PLoS ONE: Exploring the Anti-Cancer aktivitet af Novel thiosemicarbazoner Genereret gennem kombination af Retro-Fragments: Dissektion af Kritiske struktur og aktivitet

Abstrakt

thiosemicarbazoner (TSC) er en interessant klasse af ligander, der viser en bred vifte af biologisk aktivitet, herunder anti-svampe, anti-virus og anti-cancer effekt. Vores tidligere undersøgelser har vist den potente

in vivo

antitumoraktiviteten af ​​hidtil ukendte TSC og deres evne til at overvinde modstanden mod klinisk anvendte kemoterapeutika. I den aktuelle undersøgelse blev 35 nye TSC af 6 forskellige klasser konstrueret ved hjælp af en kombination af retro-fragmenter, der vises i andre TSC. Derudover di-substitution ved terminalen N4-atom, som tidligere blev identificeret til at være kritisk for potent anti-cancer-aktivitet, blev bevaret gennem inkorporering af en N4-baserede piperazin- eller morpholinring. Den anti-proliferative aktivitet af de hidtil ukendte TSC blev undersøgt i en række forskellige cancer og normale celletyper. Navnlig forbindelser 1d og 3c demonstrerede den største lovende som anti-cancermidler med potent og selektiv antiproliferativ aktivitet. Struktur-aktivitets-relationer undersøgelser viste, at de chelatorer, der udnyttede “bløde” donoratomer, såsom nitrogen og svovl, resulterede i kraftig anti-cancer-aktivitet. Faktisk

N

,

N

,

S

donor atom sæt var afgørende for dannelsen af ​​redox aktive jernkomplekser, der var i stand til at mægle oxidation af ascorbat. Denne yderligere understreger den vigtige rolle, reaktiv ilt generation arter i mediering potent anti-cancer-aktivitet. Betydeligt, denne undersøgelse identificerede potent og selektiv anti-cancer aktivitet af 1d og 3c, der berettiger yderligere undersøgelse

Henvisning:. Serda M, Kalinowski DS, Rasko N, Potůčková E, Mrozek-Wilczkiewicz A, Musiol R, et al. (2014) Udforskning af Anti-Cancer aktivitet af Novel thiosemicarbazoner Genereret gennem kombination af Retro-Fragments: Dissektion af Kritiske struktur og aktivitet. PLoS ONE 9 (10): e110291. doi: 10,1371 /journal.pone.0110291

Redaktør: Ashley I. Bush, University of Melbourne, Australien

Modtaget: August 7, 2014 Accepteret: 10. september 2014 Udgivet: 16 Okt 2014

Copyright: © 2014 Serda et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information fil

Finansiering:. Forfatterne værdsat økonomisk støtte fra Twing og DoktoRIS ph.d.-stipendier, NCN (DEC-2011/01 /N /NZ4 /01.166, 2013 /09 /B /NZ7 /00423 og N405 /068.440), og det nationale center for forskning og udvikling, Warszawa (Organomet No: PBS2 /A5 /40/2014 tilskud). Dette arbejde blev også støttet af en Project Grant fra National Health og Medical Research Council (NHMRC) Australien til katastrofeforebyggelse [Grant 632.778]; og DSK [Grant 1048972]; en NHMRC Senior Principal Research Fellowship til katastrofeforebyggelse [Grant 571.123]; og en Helen og Robert Ellis Fellowship til DSK fra Sydney Medical School Foundation of The University of Sydney. EP og TS værdsætter også støtte fra en tjekkisk Science Foundation Grant [13-15008S]. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Jern er et væsentligt element, der er nødvendigt for en række cellulære processer, såsom cellulær proliferation [1], [2], [3]. Faktisk jernholdige enzym, ribonukleotid redutase, er involveret i det hastighedsbegrænsende trin i DNA-syntese og er ansvarlig for omdannelsen af ​​ribonukleotider til deres deoxyribonucleotid modstykker [4], [5]. Vigtigere, har ændringer i jern- metabolisme af kræftceller i forhold til deres normale modparter fremhævet potentialet af jern chelatbehandling til at fungere som en ny behandling avenue. Cancerceller vise en højere krav til jern end normale celler, og dette understreges af den forøgede ekspression af transferrin receptor 1 (TfR1), der optager jern fra jern transportprotein, transferrin (Tf), på celleoverfladen [6] [7], [8]. Derudover er ekspressionen af ​​jern-afhængigt enzym, ribonukleotidreduktase, er markant højere i tumorceller end normale celler [9]. Disse faktorer gør tumorceller mere følsomme over for jernkelations

