PLoS ONE: Novel Farmakologisk Målretning af tight junctions og Focal Adhærencer i Prostata Cancer Cells

Abstrakt

Kræft celle modstand mod anoikis drevet af afvigende signalering påført tumor mikromiljø giver høj invasive potentiale og terapeutisk modstand. Vi har for nylig skabt en ny lead quinazolin-baserede Doxazosin® derivat, DZ-50, hvilket svækker tumorvækst og metastase via anoikis. Genom-dækkende analyse i human prostatacancer-cellelinie DU-145 identificerede primære nedreguleret mål for DZ-50, herunder gener involveret i fokal adhæsion integritet (fibronectin, integrin-α6 og talin), tight junction-dannelse (claudin-11) samt insulin-vækstfaktor-bindende protein 3 (IGFBP-3) og angiogenese modulator thrombospondin 1 (TSP-1). Konfokal mikroskopi demonstrerede strukturelle forstyrrelse af både fokale adhæsioner og tætte overgange ved nedregulering af disse genmål, hvilket resulterer i nedsat celleoverlevelse, migration og adhæsion til ekstracellulær matrix (ECM) komponenter i to androgen-uafhængige human prostatacancer-cellelinier, PC-3 og DU-145. Stabilisering af celle-ECM-vekselvirkninger ved overekspression af talin-1 og /eller udsætte celler for et fibronectin-rigt miljø afbødet virkningen af ​​DZ-50. Tab af ekspression af intracellulære fokal adhæsion signaling effektorer talin-1 og integrin forbundet kinase (ILK) sensibiliseret human prostatacancer til anoikis. Vores resultater tyder på, at DZ-50 udøver sin antitumor effekt ved at målrette de centrale funktionelle intercellulære interaktioner, fokale sammenvoksninger og tætte sammenføjninger, støtter den terapeutiske betydning af dette middel til behandling af fremskreden prostatacancer

Henvisning:. Hensley PJ , Desiniotis A, Wang C, Stromberg A, Chen CS, Kyprianou N (2014) Novel Farmakologisk målretning af tight junctions og Focal Adhæsioner i prostatacancerceller. PLoS ONE 9 (1): e86238. doi: 10,1371 /journal.pone.0086238

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: November 4, 2013; Accepteret: 12. december, 2013; Udgivet: 31 Jan 2014

Copyright: © 2014 Hensley et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health, R01-GRANT00491815 og af National center for Research Resources og National center for Advancing Translationelle Sciences, UL1RR033173. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Bemærk, at forfatterne har erklæret følgende COI: Som den tilsvarende forfatter, Natasha Kyprianou, at hun tjener som en akademisk Redaktør af PLoS ONE Editorial Board, men bekræfter, at dette ikke ændrer sin tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet i vejledningen for forfattere. Desuden er der et patent for materiale relevante i denne artikel, dvs. genereringen af ​​nyt lægemiddel, DZ-50, af forfatterne Dr. Chen og dr Kyprianou. De erklærer dette patent, opkaldt: “Novel antitumormidler og metoder for deres brug i Targeting prostatakræft,” University of Kentucky /Ohio State University Joint Invention, US Patent S.N. 12 /323.073. (Ching-Shih Chen og Natasha Kyprianou, coinventors.) Forfatterne bekræfter, at ejerskabet /opfindelsen af ​​dette patent ikke ændrer deres tilslutning til alle PLoS ONE politikker om deling af data og materialer, som er beskrevet i vejledning til forfattere.

Introduktion

prostatakræft er den anden mest almindelige kræftform blandt mænd, med 206,640 mænd diagnosticeret og 28.088 dør af prostatakræft i 2012 [1]. Kemoterapeutiske målretning af androgen signalering akse i prostatakræft har bidraget til den bedste kræft overlevelse hos mænd. Men en undergruppe af patienterne bliver refraktære over for androgen ablation terapi ved ikke apoptose og udvikler sig til kastrationsresistent prostatacancer (CRPC) [2]. Prostata-kirtel-epitelceller har en iboende behov for overlevelsessignaler bibragt af intercellulære og celle-ekstracellulær matrix (ECM) interaktioner. Fokale adhæsioner er afgørende for både normal kontakt-afhængig signalering ved normale celler og invasion, migration og metastase af maligne celler.

