PLoS ONE: Akt Inhibitor ISC-4 synergistisk med Cetuximab i 5-FU-Resistant Colon Cancer

Abstrakt

phenylbutyl isoselenocyanate (ISC-4) er en Akt hæmmer med demonstreret præklinisk effekt mod melanom og tyktarmskræft . I denne undersøgelse, vi søgt at forbedre den kliniske anvendelighed af ISC-4 ved at identificere en synergistisk kombination med FDA-godkendte anti-cancer behandlinger, et relevant og passende sygdom indstilling til test, og biomarkører for respons. Vi testede aktiviteten af ​​ISC-4 og 19 FDA-godkendte anticancermidler, alene eller i kombination, mod de SW480 og RKO human coloncancer-cellelinjer. En synergistisk interaktion med cetuximab blev identificeret og valideret i et panel af yderligere tyktarmskræft cellelinjer, såvel som kinetikken for synergi. ISC-4 i kombination med cetuximab synergistisk reducerede levedygtigheden af ​​humane coloncancer-celler med vildtype, men ikke mutant

KRAS

gener. Yderligere analyse afslørede, at kombinationsterapi samvirkende faldt cellecyklusprogression, øget caspase-afhængig apoptose og nedsat phospho-Akt i reagerende tumorceller. Synergien mellem ISC-4 og cetuximab blev bevaret uafhængigt af erhvervet resistens over for 5-FU i humane coloncancer-celler. Kombinationen demonstrerede synergistiske antitumorvirkninger

in vivo

uden toksicitet og i lyset af resistens over for 5-FU. Disse resultater tyder på, at kombinere ISC-4 og cetuximab bør undersøges hos patienter med 5-FU-resistente tyktarmskræft huser vildtype

KRAS

Henvisning:. Allen JE, Gallant JN, Dicker DT, Amin S, Irby RB, Sharma AK, et al. (2013) De Akt Inhibitor ISC-4 synergistisk med Cetuximab i 5-FU-Resistant tyktarmskræft. PLoS ONE 8 (3): e59380. doi: 10,1371 /journal.pone.0059380

Redaktør: Abbes Belkhiri, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: November 21, 2012; Accepteret: 13 februar 2013; Udgivet: 12 Marts 2013

Copyright: © 2013 Allen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud til WSE-D. og midler fra Penn State Hershey Cancer Institute, NIH National Cancer Institute tilskud R03-CA143999 til A.K.S., og Lung Cancer Research Foundation tilskud til A.K.S. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne anerkender konkurrerende interesse, at Dr. El-Diery er på redaktionen for PLoS og som anmodet, bekræfte, at dette ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

phenylalkyl isoselenocyanates (HTT), de isosteriske selenanaloger af det naturligt forekommende isothiocyanat klasse af forbindelser [1], [2], blev for nylig udviklet i vores laboratorier og har vist sig at inhibere Akt aktivitet [3], [4], [5], [6]. Blandt de undersøgte individuelle servicekontrakter, har ISC-4 viste den bedste anti-tumor aktivitet i prækliniske modeller, både

in vitro

in vivo

, med lovende sikkerhed [4]. ISC-4 har vist beskedne præklinisk effekt mod mange tumortyper

in vitro

, og anti-tumor effekt er blevet rapporteret i forbindelse med melanom, når ISC-4 anvendes en mono-agent

in vivo

[4], [5], [6]. ISC-4 har også udvist betydelige antitumorvirkninger, via inhibering af Akt, i tyktarmskræft xenotransplantater ved anvendelse som mono-middel og når de anvendes i kombination med 5-fluorouracil (5-FU)-selvom den kliniske anvendelighed af kombination var uklart [5].

PI3K /Akt vej er over-aktiveret eller ændret i de fleste tarmkræft, som er den tredje hyppigst diagnosticeret og dødbringende kræft i USA [7]. Standarden-of-care kemoterapi for fremskreden sygdom omfatter FOLFOX eller FOLFIRI regimer, som består af 5-FU, leucovorin, oxaliplatin og irinotecan i tillæg til andre behandlingsmuligheder, herunder anti-VEGF monoklonale antistof bevacizumab og anti -EGFR monoklonalt antistof cetuximab. Mens disse kombinationsmuligheder behandling muligheder har forbedret overlevelsen af ​​patienter, der er behov for yderligere ugiftige målrettet behandlingsmuligheder i terapi-refraktære indstilling af avanceret tyktarmskræft.

