43]. Interessant, viste vores data, at IC

50 værdier af TAE226 for EGFR T790M i tandem med L858R (eller delE746_A750) mutant celler svarer til dem for EGFR L858R (eller delE746_A750) mutant celler, der giver kontrasterende resultater i forhold til IC

50 værdier af gefitinib for dem.