Arbejde fra dette laboratorium identificeret nye anti-tumor virkning, der udøves af medikamenter klassisk anvendes til behandling af benign prostatahyperplasi (quinazolin-α

1-adrenoceptorantagonister) via induktion af den extrinsiske apoptose kaskade (død receptoraktivering, caspase-8 spaltning og inhibering af AKT overlevelse signalering) [3], [4], [5]. Strukturel optimering førte til generering af hidtil ukendte forbindelser, der kan anoikis induktion og hæmning af angiogenese [6], [7]. Anoikis, apoptotisk celledød følgeskader utilstrækkelige celle-ECM-interaktioner, er en kritisk komponent af angiogenese og metastase [8]. Aggressive tumorceller undergrave denne mekanisme, vedligeholdelse overlevelse gennem formidling og såning i fjerntliggende organer [9]. Anoikis modstand er tæt knyttet til øget metastatisk potentiale i mange humane maligniteter, herunder prostatakræft [10], renalcellecarcinom [11], brystkræft [12] samt tumorer af mesenchymal oprindelse [13].

metastase nødvendiggør afbrydelse af cellulære interaktioner med tumormikromiljøet, øget migration og invasion kapacitet og evnen til at overvinde de pro-apoptotiske signaler tilegnes ved formindskede intercellulære og celle-ECM-interaktioner [14]. ECM omfatter et mangfoldigt netværk af cytokiner påvirker cellevækst, motilitet og angiogenese, som kan stilles til rådighed for cellulær brug ved enzymatisk fordøjelse og remodeling [15]. Transmembrane integriner er kendetegnet ved tovejs signalering. Oligomerisering af integrin proteiner om en ECM substrat inducerer konformationelle ændringer, som transmitteres gennem plasmamembranen at modulere affiniteten af ​​intracellulære signalsystemer effektorer på cytosoliske integrin haler [16]. De proteinaggregater, kollektivt kendt som omdrejningspunktet vedhæftning kompleks (FAC), omfatter actin bindende proteiner (Tallinn-1, vinculin, vimentin, paxillin, filamin, ect.), Der stabiliserer cytoskelettet og kinaser (fokal vedhæftning kinase [FAK], integrin -bundet kinase [ILK], og SRC ikke-receptortyrosinkinase), som udbreder intracellulær signalering til kernen. Dette integrin-medieret “outside-in” signalering kaskade kontrol processer afgørende for cellulære funktion og vækst som cellecyklus progression og differentiering [17].

Da actin cytoskeletal netværk gennemgår dynamisk remodeling /organisation, integrin clustering inducerer “inside-out” signalering at øge affinitet integriner til ECM, effektivt etablere en fokal vedhæftning [18]. Ved utilstrækkelig integrin-ECM-interaktioner, celler nedregulerer medlemmer af det anti-apoptotiske Bcl-2-familien og opregulere Fas-ligand (FasL), inducere anoikis via den ydre apoptose pathway [19], [20]. Talin-1 bidrager funktionelt til anoikis-resistens og prostatacancer metastaser ved at øge fokal adhæsionsdannelse og Akt-overlevelse signalering. Vi har for nylig viste en signifikant korrelation mellem talin-1 overekspression og metastase i en musemodel af prostata tumorigenese og i human prostatacancer progression [10].

Farmakologisk udnyttelse af α1-adrenoreceptor antagonist doxazosin® har ført til generation af nye quinazolinforbindelser-baserede forbindelser, med den ledende agent, DZ-50, der har potente anoikis-fremkaldende virkninger mod cancerceller [6]. DZ-50 undertrykker væksten af ​​humane prostata cancer implanteret og hæmmer deres metastatiske potentiale

in vivo

ved at ændre angiogenese, migration og invasion [7] ved at målrette den centrale vedhæftning signalering akse [11]. Nærværende studie undersøgte de cellulære mål for DZ-50 i androgen-uafhængige humane prostata kræftceller. Genom-dækkende analyse identificerede kritiske effektorer af fokal vedhæftning og stramme junction interaktioner, som er målrettet af romanen quinazolin agent.