Selvom prækliniske mono-agent aktivitet af ISC-4 er signifikant, kombinationsterapi er ikke blevet grundigt undersøgt. Vi søgte derfor om synergistiske kombinationer med ISC-4 ved hjælp af et panel af FDA-godkendte lægemidler. Her rapporterer vi identificering af ISC-4 og cetuximab som et lovende kombinationsterapi, der har synergistisk antitumoraktivitet

in vitro

in vivo

mod humant coloncancerformer huser en vildtype

KRAS

gen.

Materialer og metoder

cellekultur cellelevedygtighedsassays og reagenser

Cellelinjer blev indhentet fra ATCC og dyrket i ATCC- anbefalede medier i en fugtig inkubator ved 5% CO

2 og 37 ° C. Cellelinier anvendt i denne undersøgelse, blev ikke bekræftet. For cellelevedygtighedsassays blev celler udsået i 96-brønds sorte vægge plader ved en koncentration på 1 x 10

5 ml i frisk medium og i et volumen på 100 pi per brønd. Cellerne fik lov til at adhærere natten og blev behandlet den næste dag som angivet. Ved endepunktet, blev CellTiter-Glo (Promega) assays udført ifølge producentens protokol, og bioluminescerende udlæsning blev optaget på et IVIS afbildningssystem (Xenogen). For cellesynkronisering blev celler inkuberet med 200 ng /ml nocodazol i 16 timer før behandling. Chloroquin blev opnået fra Sigma. zVAD-fmk blev opnået fra Promega og anvendt i en arbejdskoncentration på 25 uM. ISC-4 blev syntetiseret som tidligere beskrevet [6].

Flowcytometri

I sub-G1 DNA indholdsanalyse blev celler trypsiniseret i de angivne tidspunkter og fikseret i 80% ethanol ved 4 ° C i mindst 30 minutter. Fikserede celler blev derefter farvet med propidiumiodid i nærvær af RNase og analyseret på en Epics Elite flowcytometer (Beckman Coulter). For Ki-67-ekspression blev celler ethanol faste, som beskrevet ovenfor, og immunfarvet med et anti-Ki-67-antistof (Sigma) ved 1:500 i 30 minutter. Celler blev efterfølgende inkuberet med AlexaFluor 488-konjugeret antistof ved 1:500 i PBS i 30 minutter og resuspenderet i PBS til analyse.

Western blot-analyse

Celler blev behandlet i log-vækstfase, høstet ved celle skrabning, centrifugeret, og lyseret på is i 2 timer med celle-lysis buffer. Supernatanten blev opsamlet efter centrifugering, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af Bio-Rad proteinassay (Bio-Rad Laboratories). Prøver blev elektroforeret under reducerende betingelser på NuPAGE 4-12% Bis-Tris-geler (Invitrogen), overført til PVDF, og blokeret i 10% fedtfri mælk i TBST i 1 time. Membraner blev derefter inkuberet med primære antistoffer opnået fra cellesignalering ved 1:1000 i 2% fedtfri mælk i TBST natten over ved 4 ° C. Membraner blev vasket i TBST, inkuberet med det passende HRP-konjugeret sekundært antistof (Thermo-Scientific) i 1 time, vasket i TBST, og fremkaldes med ECL-Plus (Amersham) og røntgenfilm (Thermo-Scientific).

In vivo

undersøgelser

athymiske kvindelige nøgne mus (Charles River Laboratories) blev podet med 1 × 10

6 af 5-FU, resistent RKO eller HT-29 celler i hver bageste flanke som en 200 pi suspension af 01:01 Matrigel (BD): PBS. Behandling blev indledt, så snart tumorerne nåede en gennemsnitlig volumen på ~1650 mm

3 blev intraperitoneal eller intravenøse injektioner givet i et totalvolumen på 200 pi i DMSO. For væv analyse blev væv høstet fra aflivede mus og fikseret i 4% paraformaldehyd i PBS i 48 timer. Væv blev paraffinindlejrede og sektioneret af Histologi Core Facility ved Penn State Hershey Medical Center. H 8 pM (. Figur 1D). , ISC-4 har således beskedne enkeltstof aktivitet mod humane coloncancer-celler ved at forårsage celledød og et fald i proliferation.