Selvom jernchelatorer (

f.eks

, desferrioxamin, DFO). Er blevet klinisk anvendt til behandling af jernophobning sygdom [1], [3 ], roman thiosemicarbazon (TSC) chelatorer er blevet bredt undersøgt som potentielle anticancer-midler [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]. Selvom de molekylære mekanismer, der er involveret i aktiviteten af ​​TSC ikke er blevet fuldstændig belyst, er der rapporteret en række virkemåder [3], [15], [21], [22], [23]. Dette omfatter:

(

en

)

hæmning af cellulære jern optagelse fra Tf [10], [13], [18];

(

2

)

mobilisering af jern fra celler [10], [13], [18];

(

3

)

hæmning af ribonukleotidreduktase aktivitet [24], [25];

(

4

)

den opregulering af metastaser suppressor protein, N-myc nedstrøms reguleret gen 1 [26], [27], [28], [29]; og

(

5

)

dannelse redox aktive metalkomplekser, der producerer reaktive ilt arter (ROS) [10], [15], [21], [23 ], [30]. Sidstnævnte mekanisme er betydelig, især da undersøgelser har vist den vigtige rolle ROS generation i at øge den selektive aktivitet af chelatorer mod tumorceller [10], [15], [21].

TSC, 3- aminopyridin-2-carboxaldehyd thiosemicarbazon (Triapine;. figur 1), er blevet undersøgt i 20 fase i og II kliniske undersøgelser som en roman kræft kemoterapeutisk [11], [31], [32], [33], [34 ], [35], [36], [37], [38], [39], [40], [41]. Selvom kliniske forsøg med Triapine generelt har vist begrænset anti-tumor aktivitet [36], [37], [38], [40], andre undersøgelser har vist positive resultater i lokalt avancerede livmoderhalskræft og vaginal kræft, når det administreres med cisplatin og radiochemotherapy [33], [34]. Bemærkelsesværdige bivirkninger observeret ved Triapine administration omfatter methæmoglobin dannelse og hypoxi [35], [39], [41], og disse problemer har nødvendiggjort udviklingen af ​​andre mere aktive og selektive TSC med potent anti-cancer aktivitet.

flere klasser af TSC er udviklet som potentielle anti-proliferative midler (fig. 1), hvoraf en række viser mærket og selektive anti-tumor aktivitet både

in vitro

[10], [15] , [21], [42] og

in vivo

[12], [21], [26], [42]. For eksempel, en fem dages behandling med di-2-pyridylketone 4,4-dimethyl-3-thiosemicarbazon (Dp44mT;. Figur 1) ved 0,4 mg /kg hos mus reducerede væksten af ​​et murint M109-lungecarcinom til 47% af den kontrol [21]. Derudover viste Dp44mT potent og selektiv antitumoraktivitet

in vitro

in vivo

mod en række humane tumor xenografter [42] og var i stand til at danne redoxaktive metalkomplekser, der genererer ROS [15], [21], [30]. Selv om denne TSC viste stort potentiale, det viste hjerte-fibrose ved høje, ikke-optimale doser [42]. Således yderligere undersøgelser Dp44mT analoger var nødvendige og har resulteret i udviklingen af ​​di-2-pyridylketone 4-cyclohexyl-4-methyl-3-thiosemicarbazon (DPC;. Figur 1) [12], [26]. DPC har vist selektiv

in vitro

in vivo

anti-tumor aktivitet ved både den intravenøse [12], [26] og mundtlige ruter [12] og er i øjeblikket evalueres yderligere for indgangen i kliniske forsøg. For nylig er andre TSC også vist sig at have en hidtil ukendt anvendelse som fotodynamisk terapi enhancere [43].