Materialer og metoder

cellelinier og reagenser

androgen -uafhængige human prostatacancer-cellelinier PC-3 og DU-145 blev opnået fra American Type Tissue Culture Collection og dyrket i RPMI 1640 (Invitrogen) indeholdende 10% føtalt bovint serum (Invitrogen) og antibiotika (PenicilinG /streptomycin, 50 ug /ml). DU-145-celler blev transficeret med pEGFP eller talin-1 plasmider og klonet under G418-selektion (Life Technologies Bethesda Research Laboratories). For at lukke munden på Tallinn-1-ekspression, blev shRNA Tallinn-1 vektor (GIPZ shRNAmir Tallinn-1), der anvendes fra Open Biosystems (Hunsville, AL) og shRNA talin1 DU-145 prostatacancerceller blev udvalgt under puromycin. Polyklonale populationer blev samlet under selektion, og stabile cellelinjer blev karakteriseret ved immunblotting. PC-3-celler blev stabilt transficeret med pTRIPZ vektor indeholdende TRE-ILK shRNA (Thermo Scientific). PC-3 shILK celler blev induceret med 2 ug /ml doxycyclin (Enzo Life Sciences) i to dage. DZ-50, en første generation doxazosin-derivat (Shaw et al, 2004;.. Garrison et al, 2007), blev anvendt ved en koncentration på 5 uM opløst i DMSO for alle behandlinger. Steril DMSO blev brugt til kontrol /ubehandlede prøver.

Cell Levedygtighed Assay

Cellelevedygtighed blev vurderet efter behandling med 5 pM DZ-50 ved hjælp af den kolorimetriske MTT (3- [4,5-dimethyl- – 2-yl] -2,5 diphenyl) assay (1 mg /ml MTT i PBS), og kvantificeret ved anvendelse af en spektrofotometrisk måling. Statistisk analyse af 3 uafhængige eksperimenter, hver udført in triplo, udtrykkes i forhold til den ubehandlede kontrol.

cellemigrationsassay

Anskydning blev påført under anvendelse af en steril pipettespids i sammenflydende cellemonolag i 6- brønds plader. Efter inkubation i 12-48 timer i nærvær af DZ-50 (5 uM) blev sårede områder undersøgt ved lysmikroskopi (Axiovert 10, Zeiss). Celler migrerer til de sårede områder blev talt under et mikroskop. Migration potentiale blev bestemt som det gennemsnitlige antal celler i tre tilfældige high-power (400 ×) felter /brønd. opnås Numeriske data fra tre uafhængige forsøg udført i tre eksemplarer og er udtrykt i forhold til ubehandlede kontroller.

celleadhæsionsassayet

Kulturer af PC-3 og DU-145 underlinjer blev behandlet (24 timer) med DZ-50 (5 uM) og høstet. Celler (1 x 10

5 /brønd) blev tilsat til plader med 6 brønde overtrukket med fibronectin (5 pg /ml, BD Biosciences) og efter en 30-minutters inkubation ved 37 ° C blev cellerne fikseret med 100% ( v /v) kold methanol og underkastet billedanalyse. Antallet af adhærerede celler blev talt i tre repræsentative felter /brønd (400 ×). Numeriske data repræsenterer gennemsnittet af tre uafhængige forsøg udført in triplo og er udtrykt i forhold til ubehandlede kontroller.

Western blot-analyse

Humane prostatacancerceller, DU-145 og PC-3, blev behandlet med DZ-50 (5 uM) til sekventiel perioder og cellelysater blev genereret i lysepuffer (150 mmol /l NaCl, 50 mmol /l Tris (pH 8,0), 0,5% deoxycholsyre, 1% NP40 med 1 mmol /l phenyl methyl-sulfonyl fluorid, pH 7,4). Proteinprøver blev underkastet SDS-PAGE og overført på Hybond-C-membraner (Amersham Pharmacia Biotechnology). Membraner blev inkuberet natten over ved 4 ° C med de specifikke primære antistoffer: Akt (Cell Signaling Technology), phosphoryleret Akt Ser 473 (Cell Signaling Technology), GSK-3β (Cell Signaling Technology), phosphoryleret GSK Ser 9 (Cell Signaling Technology), ILK-1 (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), Claudin-11 (Santa Cruz Biotechnology), Tallinn-1 (Millipore) eller Actin (Calbiochem). Efter inkubering med den respektive primære antistof blev membranerne eksponeret for peberrodsperoxidasemærket sekundære antistoffer og signalet blev detekteret med SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce) og eksponeret på røntgenfilm. Densitometrisk analyse blev udført under anvendelse ImageJ software og værdier udtrykkes i forhold til kontrolgruppen.