Identifikation af en synergistisk kombination med ISC-4

Vi søgte efter synergistiske kombinationer af ISC-4 med FDA-godkendte behandlinger for at forbedre effektiviteten af ​​ISC-4 mod tyktarmskræft. Vi valgte de SW480 og RKO menneskelige kolon cancer cellelinjer til indledende profilering baseret på deres heterogene onkogene genetiske ændringer. SW480 har mutant

p53

, mutant

KRAS

, og vildtype

BRAF

mens RKO har vildtype

p53

, vildtype

KRAS

, og mutant

BRAF

gener [9]. Blandt testpladen fra kemoterapier og targeted midler, blev kombinatorisk aktivitet observeret i mindst en cellelinje når ISC-4 blev kombineret med sorafenib, gefitinib, gemcitabin, cisplatin, bortezomib, imatinib eller cetuximab (figur 2; tabel S1, S2) . Kombinationen af ​​ISC-4 og cetuximab var den eneste synergistisk kombinatorisk terapi observeret under de testede betingelser. Endvidere var dette synergi kun observeret i RKO-cellelinien, som huser vildtype

KRAS

, og ikke i SW480-cellelinien, som huser

KRAS

G12V

. Denne observation er i overensstemmelse med kravet om vildtype

KRAS

for den kliniske effekt af cetuximab i tyktarmskræft [10], [11].

Cell levedygtighed analyser i SW480 og RKO kolon cancercellelinjer behandlet med ISC-4 (1, 2, eller 4 uM) og angivet terapier ved formodet EF

12,5, EF

25, og EF

50 alene og i kombination (n = 3). Doser er angivet i tabel S1.

ISC-4 og cetuximab synergistisk hæmmer vildtype-KRAS tumorcelleproliferation

Vi evaluerede den synergistiske aktivitet af ISC-4 og cetuximab i flere menneske tyktarmskræft cellelinjer. I tråd med vores tidligere observation, var synergistisk aktivitet kun observeret i HT-29 og RKO cellelinjer, som har vildtype

KRAS

gener og ikke HCT116, DLD-1, og andre tyktarmskræft cellelinjer med mutant

KRAS

gener (figur 3A;. tabel S3, data ikke vist). Interessant, den synergistiske samspil mellem ISC-4 og cetuximab synes at være dosisafhængig med hensyn til ISC-4-koncentration, men uafhængig af cetuximab koncentration. At evaluere denne kombinatorisk aktivitet i en klinisk relevant indstilling, testede vi den synergistiske effekt af ISC-4 og cetuximab i RKO kloner med udviklet resistens over for 5-FU. Fordi 5-FU er en standard-of-care terapi til behandling af coloncancer, terapier, der tilbyder fordele i 5-FU-resistente coloncancer er brug i klinikken. Den synergistiske aktivitet af ISC-4 og cetuximab blev bevaret på trods erhvervet 5-FU-resistens i de testede tyktarmskræft celler (Fig. 3B-C). Tilsammen udgør disse data identificerer 5-FU-resistente tyktarmskræft med vildtype

KRAS

gener som en passende klinisk indstilling, der kan have gavn af ISC-4 og cetuximab kombinatorisk terapi.

(A) celle levedygtighed assays af humane coloncancer-cellelinjer behandlet med ISC-4 og cetuximab ved angivne doser i 72 timer (n = 3). (B) Cellelevedygtighed assay af vildtype og 5-FU-resistente RKO-celler behandlet med 5-FU som angivet i 24 timer (n = 3). (C) 5-FU-resistente RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 ug /ml) i 24 timer (n = 3).

Vi bestemmes kinetikken for den observerede synergistisk effekt og fundet sådan aktivitet så tidligt som 8 timer efter behandling med større synergi på 12 timer (fig. 4A). Denne observation antyder, at den synergistiske virkning af ISC-4 og cetuximab er måske cytotoksisk frem for cytostatisk. Ændringer i cellemorfologi, samt fluorescerende mærkning af DNA, af behandlede cancerceller afslørede, at ISC-4 og cetuximab kombinationsbehandling bevirker tilsyneladende DNA-fragmentering (Fig 4B;.. Figur S1A). Yderligere analyse viste, at kombinationen af ​​ISC-4 og cetuximab samvirkende og øge sub-G1 indhold sammenlignet med mono-midler, men det kombinatoriske sub-G1-indhold ikke var tilstrækkelig til fuldt ud forklare den observerede synergi (fig. 4C). ISC-4-induceret indhold sub-G1 blev signifikant inhiberet af co-inkubering med den pan-caspaseinhibitor zVAD-fmk, hvilket antyder, at kombinationen inducerer caspase-afhængig apoptose. I understøtningen af ​​denne observation, at kombinationen af ​​ISC-4 og cetuximab synergistisk induceret caspase-3-aktivering (fig. 4D). Salg