Vi har tidligere undersøgt en række quinolon-baserede TSC der demonstrerer

in vitro

anti- proliferativ aktivitet [16]. I den aktuelle undersøgelse, vi syntetiseret 35 nye TSC af 6 klasser, der blev designet af kombinationen af ​​aktive fragmenter stede i tidligere rapporterede analoger [16], [44]. Tidligere undersøgelser indikerede, at di-substitution ved terminalen (N4) nitrogen er afgørende for effektiv anti-cancer-aktivitet [12], [21]. I den foreliggende undersøgelse har vi bevaret di-substitution ved N4-atomet gennem konstruktionen af ​​et N4-baserede piperazin- eller morpholinring, et fragment, der er til stede i flere aktive TSC [45], [46]. Den anti-proliferative aktivitet og selektivitet af disse hidtil ukendte TSC blev undersøgt

in vitro

mod human cancer celletyper og normale humane dermale fibroblaster (NHDF) -celler. Disse serier, der demonstrerede evnen til at danne redox aktive jernkomplekser og mægle oxidation af ascorbat viste potent anti-proliferativ aktivitet, fremhæver betydningen af ​​ROS generation i deres anti-cancer aktivitet.

Materialer og metoder

reagenserne blev købt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA), Acros Organics (Geel, Belgien) eller Princeton Chemicals Ltd (Luton, Bedfordshire, UK). Silicagel 60 (0,040-0,063 mm; Merck, Darmstadt, Tyskland) blev anvendt til søjlekromatografi. Tyndtlagskromatografi (TLC) blev udført på aluminiumoxid-backed silicagel 40 F

254 plader (Merck). Pladerne blev belyst under UV (254 nm) og evalueres i ioddamp. Smeltepunkterne blev bestemt på et Optimelt MPA100 instrument (Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA, USA) og er ukorrigerede. Høj opløsning-massespektrometri (HRMS) analyse blev udført for alle nye forbindelser på en Finnigan MAT95 spektrometer (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Tyskland) eller på en Mariner ESI-TOF spektrometer (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific).

Alle

1 H- og

13C-NMR-spektre blev registreret på et Bruker AM-400 spektrometer (399,95 MHz for

1 H, 99,99 MHz for

13C, BrukerBioSpin Corp., Coventry, UK) . Kemiske skift er rapporteret i ppm mod den interne standard, Si (CH

3)

4. Let udskiftelige signaler blev udeladt, da diffus. Synteser blev udført på en CEM-DISCOVERY mikrobølge reaktor (CEM Corporation, Matthews, NC, USA) med temperatur og tryk kontrol.

Log

P

calc værdier blev beregnet under anvendelse af ChemDraw 12 (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) ved at udføre Crippen s fragmentering [47], Viswanadhans dialogløse s fragmentering [48] og Broto metode [49] og derefter beregne den gennemsnitlige log

P

calc.

Syntese af thiosemicarbazid prækursorer (a-f)

Generel metode I.

N

alkyl eller

N

ary piperazin ( 6 mmol) blev tilsat til en opløsning af 1,1′-thiocarbonyldiimidazol (6 mmol; 1,068 g) i 25 ml dichlormethan, og reaktionsblandingen blev omrørt i 24 timer ved stuetemperatur. Det organiske opløsningsmiddel blev skilt fra og ekstraheret 3 gange med vand, derefter tørret over vandfrit magnesiumsulfat, filtreres og koncentreres til opnåelse af det rå piperazinderivater. Disse rå produkter blev anvendt i det næste trin uden yderligere oprensning. Disse mellemprodukter blev tilsat til en opløsning af hydrazinhydrat i 25 ml ethanol ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev tilbagesvalet i 3 timer og afkølet til opnåelse af et hvidt bundfald, som blev opsamlet

via

filtrering som det endelige produkt (fig. 2). Alle opnåede thiosemicarbazider blev krystalliseret fra methanol. Se File S1 strukturelle karakterisering detaljer og krystalstrukturen (fig. S1 i File S1) og data (tabel S1 i File S1) af 4-ethylpiperazin-1-carbothiohydrazid (a).

Generelt fremgangsmåde II.

Carbondisulfid (CS

2) (0,2 mol, 12,06 ml) blev tilsat dråbevis i løbet af 15 min til

N

-methylcyclohexylamine (0,2 mol, 26,3 ml) i NaOH opløsning (0,8 M, 250 ml). Reaktionsblandingen blev intensivt omrørt i 20 minutter og derefter natriumchloracetat (0,2 mol) blev tilsat til opløsningen, og der omrøres i 15 timer. Reaktionsblandingen blev neutraliseret med koncentreret HCI (20 ml) for at give carboxymethylthiocarbamate mellemprodukt som et hvidt præcipitat. Det opnåede carboxymethylthiocarbamate mellemprodukt (0,08 mol) blev derefter omsat med hydrazinhydrat (0,08 mol) i vand (10 ml). Denne reaktionsblanding blev forsigtigt refluxet i 2 timer for at give hvide krystaller af thiosemicarbazid (fig. 3). Det endelige produkt blev krystalliseret fra methanol-vand (1/1,

v /v

).