Gene (QRT-PCR) Analyse

RNA blev isoleret fra cellelysater ved hjælp TRIzol Reagent (Ambion) og Pure Link RNA Mini Kit (Invitrogen) ifølge producentens. Efter homogenisering og faseadskillelse ved centrifugering (12.000 g, 4 ° C) blev RNA udfældet med isopropanol. Prøver blev centrifugeret (12.000 g, 4 ° C) og cDNA blev syntetiseret ved anvendelse af RNA (1 ug) og revers transkription System (Promega). DNA-array analyse blev udført på University of Kentucky Microarray Core Facility hjælp Affymetrix GeneChip Technology. Transkripterne blev vurderet ved ABI 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems Inc.); hver behandling (5 uM DZ-50, 9 timer) blev udført tre gange.

I RT-PCR-analyse, RNA (1 ug) blev underkastet revers transkription med Reverse Transcription System (Promega). De følgende primere blev udformet (Sigma) for SYBR Green kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) systemet: Fibronectin-1 (F: 5′- TCATGAGGCAACGTGTTATGATG-3 ‘, R: 5′- CGAGATATTCCTTCTGCCACTGT-3′), TALIN- 1, (F: 5’- GCAGAAGGGAGAGCGTAAGATC-3 ‘, R: 5′-TGAGAGAACGGGCTAGCTTCA-3′), Integrin-α6 (F: 5’-CAGAAAGTGTGCATGGAGGAAA-3 ‘, R: 5′- TGGGAATGGGACGCAGTT-3′), og ZO-1 (F: 5’- GGAGCTGCGCTTACCACACT-3 ‘, R: 5′- TTTGCTCCAACGAGATAATTTGG-3’). Følgende primere blev opnået for TaqMan QRT-PCR-system (Invitrogen): 18 s ribosomalt RNA (rRNA), thrombospondin-1, IGF-BP3, Claudin-11, snail. cDNA blev anvendt til QRT-PCR-analyse ifølge respektiv SYBR Green og TaqMan protokoller (Bio-Rad). For QRT-PCR-forsøg blev hver prøve analyseret tredobbelt og data repræsenterer middelværdier fra tre uafhængige forsøg. Numeriske data for transkriptniveauer blev normaliseret til 18 s rRNA i kontroller og udtrykkes i forhold til ubehandlede kontroller.

Immunofluorescens Analyse

Celler forgyldt i 4-brønds kammer slides belagt med Fibronectin (5 ug /ml , BD Biosciences) blev eksponeret for DZ-50 behandling (5 uM) i 12 timer. Celler blev derefter fikseret i 100% (v /v) methanol, og efter blokering ved 4 ° C (5% NGS, 0,3% Triton X), blev udsat for det primære antistof (4 ° C, natten over). Følgende specifikke antistoffer blev anvendt: ILK-1 (Cell Signaling Technology), ZO-1 (Invitrogen), Claudin-11 (Santa Cruz Biotechnology), Snail (Cell Signaling Technology), Tallinn (Millipore). Celler blev derefter inkuberet med fluorochrom-konjugeret sekundært antistof (Invitrogen) (2 timer, stuetemperatur) og underkastet konfokal mikroskopi under anvendelse af et Olympus FV1000 konfokalmikroskop v1.21. og softwareversion FV10-ASW 3.1.

microarray analyse

shTalin eller vektor DU-145 humane prostata cancer celler blev behandlet med DZ-50. RNA-prøver fra celler før eller efter (9 timer) behandling blev forelagt University of Kentucky Microarray core facilitet til analyse på Affymetrix Human Gene 1.0 ST arrays (Affymetrix, Santa Clara, Californien). Forsøget under hver betingelse blev udført i to eksemplarer.