(A) Cell levedygtighed assays af RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM ) og cetuximab (1 ug /ml) alene eller i kombination i den angivne tidsperiode (n = 3). (B) DAPI farvning af RKO celler behandlet som i (A) i 12 timer. Hvide pile angiver celler med fragmenteret DNA. (C) Sub-G1 indhold RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 ug /ml) alene eller i kombination i 12 timer (n = 3). *

P

0,05 sammenlignet med alle behandlingsgrupper ved Students to-tailed

t

test. (D) Caspase-Glo assayet ifølge RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) i kombination med cetuximab (0, 0,25, 0,5 eller 1 ug /ml) ved 24 timer efter behandling. Nederste panel viser kvantificering af ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 ug /ml) (n = 3).

Western blot-analyse afslørede, at ISC-4 i kombination med cetuximab samvirkende reducerer phospho -Akt niveauer, men ikke phospho-ERK, til et meget beskedent niveau ved 24 timer efter behandling (fig. 5A). viste imidlertid et tidsforløb analyse, at kombinationen kooperativt ablateres phosho-Akt niveauer så hurtigt som 4 timer efter behandling (Fig. 5B). Humane coloncancer-cellelinjer, der udviste en synergistisk respons på ISC-4 og cetuximab også reagerede med et signifikant fald i phospho-Akt (fig. 5C). Imidlertid humane coloncancer-cellelinjer, der huser mutant KRAS ikke virkede synergistisk til kombinationsterapien også udviste ikke ændringer i phospho-Akt niveauer som respons på behandling. Således phospho-Akt niveauer synes at korrelere med antitumor respons på ISC-4 og cetuximab. Ingen effekt på Ki-67 ekspression eller LC3B spaltning, en markør for autofagi blev observeret med kombinationen (fig. S1B-D). Disse observationer indikerer, at kæmning ISC-4 med cetuximab fører til en kooperativ fald i phospho-Akt og cellelevedygtighed, som er ledsaget af forøget apoptose.

(A) Western blot-analyse af RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 ug /ml) alene eller i kombination i 24 timer. Densitometri af phospho-Akt niveauer er vist ovenfor blottet så normaliseret til Ran som i forhold til at styre behandlingen. (B) Western blot-analyse af RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 ug /ml) alene eller i kombination til angivne tidsperioder. Ran er vist som en loading kontrol. (C) Western blot-analyse af angivne human coloncancer-cellelinjer efter behandling med kombinationen (Rx) af ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 ug /ml) i 8 timer. *

P

. 0,05 sammenlignet med kontrol

ISC-4 og cetuximab udøver synergistiske anti-tumor effekt uden toksicitet

in vivo

for at efterligne dens sandsynlige kliniske omgivelser og nytte, vi testede anti-tumor effekt af ISC-4 i kombination med cetuximab i avancerede 5-FU-resistente RKO subkutane xenotransplantater. I denne indstilling, vi fandt, at kombinationsterapi har en synergistisk indledende virkning på tumorprogression og forårsagede tumorstase i den første uge af behandlingen (fig. 6A). Tissue analyse afslørede, at xenotransplantater modtager kombinationsbehandlingen havde højere niveauer af nekrose ved histologi og apoptose ved TUNEL-farvning end xenotransplantater modtager enten middel alene (figur 6B;.. Figur S2A). Den terapeutiske dosisregimen benyttet i disse undersøgelser var veltolereret og påvirkede ikke musenes kropsvægt eller ændring i leverhistologi (fig. S2B-C).

(A) Relative tumorstørrelser af 5-FU-resistente RKO xenotransplantater på 4 dage efter behandlingen med en enkelt dosis af ISC-4 (3 mg /kg, ip), cetuximab (10 mg /kg, iv), eller kombinationen (n≥5). Individuelle tumorer blev normaliseret til deres baseline størrelse målt på dag 0. * P 0,05 sammenlignet med alle behandlede grupper ved hjælp af Student to-tailed