Udarbejdelse af TSC Derivater

De heteroaromatiske TSC-analoger blev syntetiseret ved omsætning af den respektive heteroaromatiske keton eller carbaldehyd og thiosemicarbazid under mikrobølgebestråling. Ækvimolære mængder af den passende thiosemicarbazid (0,5 mmol) og carbonylforbindelse (0,5 mmol) blev opløst i 4 ml EtOH ved tilsætning af 0,1 ml eddikesyre som katalysator (fig. 4). Den resulterende blanding blev opvarmet i en mikrobølgeovn reaktor ved 83 ° C /30 min (max. Mikrobølgeeffekt 50 W). Efter afkøling blev det udfældede faste stof filtreret og vasket med ether. Slutproduktet blev oprenset ved anvendelse af krystallisation (fra ethanol eller methanol) eller søjlekromatografi. Se File S1 for strukturelle karakterisering detaljer, krystalstrukturen (Fig S2 i File S1.) Og data (tabel S1 i File S1) af

Z

–

N

‘- (di (pyridin -2-yl) methylen) -4- (pyridin-2-yl) piperazin-1-carbothiohydrazid (1d) og isosbestiske kurver (fig. S3 i File S1).

HPLC-renhed data

Den endelige renhed TSC blev bestemt ved hjælp af følgende generelle betingelser: Gynkotek HPLC System (Gynkotek); Pumpe T580; Autosampler GINA50 (Gynkotek); Detektor DAAD UVD340U; Kolonne: HILIC Kinetex 100 Å (Phenomenex, Torrance, CA, USA); Flow: 0,5 ml /min (0-1 min), 0,5-1,2 ml /min (1-3 min), 1,2 ml /min (3-7 min), 1,2-0,5 ml /min (7-8 min), 90% CH

2Cl

2, 10% CH

3OH; UV ved 250 nm; Software: Chromeleon (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Se File S1 for data HPLC renhed (Tabel S2 i File S1).

Cell Culture

Den humane cancer celletyper (neuroepithelioma (SK-N-MC), tyktarmskræft (HCT116 med vilde -type p53 (p53

+ /+)), Burkitts lymfom (Raji) og cervikal carcinoma (HeLa)) celler og normale humane dermale fibroblaster (NHDF) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). HCT116 null p53 (p53

– /-) celler blev opnået fra Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center og Institut for Onkologi, Polen

SK-N-MC celler blev dyrket i minimum essential medium. (MEM; Life Technologies, Grand Island, New York, USA) indeholdende 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS; Life Technologies), 1 mM natriumpyruvat (Life Technologies), 1% (v /v) ikke- essentielle aminosyrer (Life Technologies), 2 mM L-glutamin (Life Technologies), 100 U /ml penicillin (Life Technologies), 100 ug /ml streptomycin (Life Technologies) og 0,28 ug /ml fungizon (Bristol-Myers Squibb Pharmaceuticals, Montreal , Canada). HCT116 og NHDF-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM; Sigma-Aldrich) suppleret med 12% (vol /vol) varmeinaktiveret FBS (HCT116; Life Technologies) eller 15% (v /v) FBS (NHDF; Life Technologies), 100 ug /ml gentamicin (Polfa Warszawa SA, Warszawa, Polen), 100 ug /ml streptomycin (Polfa) og 100 U /ml penicillin (Polfa). Raji og HeLa-celler blev dyrket i Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI-1640; Sigma-Aldrich) med tilsætning af 10% (v /v) varmeinaktiveret FBS (Life Technologies) og kosttilskud beskrevet for SK-N- MC-celler ovenfor. Alle cellelinjer blev dyrket under standardbetingelser ved 37 ° C i en fugtig atmosfære ved 5% CO

2 og blev subdyrket hver 3-4 dage, som krævet.