Statistisk analyse

Microarray data blev normaliseret ved hjælp af RMA og analyseret ved hjælp af to-vejs variansanalyse (ANOVA) modeller, med genotype (shTalin eller vektoren) og behandling (før eller efter) som de to faktorer. Kontraster blev genereret at vurdere ændringer i mRNA-ekspression mellem behandlede versus ubehandlede i vektor-celler. Falsk opdagelse sats (FDR) og de tilhørende q-værdier blev beregnet ved anvendelse af fremgangsmåden i REF. Differentielt udtrykte gener blev bestemt på grundlag af FDR 20% og fold forandring 1.5. Statistiske analyser til data fra alle andre forsøg blev udført på grundlag af en prøve eller to-sample t-test efter behov. Hos P 0,05 værdier blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Novel quinazolin DZ-50 inducerer prostatakræft Cell anoikis

anoikis-inducerende effekt af bly quanazoline sammensatte DZ. -50 blev undersøgt i human prostatacancer-cellelinier variabelt udtrykker FAC proteiner, talin-1 og ILK. Stabil transfektion af DU-145-celler resulterede i knockdown af talin (DU-145 shTalin) og overekspression af talin (DU-145 Talin +) (figur 1, panel A). PC-3-celler, der udtrykker en inducerbar shILK vektor påvist effektiv nedregulering af ILK efter induktion med doxycyclin i 48 timer (figur 1, panel A). Der var en tidsafhængig formindskelse i cellelevedygtighed som respons på DZ-50 (figur 1, felt B). Tab af ILK og Tallinn udtryk i PC-3 og DU-145 prostatacancerceller resulterede henholdsvis i forøget følsomhed over for DZ-50, mens Tallinn overekspression undertrykt anoikis. Dataene på felt C (fig. 1) viser, at som reaktion på DZ-50, er prostatakræft ell migration væsentligt forøget. Tab af enten ILK (PC-3-celler), eller talin (DU-145-celler), inhiberede cellemigration, mens yderligere forbedret virkningen af ​​DZ-50. Tab af enten ILK eller Tallinn uafhængigt ført til en betydelig reduktion i celleadhæsion til fibronectin (Fig.1, panel D).

Panel A, højre, western blot afslører, at shILK transfektant PC-3 celler udviser samlede tab af ILK-1 protein-ekspression i forhold til vektor kontrol celler ved induktion med doxycyclin (48 timer). Til venstre DU-145-celler, hvor talin har været tavshed (shTalin) eller overudtrykkes (Talin +), udviser signifikant reduktion eller mærkes overekspression af talin protein niveauer henholdsvis i forhold til parentale DU-145-celler. Panel B, DZ-50 behandling fører til et signifikant fald i prostatacancer cellelevedygtighed i en tidsafhængig måde. Tab af ILK1 øger DZ-50-induceret tab af cellernes levedygtighed; i modsætning talin overekspression giver resistens over for DZ-50 induceret celledød. Panel C, DZ-50 reducerer prostatacancer cellemigrering betydeligt. Tab af talin resulterer i en betydelig reduktion af prostatacancer cellemigrering i forhold til forældrekontrol DU-145-celler. Som reaktion på DZ-50, talin overekspression genopretter celle migreringsevnen med niveauerne i ubehandlede celler. Panel D, funktionelt tab af ILK i PC-3 prostatacancerceller og tab talin i DU-145-celler i væsentlig grad hæmmer evnen hos de respektive prostatacancerceller at klæbe til fibronectin (ECM). Tallinn overekspression markant øger prostatakræft celleadhæsion til fibronectin, i forhold til forældrenes DU-145 og DU-145 shTalin celler. Statistisk signifikans blev sat til * p. 0,05

Identifikation af molekylære mål for Lead quinazolin

Genom-dækkende analyse af genekspression i humane prostatacancer cellelinje DU-145 blev bruges til at identificere de primære mål for DZ-50 (fig. 2). Varmen kort fra genet array analyse efter behandling af prostata cancer celler med DZ-50 (for 9 timer) vises på figur 2 (panel A). DZ-50 resulterede i en signifikant nedregulering af gener, der koder plasma membran associerede proteiner, herunder regulatorer af ECM (

fibronektin

integrin-α

6

), og tætte forbindelser (

claudin-11

), insulin vækstfaktor-bindende protein 3 (

IGFBP-3

), samt angiogenese mediator thrombospondin 1 (

TSP-1

). For at validere panel af kandidat-gen identificeret af den molekylære profilering gen array, vi efterfølgende udført kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR) analyse (fig. 2, felt B). Eksponering af DU-145-celler til DZ-50 (3 og 9 timer) førte til en signifikant inhibering af ekspression for et udvalgt gen signatur identificeret array analyse (fig.2, panel A), herunder gener, der koder for centrale fokale adhæsionssignalering effektorer , intracellulært (Talin) og ekstracellulært (fibronectin) og tight junction proteiner (Claudin-11 og ZO-1). En transkriptionel mediator af EMT,

Snail,

er også reduceret af DZ-50. Den kemiske struktur af quinazolin-baserede forbindelse DZ-50, er vist på felt C (fig. 2).