t

test. (B) Hematoxylin og eosin (H 0,05 sammenlignet med kontrol

Vi næste undersøgt kombinationen af ​​ISC-4 og cetuximab i HT-29 xenotransplantater i mus sammenlignet med monoagents og kombinationen af. cetuximab og 5-FU. Vi fandt, at ISC-4 og cetuximab stærkt reduceret tumor progression, i modsætning til de monoagents, når det gives som ugentlige intravenøse doser, der var groft tilsyneladende ved tumor volumen og tumor vægt målinger (figur 6C;.. Figur S2D). Endvidere kombinationen udviste overlegne antitumoraktivitet sammenlignet med kombinationen af ​​5-FU og cetuximab under disse forsøgsbetingelser. Denne kombination blev igen veltolereret (fig. S2E) og desuden afsløret serum kemi analyse ingen signifikante ændringer i elektrolytter, leverfunktionen eller andre molekylære markører i forbindelse med nyre- eller kardiotoksicitet med kronisk dosering (tabel S4). Kumulativt, disse effekt- og sikkerhedsdata viser, at den kombinatoriske aktivitet af cetuximab og ISC-4 bør evalueres i fremtidige kliniske studier med 5-FU-refraktær tyktarmskræft huser vildtype

KRAS

gener.

diskussion

ISC-4 er en lovende Akt-hæmmer, der har vist anti-tumor aktivitet i flere prækliniske undersøgelser [3], [4], [5]. Den observerede synergi mellem ISC-4 og cetuximab som en kombinationsbehandling giver ISC-4 til at udøve cytotoksicitet ved lave mikromolære doser mod humane coloncancer-celler, som kan være en mere opnåeligt dosis

in vivo

. Kombinationen synes at fremkalde øget apoptose både

in vitro

in vivo

, selvom andre anti-tumor mekanismer kan bidrage til synergi. Denne observation er i overensstemmelse med tidligere fund, at perifosine, en PI3K /Akt-hæmmer, synergistisk med midler, der hæmmer EGFR, såsom cetuximab [12]. Fremtidige undersøgelser bør sammenligne ISC-4 med perifosine alene og i kombination med cetuximab at bestemme deres relative styrke og potentiale som nye behandlinger for human cancer.

Fremtidige undersøgelser bør undersøge underliggende mekanismer for synergi mellem de to agenter. Særlig opmærksomhed bør rettes mod den kombinatoriske effekt på phospho-Akt, der tjener som terapeutisk respons markør til kombinationen og kan anvendes i fremtidige kliniske forsøg. Interessant nok blev synergien mellem disse to agenter observeret i HT29 og RKO celler, som besidder mutant BRAF og PIK3CA gener, der vil have positiv betydning på Akt aktivitet. Kombinatorisk

in vitro

aktivitet blev observeret for ISC-4 med flere andre godkendte målrettede agenter og kemoterapi, men ikke synergistisk, og fortjener yderligere undersøgelse. Aktiviteten af ​​ISC-4 imod lymfom bør undersøges nærmere i betragtning af den forholdsvis kraftige

in vitro

aktivitet for single-agent ISC-4, som vi observerede mod lymfom cellelinjer. Den p53-uafhængig aktivitet af ISC-4 og bevarelse af synergi med cetuximab i 5-FU-refraktær sygdom lover godt for den kliniske anvendelighed af ISC-4. Adskillige kemoterapier, herunder 5-FU, har p53-afhængige cytotoksiske virkninger på tumorceller, og dermed kemoterapi-resistent sygdom almindeligvis opstår under sygdomsprogression på grund af hyppig inaktivering af tumor suppressor p53 [13].

Ud over den tumorstase induceret af ISC-4 og cetuximab kombinationsterapi i 5-FU-resistente tumorer, skal det bemærkes, at den terapeutiske dosisregimen var meget veltolereret. Det lover godt for dens anvendelse i patienter med fremskreden sygdom, hvoraf mange ikke er i stand til at tåle barske behandlinger. Den terapeutiske aktivitet i 5-FU-resistente fremskreden tyktarmskræft er lovende og kan drage fordel af tilsætning af andre almindeligt anvendte behandlinger i forbindelse med tyktarmskræft management, såsom oxaliplatin. Cetuximab er blevet vist at genoprette oxaliplatin følsomhed i ildfaste colon cancerceller og kan repræsentere en lovende terapeutisk mulighed [14]. Kliniske data understøtter også kombinationen af ​​cetuximab med irinotecan i irinotecan-refraktær sygdom [15].