proliferationsassav

celler blev podet i plader med 96 brønde (SK-N-MC: 1,5 × 10

4 celler /brønd; HeLa: 5,0 × 10

3 celler /brønd; Raji: 3,0 × 10

3 celler /brønd; HCT116: 3,5 × 10

3 celler /brønd; NHDF: 3,0 × 10

3 celler /brønd) 24 timer forud for tilsætningen af ​​de nye forbindelser. Analyserne gennemføres ved anvendelse af en 72 h (SK-N-MC, Raji, HeLa) eller 96 timer (HCT 116, NHDF) inkubationsperiode med midlerne ved 37 ° C. Disse såning og vækstbetingelser blev anvendt, således at cellerne ikke kom til konfluens under inkubationen perioder. Derudover blev DFO og Dp44mT medtaget som positive kontroller i alle eksperimenter som deres aktivitet er godt karakteriseret [21], [42], [50].

chelator stamopløsninger blev fremstillet i DMSO og fortyndes i medierne, så den endelige [DMSO] 0,05%. Resultaterne blev udtrykt i procent af kontrollen, og den resulterende IC

50 værdier blev beregnet ved anvendelse af GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA). IC

50 blev defineret som koncentrationen nødvendigt at reducere absorbansen til 50% af den ubehandlede kontrol. Hver enkelt forbindelse blev testet i triplikat i et enkelt forsøg, med hvert eksperiment gentages tre gange. Efter inkubation af HCT 116 og NHDF-celler med de testede forbindelser, 20 pi af CellTiter 96 Aqueous One Solution – MTS (Promega, Madison, WI, USA) -opløsning blev sat til hver brønd (med 100 pi DMEM uden phenolrødt) og inkuberet i 1 h /37 ° C. Den optiske densitet af prøverne blev analyseret ved 490 nm.

MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetrazoliumbromid) blev anvendt til at evaluere de anti-proliferative virkninger de chelatorer i SK-N-MC og Raji-celler. Efter inkubering med de undersøgte forbindelser, 10 pi MTT (5 mg /ml i PBS; Sigma-Aldrich) blev tilsat til hver brønd. Efter 2 timer (SK-N-MC) eller 4 timer (Raji) inkubering blev pladerne centrifugeret, og cellerne blev lyseret med 100 pi 10% SDS-50% isobutanol i 0,01 M HCl (SK-N-MC ) eller DMSO (Raji). Absorbansen blev målt ved 570 nm. De antiproliferative virkninger af disse nye midler på HeLa-celler blev estimeret ved anvendelse krystalviolet farvning (0,5% krystalviolet opløsning i 10 minutter). Endelig blev brøndene skyllet med vand, og cellerne blev lyseret med 2% SDS. Den optiske densitet af prøverne blev analyseret ved 595 nm.

Mærkning af transferrin med

59Fe

Strygejernet transport protein, Tf (Sigma-Aldrich), blev mærket med

59Fe (PerkinElmer Life og Analytisk Sciences, Boston, MA) til at danne

59Fe

2-Tf hjælp standardmetoder [6], [7]. Ubundet

59Fe blev fjernet ved passage gennem en Sephadex G25 søjle og blev efterfulgt af udtømmende dialyse [6], [7].

Virkningerne af den Chelatorer om udnyttelse Cellular

59Fe

for at undersøge evnen af ​​de hidtil ukendte chelateringsmidler at mobilisere

59Fe fra SK-N-MC-celler,

udførtes 59Fe efflux eksperimenter ved anvendelse af etablerede teknikker [50], [51]. Monolaget af SK-N-MC-celler blev prelabeled i 3 timer ved 37 ° C i MEM indeholdende

59Fe

2-Tf (0,75 uM). Celler blev derefter vasket fire gange med iskold PBS og inkuberes i yderligere 3 timer ved 37 ° C med medium alene (kontrol) eller medium indeholdende chelatoren (25 uM). Efter denne inkubering det overliggende medium, som indeholdt den frigivne

59Fe blev separeret fra cellerne ved anvendelse af en Pasteur-pipette. Radioaktivitet blev målt i både cellerne og supernatanten under anvendelse af en γ-scintillationstæller (Wallac Wizard 3, Turku, Finland). I disse undersøgelser blev de nye ligander i forhold til de tidligere karakteriserede chelatorer, DFO og Dp44mT, som deres evne til at mobilisere cellulære

59Fe er blevet grundigt undersøgt i disse celler [10], [12], [17], [18 ], [50].