Felt A, Heat kort over differentielt udtrykte gener i humane DU-145 prostatacancerceller før og efter behandling med DZ-50 (9 timer). Vi identificerede 17 markant nedreguleret gener efter behandling med DZ-50 (9 timer), herunder gener, der koder for ECM regulatorer

fibronektin

integrin α6

, tight junction mægler

Claudin-11

og angiogenese signalering effektor

thrombospondin 1

. (Fold ændring 1,5, falsk opdagelse sats 20%). Panel B, Validering af genekspression ved anvendelse QRT-PCR efter DZ-50 behandling af prostatacancerceller (5 uM) i 3 og 9 timer. En betydelig reduktion i mRNA i forhold til ubehandlede celler blev opdaget for gener involveret i ECM-omdrejningspunkt vedhæftning signalering komponenter

(fibronektin

,

integrin-α6

Tallinn

), stram vejkryds (

claudin-11

), angiogenese (

thrombospondin-1

) og EMT (

Snail

). * Viser signifikant forskel ved p lt; 0,05. Panel C, Molekylær struktur af Doxazosin © derivat, DZ-50.

DZ-50 Mål Vital cellulære interaktioner i Prostata Cancer Cells

For at karakterisere effekten af ​​DZ-50 på tight junctions (TJ) co-lokalisering af ZO-1 og Claudin-11, to proteiner af afgørende betydning for disse intercellulære interaktioner, blev vurderet ved anvendelse fluorescerende konfokal mikroskopi i to forskellige humane prostatacancer-cellelinier, PC-3 og DU-145 (fig . 3, panel A og B henholdsvis). Behandling med DZ-50 (12 timer) markant nedsat Claudin-11-ekspression (rød) i begge parentale cellelinier, hvilket resulterer i væsentlig beskadigelse af TJ formation. Subcellulære lokalisering af ZO-1 (grøn) til plasmamembranen resulterede i respons på DZ-50. Celler, der udtrykker funktionelt tab af de fokale adhæsionsproteiner ILK (PC-3 shILK) og Tallinn (DU-145 shTalin) fastholdt nogle Claudin-11 udtryk på trods af behandling med DZ-50 i forhold til de respektive parentale cellelinjer (hvide pile). Denne ekspression af Claudin-11-komplekser med ZO-1 ved plasmamembranen som dårligt defineret, punktformet TJ komplekser er vist på figur 3 (sammensatte billeder, panel A og B). Som reaktion på DZ-50, var der en tidsafhængig opregulering i ZO-1 proteinniveauer. ZO-1-ekspression blev omvendt korreleret med ekspression af fokal adhæsion protein ILK (fig. 3, panel C og D). Western blot-analyse afslørede, at talin overekspression i DU-145-celler resulterede i nedsat ZO-1 proteinniveauer, mens nedregulering af talin var forbundet med øget ZO-1 (fig. 3, panel E, F).

Karakteristisk konfokal mikroskopi billeder af PC-3 celler (panel A) og DU-145 celler (panel B). Behandling med DZ-50 (12 timer, 5 uM) falder Claudin-11 udtryk og hæmmer tight junction formation. Tight junctions komplekser (pile), kendetegnet ved en lokalisering af tight junction-proteinerne Claudin-11 (rød) og ZO-1) (grøn) er fuldstændigt ophævet ved DZ-50. I PC-3 shILK og DU-145shTalin celler der er svag dannelse af TJ komplekser (pilespidser), som reaktion på DZ-50. DAPI (blå) anvendes til nuklear detektion (felt A og B). Forstørrelse x100. Paneler C-F, Western blots og respektive densitometrisk analyse afslører ekspression af TJ protein ZO-1 som respons på DZ-50 i PC-3 (felt C og D) og DU-145 (felt E og F) prostatacancercellelinjer .