I betragtning af den demonstrerede effekten og sikkerheden af ​​denne kombination, klinisk undersøgelse af ISC-4 i kombination med cetuximab berettiget hos patienter med vildtype

KRAS

gener, som er nødvendig for standard cetuximab [11]. De seneste oplysninger tyder på, at der skal tages en biopsi umiddelbart før behandlingsstart for at sikre KRAS er wild-type som kolon kræftpatienter kan udvikle KRAS-mutationer under cetuximab behandling, der forårsager resistens [16]. Endvidere gennemførelse af phospho-Akt som biomarkør af respons kan være nyttig i den fremtidige forsøg gennem tumorbiopsier eller analyse af cirkulerende tumorceller [17], [18]. Denne præklinisk undersøgelse hævder, at kombinationen kan tilbyde en sikker terapeutisk fordel i ansigtet af 5-FU modstand for kolon kræftpatienter, der har brug flere behandlingsmuligheder.

Støtte oplysninger

figur S1.

ISC-4 og cetuximab kombinationsbehandling ikke falde Ki-67-ekspression eller fremkalde autofagi. (A) Fasekontrastmikroskopi af RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 ug /ml) alene eller i kombination i 12 timer. (B) (B) Flowcytometri og (C) Western bot-analyse af Ki-67 ekspression i RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 ug /ml) alene eller i kombination som bestemt ved. (D) Western blot-analyse af RKO celler behandlet med ISC-4 (2 uM) og cetuximab (1 ug /ml) alene eller i kombination i 24 timer. Chloroquin (C; 10 uM) indgår som en positiv kontrol for autofagi. Beta actin er vist som en belastning kontrol

doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s001

(TIF)

Figur S2.

ISC-4 og cetuximab kombinationsbehandling er sikkert og udøver kooperativ antitumoraktivitet. (A) Kvantificering af TUNEL-farvning i tumorxenotransplantater beskrevet i figur 6B (n = 10). (B) Ændring i kropsvægt af mus, der modtager ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), eller kombinationen (n≥5) to gange om ugen i 2 uger. Ændringer i legemsvægt er udtrykt i forhold til legemsvægten af ​​hver individuel mus før behandling på dag 0 (n≥3). (C) H & E-farvning af levervæv høstet fra mus ved 24 timer efter behandling med ISC-4 (3 mg /kg, i.p.) cetuximab (10 mg /kg, i.v.) eller kombinationen. (D) Terminal tumorvolumen og tumorvægt for HT-29 xenograft beskrevet i figur 6C. Behandlingsrum kohorter inkluderet ISC-4 (3 mg /kg, iv), cetuximab (10 mg /kg, iv), kombinationen eller cetuximab og 5-FU (25 mg /kg, iv) en gang om ugen (n≥8) . (E) Mus kropsvægt ved endpoint, som var tre dage efter den sidste dosis (n≥8). Fejl søjler angiver SEM af replikater

doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s002

(TIF)

tabel S1.

Doser udvalgt til godkendte antitumormidler i kombination med ISC-4. EF

12,5, EF

25, og EF

50 værdier blev estimeret fra litteraturen og doser blev ansat i forsøgene beskrevet i fig. 2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0059380.s003

(XLSX)

tabel S2.

Sammendrag af kombinatoriske virkninger af TIC10 med godkendte antitumormidler. Kombinatorisk aktivitet blev sammenlignet med monoagent aktiviteter ved cellelevedygtighedsassays og bestemt til at være usamarbejdsvillig (-) (?), Samarbejdsvillig (+), synergistisk (*), eller tvetydige. Kombinationer udstillet kooperative aktivitet i mindst én cellelinje er fremhævet i gult mens grøn højdepunkt indikerer synergi

doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s004

(XLSX)

tabel S3.

Kombination indeks for ISC-4 og cetuximab i vildtype-KRAS menneskelige kolon cancer cellelinjer. Kombinatorisk aktivitet i RKO og HT-29 cellelinjer kvantificeret i figur 3A blev vurderet af Chou-Talalay metoden

doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s005

(XLSX)

Tabel S4. Salg Serum kemi profiler af mus, der modtog ISC-4 og cetuximab kombinationsbehandling. Athymiske, kvindelige 8 uger gamle nøgne mus fik ISC-4 (3 mg /kg, i.p.), cetuximab (10 mg /kg, i.v.), eller kombinationen (n≥5) to gange om ugen i 2 uger. Serum blev samlet 2 dage efter den sidste dosis

doi:. 10,1371 /journal.pone.0059380.s006

(XLSX)

Tak

W.S. El-Deiry er en American Cancer Society Research Professor.