Effekt af chelatorer på Forebyggelse Cellular

59Fe optagelse

evne til chelatorer at forhindre cellulære optagelse af

59Fe fra

59Fe

2-Tf blev undersøgt ved hjælp af standardmetoder [10], [14], [17], [18], [50]. En monolag af SK-N-MC-celler blev inkuberet med medium indeholdende

59Fe

2-Tf (0,75 uM) og chelatoren (25 uM) i 3 timer ved 37 ° C. Mediet blev derefter fjernet, og cellerne blev vasket fire gange med iskoldt PBS. Cellerne blev derefter inkuberet i 30 minutter ved 4 ° C med den generelle protease, pronase (1 mg /ml; Sigma-Aldrich), for at fjerne membranbundet

59Fe. Cellerne blev fjernet under anvendelse af en plast spatel og centrifugeret ved 14.000 rpm /1 min til adskillelse internaliseret fra membranbundet

59Fe. Cellepelleten blev resuspenderet i 1 ml PBS, og internaliseret

59Fe blev målt på en γ-scintillationstæller. Internaliseret

59Fe optagelse blev beregnet som en procentdel af kontrol (medium alene). Igen blev de hidtil ukendte ligander sammenlignet med DFO og Dp44mT som deres evne til at inhibere cellulær

59Fe optagelse har været grundigt karakteriseret under anvendelse SK-N-MC-celler [10], [14], [17], [18], [ ,,,0],50].

ascorbat oxidation Assay

evnen af ​​jernkomplekser af de hidtil ukendte ligander til at mediere oxidationen af ​​den fysiologiske substrat, ascorbat, blev undersøgt under anvendelse af etablerede fremgangsmåder [10], [18 ], [22], [52], [53]. Ascorbinsyre (100 uM) blev fremstillet umiddelbart før hvert forsøg og blev inkuberet i nærvær af Fe

III (10 uM; som FeCl

3), chelatoren (1-60 uM) og en 50-fold molært overskud af citrat (500 uM). Absorbansen ved 265 nm blev målt efter 10 og 40 min og forskellen i absorbans ved disse tidspunkter blev beregnet. Resultaterne af disse forsøg blev udtrykt som jern-bindende ækvivalenter (IBE) på grund af de forskellige denticitet af de undersøgte chelatorer. Chelatorerne, Dp44mT, DFO og ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) blev anvendt som kontroller som evnen af ​​deres jernkomplekser at oxidere ascorbat er blevet grundigt karakteriseret [10], [15], [52], [53].

Statistisk analyse

data blev udtrykt som middelværdi ± SD af mindst 3 eksperimenter. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Prism v6 (GraphPad Software, Inc.) at gennemføre en en-vejs ANOVA med Bonferroni post-hoc test.

Resultater og Diskussion

Drug Design

molekylære egenskaber, såsom molekylvægt (MW) og beregnet oktanol-vand fordelingskoefficient (log

P

calc) er nøglefaktorer i den succesfulde udvikling af lægemiddelkandidater [54], [55]. Generelt er den gennemsnitlige MW og log

P

calc af lægemidler, der er lanceret på markedet, er 300-450 Da og 2-4, henholdsvis [56], [57]. I betragtning af dette, den klinisk trialed TSC, Triapine (MW: 195 Da; log

P

calc: 0,761), repræsenterer en interessant bly molekyle med en betydelig reserve i MW og log

P

beregnet for modifikation.

Identifikation funktionelle fragmenter for udviklingen af ​​lægemidler er et komplekst problem, der involverer forskellige tilgange, herunder dem med en eksperimentel og teoretisk grundlag. Sidstnævnte består af en række forskellige metoder, blandt hvilke er dem identificere fordelagtige sub-strukturer, stilladser og /eller linkere på basis af tidligere rapporterede forbindelser. Alternativt opsplitningen af ​​organiske molekyler i mindre grupper er en vigtig metode i retrosyntetisk analyse og har inspireret en række pseudo-retrosyntetisk tilgange [58]. Dette har identificeret fragmenter, der kan være nyttige for udviklingen af ​​lægemidler. For eksempel di-2-pyridyl [12], [15], [21], [59], quinolinyl [60], piperazinyl [60], [61], [62], morpholinyl [63] og quinoxalinyl [ ,,,0],64] motiver er fælles fragmenter i andre anticancer-midler, som er blevet indarbejdet i designet af de nye TSC rapporteret heri.