Fluorescensmikroskopi blev anvendt til at undersøge virkningen af ​​DZ-50 på fokale adhæsion dynamik i de to forskellige human prostatacancer-cellelinier PC-3 (fig. 4) og DU-145 (fig. 5). Resultaterne på figur 4 viser, at som reaktion på DZ-50 (12 timer), der var et signifikant fald i talin (rød) og ILK (grøn) proteinekspression kompromittere fokal adhæsion integritet (sammensatte billeder fig. 4, felt A ; DAPI-blå nuklear farvning). For at bestemme virkningen af ​​ECM på det cellulære respons på DZ-50, PC-3-celler blev dyrket i nærvær af fibronectin. Tilstedeværelsen af ​​fibronektin lettet fokal adhæsion stabilisering og vedvarende ekspression af talin og ILK, redning prostatacancerceller fra anoikis effekt af DZ-50 (sammensatte billeder fig. 4, panel A og B). Funktionelt tab af ILK i PC-3-celler (fig. 4, panel B) resulterede i FAC ustabilitet med samtidig nedregulering af talin forhold til parentale PC-3-celler (fig. 4, panel A). Behandling af shILK celler med DZ-50 resulterede i fuldstændig ophævelse af FAC signalering, et fænomen, der blev delvist reddet i nærvær af fibronectin.

PC-3 prostatacancerceller og PC-3-celler, der huser shILK tab af ILK (panel A og B, henholdsvis) blev behandlet med DZ-50 (12 timer, 5 uM) i fravær eller nærvær af fibronectin-ECM. Fluorescerende billeder afslører co-lokalisering af fokal adhæsions regulatorer talin (rød) og ILK (grøn), der skal sprænges ved DZ-50 behandling, sammenlignet med ubehandlede kontroller. DAPI (blå) anvendes til nukleare detektion. Silencing ILK udtryk medfører reduceret påvisning af dens primære opstrøms partner, Tallinn og efterfølgende afbrydelse af fokale sammenvoksninger (panel B), i forhold til forældrenes PC-3-celler (panel A, komposit, fokale sammenvoksninger identificeret i gult). Prostata kræftceller dyrket på en fibronectin substrat (ECM integritet) stabilisere omdrejningspunktet vedhæftning kompleks og mindske målrette evne DZ-50 på disse substrater i både PC-3 forældre og PC-shILK celler. Forstørrelse x100

DU-145 (panel A) og DU-145 shTalin (panel B) blev dyrket i fravær eller nærvær af fibronectin-coating og behandlet med DZ-50.; celler blev efterfølgende udsat for konfokalt mikroskop til påvisning af talin (rød), ILK (grøn), og fokale adhæsioner (gul). Kerner blev detekteret ved DAPI-farvning (blå). DZ-50 faldt omdrejningspunkt vedhæftning dannelse gennem målretning af Tallinn og ILK. Denne effekt blev ophævet ved tilstedeværelsen af ​​fibronectin-ECM, som gav resistens over for DZ-50 (panel A). Tab af Tallinn resulterede i reduceret co-lokalisering med ILK og forsvinden af ​​fokale sammenvoksninger i DU-145 shTalin celler (panel B). Forstørrelse x100. Paneler C-E, Western Blot og kvantitativ analyse af den tidsafhængige effekt af DZ-50 på downstream celle overlevelse signalering. DZ-50 fører til dephosphorylering af overlevelse signalering effektorer AKT (Felt D) og GSK-3β (panel E). Tallinn overekspression giver resistens over for DZ-50 anoikis effekt ved at bevare aktivering /phosphorylering af AKT og GSK-3β signalering.

Vi efterfølgende undersøgt konsekvenserne af Tallinn reduktion på prostatakræft celle omdrejningspunkt vedhæftning integritet og deres følsomhed til DZ-50. Konfokal mikroskopi billeder, der vises på figur 5, viser, at tilstedeværelsen af ​​fibronectin antagoniserede anoikis virkning af lægemidlet på fokale adhæsioner i DU-145-celler (fig. 5, panel A) under funktionelle talin niveauer. Nedregulering af talin i prostatacancerceller resulterede imidlertid i den fokale adhæsion kompleksdannelse afskaffes selv i nærvær af fibronectin (Fig. 5, panel B). Der var ingen så signifikante forskelle i fokale sammenvoksninger i DU-145shTalin celler.