i den aktuelle undersøgelse, den vigtigste begrundelse bag vores tilgang var, at det nyligt syntetiserede TSC bør bevare potent anti-cancer aktivitet af deres TSC forstadier, og samtidig bevare relevante MW og log

P

calc værdier gøre væsentlige lovende som lægemiddelkandidater til farmaceutisk udvikling. Vi brugte en kombination af retro-fragmenter, der forekommer i andre TSC forstadier [15], [16], [21], [44], [59] og andre anticancer-midler [60], [61], [62] , [63], [64]. Endvidere blev di-substitution ved terminalen N4 atom bevaret gennem konstruktionen af ​​et N4-baserede piperazin- eller morpholinring (fig. 5), en del, der er observeret i adskillige potente TSC [45], [46].

Syntese af Novel ligander

thiosemicarbazid prækursorer, a-f (fig. 5), blev syntetiseret ud fra kommercielt tilgængelige reagenser i en to-trins proces, der gav moderate til høje udbytter (47- 95%). Behandlingen af ​​bis (imidazol) thioketon med den passende piperazin, efterfulgt af omsætning med hydrazinhydrat gav

N

substituerede piperazin-baserede thiosemicarbazider i højt udbytte (File S1). Den endelige thiosemicarbazon serie, 1-6 (fig. 5), blev syntetiseret ved moderat til højt udbytte (58-96%) af Schiff-basen kondensation af den passende keton /aldehyd med de fremstillede thiosemicarbazider. Renheden af ​​thiosemicarbazoner blev bekræftet ved HPLC og var 95% (se tabel S2 i File S1)

Anti-proliferative aktivitet af romanen thiosemicarbazoner mod en række kræftcelle-Types

evnen af ​​det hidtil ukendte thiosemicarbazon serien 1-6 til at inhibere cellulær proliferation af tumorceller blev undersøgt i en række cancer celletyper (tabel 1), herunder humant p53 vildtype og null coloncancer (HCT116 p53

+ /+ og HCT116 p53

– /-, henholdsvis), Burkitts lymfom (Raji), human cervical carcinoma (HeLa) og neuroepithelioma (SK-N-MC) cancerceller. Evnen af ​​disse nye stoffer til selektivitet target kræftceller blev vurderet ved at undersøge deres virkninger på den cellulære proliferation af en dødelig celle-type, nemlig normal human dermal fibroblast (NHDF) celler. Den anti-proliferative aktivitet af serie 1-6 fremgår af tabel 1 og er også repræsenteret som farvekort (se fig. S4 i File S1). Virkningerne af disse nye ligander blev derefter sammenlignet med de følgende chelatorer, der blev brugt som positive kontroller:

(

en

)

DFO, der klinisk anvendes til behandling af jernophobning sygdom [1], [3] og

(

2

)

Dp44mT, en chelator med potent anti-proliferativ aktivitet

in vitro

og

in vivo

[15], [21].

Som forventet fra vores tidligere undersøgelser [10], [14], [17], [18], [ ,,,0],50], kontrol chelator, DFO, viste en ringe antiproliferative virkning i alle cancer og normale celletyper, med IC

50 værdier på mellem 4,74 til 25 uM (tabel 1). I modsætning hertil viste Dp44mT selektiv og potent anti-cancer aktivitet med IC

50 værdier på 0,002 til 0,04 uM, men var markant mindre effektiv i dødelige NHDF-celler (IC

50: 15,38 uM; tabel 1).

overveje at udvikle nye terapeutiske midler mod cancer, er det bemærkelsesværdigt, at en mangel på ekspression af tumor suppressor protein, p53, i nogle tumorer hjælpemidler progression af neoplastiske celler og fremmer modstand mod kemoterapeutiske midler [65], [66] . Derfor er anvendelse af midler, som er aktive mod både vildtype og null p53 tumorer er afgørende, især i betragtning af den høje forekomst af p53-mutationer i fremskredne cancere [42], [67]. Således har vi i første omgang undersøgt antiproliferativ aktivitet af det hidtil ukendte TSC serie 1-6 mod human HCT116 p53

+ /+ og HCT116 p53

– /- colon cancerceller (tabel 1). Betydeligt, anti-proliferative virkninger af de fleste af de hidtil ukendte TSC viste det samme generelle mønster for aktivitet mod HCT116 p53

+ /+ og HCT116 p53

– /- celler, uanset p53-status (tabel 1). blev observeret en bemærkelsesværdig undtagelse i aktivitet mellem disse to celletyper for forbindelse 3e, som viste en 100 ganges formindskelse i anti-proliferativ effekt ved sammenligning HCT116 p53

+ /+ (IC

50: 0,05 uM) og HCT116 p53

– /- celler (IC

50: 5 uM; tabel 1). Dog samlet, anti-proliferative aktivitet af TSC var generelt uafhængig af p53-status (tabel 1), som vist for andre forbindelser i denne klasse [16], [42]. Derfor er dette en vigtig egenskab af TSC, som kan forklare deres markant aktivitet, der er blevet observeret med beslægtede midler på tværs af en bred vifte af kræft celletyper [42].

Af alle de serier af TSC syntetiseret i dette undersøgelse, de analoger afledt af di-2-pyridyl (1a-e) viste den mest potente anti-proliferative aktivitet i HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler, hvilket resulterer i IC

50 værdier fra 0.0008-0.04 pM (tabel 1). Mens analogerne afledt af quinolin-2-yl (2a-f) og 8-hydroxyquinolin-2-yl (3a-f) viste moderate anti-proliferative virkninger (IC

50: 0,026-3,55 og 0,004-9,25 pM, henholdsvis). Derimod disse chelatorer afledt af 7-hydroxyquinolin-8-yl (4a-f), quinoxalin-2-yl (5a-f) og salicylsyre (6a-f) -dele udviste ringe anticanceraktivitet (IC

50: 1.02- 25 uM) i HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler (tabel 1)

En lignende generel tendens i anti-proliferative aktivitet. nye TSC til dem observeret i HCT116 p53

+ /+ og p53

– /- celler blev også observeret i Raji, HeLa og SK-N-MC-celler (tabel 1). Faktisk disse chelatorer indeholdende di-2-pyridyl-enhed (1a-e) var den mest potente anti-cancer (IC

50: 0,0003 til 2,21 pM) -analoger undersøgt. I lighed med de HCT116 data, forbindelser fra serie 2 normalt udstillet moderat antiproliferativ aktivitet (IC

50: 0,04-5,14 uM) i Raji, HeLa og SK-N-MC-celler, mens serie 3, 4, 5 og 6 viste generelt moderat til fattige anti-proliferative virkninger (tabel 1).

Kun en svag til moderat korrelation (

R

2 = 0,01-0,6) var tydelig mellem den anti-cancer aktivitet af serie 1-6 og deres log

P

calc værdier, hvilket antyder, at andre faktorer end deres evne til tværgående cellemembranen ved passiv diffusion var kritiske i deres anti-proliferative virkninger.

anti-proliferative aktivitet af de hidtil ukendte thiosemicarbazoner Against normal, Mortal Cells

vigtigt for en agent til at være anvendelig som et anti-cancer lægemiddel, det skal vise præferentiel antiproliferativ aktivitet mod tumorceller i normalt, dødelige celletyper. Derfor blev selektiviteten af ​​de hidtil ukendte TSC undersøgt i dødelige celler, nemlig NHDF-celler. Af alle de undersøgte analoger, 1b, 1d, 2b, 2f og 3c viste den største anti-proliferativ aktivitet i størstedelen af ​​cancer celletyper (tabel 1). Således at undersøge selektiviteten af ​​de 5 bedste TSC identificeret ovenfor, nemlig 1b, 1d, 2b, 2f og 3c, en “terapeutisk indeks” blev beregnet ved at dividere NHDF celle IC

50 af IC

50 den neoplastiske HCT116 p53

+ /+ eller HCT116 p53

– /- celletyper (tabel 2). Især selektivitet indeks Dp44mT sammenligne NHDFs til HCT116 p53

+ /+ eller HCT116 p53

– /- celletyper blev markeret, bliver 7690 og 3076, henholdsvis

Af. de 5 mest potente anti-cancer TSC beskrevet heri (tabel 1), de største terapeutiske indices blev identificeret i 1d og 3c og var fra 18 til 2650 (tabel 2). Denne høje selektivitet mod cancercellerne skyldtes det faktum, at både 1d og 3c viste kraftig anti-cancer-aktivitet (IC

50: 0,002-0,017 uM) i HCT116-celler, men deres cytotoksicitet blev stærkt reduceret i NHDF-celler (IC

50: 0,16-10,6 uM).