DZ-50 svækker Downstream Intracellulær Survival Signaling

For at undersøge konsekvenserne af DZ-50 på den intracellulære signalering nedstrøms omdrejningspunktet vedhæftning komplekse og tætte sammenføjninger, AKT og GSK3p blev profileret som mellemliggende overlevelse signalering effektorer [11], [21]. Som vist på figur 6 målretning af disse cellulære vekselvirkninger af DZ-50 resulterer i markant reduktion af phosphorylering af både AKT og GSK3p inden for 3-6 timer af behandlingen (paneler B og C). Overekspression af Tallinn i prostata kræftceller induceret fosforylering af Akt og GSK-3β, hvilket fører til øget overlevelse og modstandsdygtighed over for virkningen af ​​DZ-50. I modsætning hertil DU-145 celler med reducerede Tallinn niveauer, udstillet faldt Akt og GSK3p fosforylering (fig. 6, panel C).

DZ-50 mål celle-celle interaktioner (tætte forbindelser) og celle-ECM-interaktioner (fokale adhæsioner) for at reducere intracellulære overlevelse signaler og forstyrre actin cytoskeletal integritet til at inducere anoikis. Stabilisering af fokal adhæsion kompleks signalering ved ECM komponenter og forhøjet talin, forbedrer tovejs integrin signalering, hvilket resulterer i cellulær resistens over for anoikis (højre). DZ-50 mål ekstracellulær, intercellulære og intracellulære sammenvoksninger og signalmolekyler at fremkalde anoikis (venstre).

Diskussion

Genom-dækkende analyse af genekspression i DU-145 human prostatacancer celler afslørede nedregulering af lovende anti-tumor-mål ved den hidtil ukendte quinazolinderivat DZ-50, herunder EMT-associerede gener (integrin-α6, fibronectin og talin), angiogenese forbundet gener (TSP-1), gener forbundet med intercellulær TJs (claudin- 11 og 14) samt serin threonin kinase 31 (TSK31) og insulin vækst faktor bindende protein 3 (IGFBP-3). Konfokal mikroskopi undersøgelse bekræftede, at DZ-50 mål kritiske proteiner involveret i dannelsen af ​​både TJs og fokale adhæsioner dermed svække ekstracellulære interaktioner, aktincytoskelettet integritet og pro-overlevelse intracellulær signalering. Vi har tidligere etableret

in vivo

antitumor virkning af DZ-50 i to humane androgen-uafhængig prostatacancer xenotransplantater, PC-3 og DU-145 [7]. Nylig dokumentation tydede på, at talin bibringer anoikis resistens i prostatacancerceller over for metastaser, via sin evne til at stabilisere fokale adhæsioner og udbrede fokal adhæsion kompleks signalering gennem Akt overlevelse signalering [10]. I den foreliggende undersøgelse under anvendelse af to forskellige androgen-uafhængige human prostatacancer-cellelinier og DU-145 og PC-3, som

in vitro

eksperimentelle systemer, vi demonstreret, at to forskellige intracellulære fokal adhæsion komplekse komponenter, talin og ILK, er målrettet af den ledende quinazolin DZ-50 (fig. 6). Tallinn overekspression giver ufølsomhed over for DZ-50, mens tab af Tallinn reducerede tumorcelleoverlevelse, migration og adhæsion, sensibiliserende prostata kræftceller til anoikis effekt ved DZ-50. De fænotypiske ændringer og forøget følsomhed over for DZ-50 observeret i DU-145-celler med lav talin ekspression, og PC-3-celler, der huser tab af ILK funktion, understøtter en regulerende rolle for disse to kritiske komponenter i den fokale vedhæftning kompleks i cancercelle anoikis modstand. Figur 6 illustrerer en mekanistisk skemaet for DZ-50 medierede anoikis signalering. Tight junctions er placeret på apicobasal plasmamembranen og danner en selektivt permeabel barriere afgørende for væske- og elektrolytbalancen. Claudins er transmembrane adhæsionsproteiner, der spænder over intercellulære rum til dannelse homo- eller heterodimerer på modstående celler [22]. Cytoplasmatiske haler af claudins interagerer med actin-stabiliserende proteiner, zonula occludins (ZO) [23]. Claudin-1 opregulering er associeret med colorectal tumor progression via anoikis modstand, beviser, der forbinder anoikis til tætte forbindelser påvirket af Bc-2 og AKT overlevelse signalering [24].

Målretning af kritisk intra- og ekstracellulære fokale vedhæftning komponenter i