PLoS ONE: Udvikling og karakterisering af et antistof-mærket Super-Paramagnetisk jernoxid kontrastmiddel Targeting Prostata Cancer Cells for Magnetic Resonance Imaging

Abstrakt

I denne undersøgelse har vi udviklet, karakteriseret og valideret

in vitro

en funktionel superparagmagnetic jern-oxid baseret magnetisk resonans kontrastmiddel ved at konjugere et kommercielt tilgængeligt jernoxid nanopartikel, Molday ION rhodamin-B Carboxyl (MIRB), med en deimmunized muse monoklonalt antistof (muJ591) målretning prostataspecifikt membran-antigen (PSMA ). Denne funktionelle kontrastmiddel er beregnet til specifik og ikke-invasiv detektion af prostatacancerceller som er PSMA positive, en markør impliceret i prostata tumorudvikling og metastase. To-trins carbodiimid reaktion anvendes til at konjugere antistoffet til nanopartikel var effektiv og vi opnåede en elementær jernindhold fra 1958 ± 611 per antistof. Immunfluorescens mikroskopi og flowcytometri viste, at den konjugerede muJ591: MIRB kompleks specifikt binder til PSMA-positive (LNCaP) celler. The muJ591: MIRB kompleks reduceret celleadhæsion og celleproliferation på LNCaP-celler og forårsagede apoptose som testet ved Annexin V assay, hvilket antyder anti-tumorigene egenskaber. Målinger af T2-relaksationstiden for muJ591: MIRB kompleks under anvendelse af en 400 MHz Innova NMR og en multi-ekko spin-ekko sekvens på en 3T MR (ACHIEVA, Philips) viste en signifikant T2 afslapning reduktion tid for muJ591: MIRB kompleks, med en reduceret T2-relaksationstiden som funktion af jernkoncentrationen. PSMA-positive celler behandlet med muJ591: MIRB viste en signifikant kortere T2-relaksationstiden som opnået ved anvendelse af en 3T MR scanner. Reduktionen i T2 afslapning tid til muJ591: MIRB, kombineret med dens specificitet mod PSMA + LNCaP celler, antyder dens potentiale som en biologisk bestemt MR-kontrastmiddel

Henvisning:. Bates D, Abraham S, Campbell M, Zehbe i, Curiel L (2014) Udvikling og karakterisering af et antistof-mærket Super-Paramagnetisk jernoxid kontrastmiddel Targeting Prostata Cancer Cells for Magnetisk resonans Imaging. PLoS ONE 9 (5): e97220. doi: 10,1371 /journal.pone.0097220

Redaktør: Roberto Furlan, San Raffaele Scientific Institute, Italien

Modtaget: December 13, 2013; Accepteret: 16. april, 2014 Udgivet: 12 maj, 2014

Copyright: © 2014 Bates et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Ontario Institute for Cancer Research gennem en forskningsbevilling (10NOV-446) og de nationale Sciences and Engineering Research Council of Canada. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de sidste 10 år er forekomsten af ​​prostatakræft er støt steget, forbliver den næsthyppigste kræft diagnosticeret hos mænd verden over. I Canada alene, det tegner sig for omkring 27% af nydiagnosticerede kræfttilfælde i 2012 [1]. Prostata tumor vækst og spredning er ofte meget langsom og forblive uopdaget i tidlige stadier af kræft. Aktuel påvisning og behandling planlægning stærkt afhængig af brugen af ​​prostata specifikt antigen (PSA) udtrykkende celler. Imidlertid har den lave specificitet denne test ført til overbehandling af tidlig og mindre aggressiv cancer og under-behandling af indolent men aggressiv cancer, fører til høje [2] morbiditet. Desuden nuværende behandlinger har høj sygelighed og mulige efter behandling tilbagefald, hvilket kompromis patientens livskvalitet og overlevelse [3], [4].

Undersøgelser har antydet, at, ved specifikt at målrette prostataspecifikt membran-antigen (PSMA) udtrykkende celler, både lokal og aggressive tilstande kan behandles [3], [5] – [17]. PSMA er et stærkt kendetegnet prostatacancer biomarkør lokaliseret til prostatacancer cellemembranen, hvilket antyder dets anvendelighed til

in vivo

prostatacancer specifikke målretningsstrategier [8], [9], [13] – [17]. PSMA-genet er blevet klonet, sekventeret og kortlagt til kromosom 11q14, og den udtrykkes i en høj andel af maligne prostata epitelceller, men ikke i den normale vaskulære endotel [6]. Faktisk PSMA er den mest veletablerede højt begrænset prostata epitelcelle membran-antigen, hvorimod PSA og prostatasyrephosphatase er sekretoriske proteiner [9], [17]. Immunterapeutiske og afsløring tilgange, der bruger anti-PSMA-antistoffer er blevet foreslået som fremragende værktøjer til både påvisning og behandling af prostatacancer [8], [9], [13].

PSMA receptorer er lokaliseret primært til apikale plasmamembran prostata epitel og spiller en integrerende rolle i progressionen af ​​prostata maligniteter, sandsynligvis ved at fremme anti-apoptotisk signalering, sikrer celle modstandskraft og fremme celleproliferation [6], [18]. Målretning denne receptor med anti-PSMA J591 antistof har vist sig at være en effektiv påvisning og terapeutisk værktøj for prostatakræft [10] – [12]. For at være klinisk relevant, muse-monoklonalt (mAb) anti-PSMA-receptoren er de-immuniseret ved udskiftning af murine immunoglobulinsekvenser med humane immunoglobulinsekvenser, hvilket resulterer i en ikke-immunogen, humaniseret antistof, huJ591 [9], [13] – [15]. Den huJ591 mAb har været flittigt brugt i kliniske fase I forsøg, hvor det har vist sig at være veltolereret uden negative vært immunrespons [9], [14], [15].

endorectal magnetisk resonans (MRI) er ved at blive almindelig del af den lokale oparbejdning for prostatakræft. Dynamiske undersøgelser med anvendelse af gadolinium-DTPA kontrastmidler har vist nyttige forøgelse af tumor billeder [19] – [27]. Ikke-invasiv påvisning af PSMA-udtrykkende celler kunne ideelt set udføres af funktionelle kontrast-forstærket MRI teknikker. Kontrastmidler forbedre kontrasten af ​​væv ved at ændre relaksationstider af væv for at forbedre synligheden af ​​strukturer via MRI. Sådanne påvisningsmetoder kræver udvikling af funktionelle MRI-kontrastmidler, for eksempel forbinder anti-PSMA-antistof til MRI-kontrastmidler. Molday ION Rhodamin-B Carboxyl (MIRB) er en kommercielt tilgængelig jern-oxid baseret nanopartikel der reducerer T2 afslapning tid absorberende væv og dermed blive opdaget som et tab i signal på MR-billeder [28], [29]. Jernoxidkernen af ​​MIRB nanopartikel kan kemisk aktiveret til at reagere med det aminoterminale af proteiner eller antistoffer for at danne en peptidbinding, hvilket gav et antistof /protein: MIRB konjugatkompleks. En nylig undersøgelse viste, at MIRB kan anvendes til mærkning af stamceller, cancerceller og immunceller bevare høje celle levedygtighed og påvises ved MRI [28]. MIRB lethed af konjugering med protein eller antistof, dets høje belastning koncentration af jern til MR-billeddannelse og god celle tolerabilitet gør det til en god kandidat til et funktionelt antistof-mærket MR-kontrastmiddel.

I denne undersøgelse udviklede vi en funktionel super-paramagnetiske jernoxid (SPIO) -baseret MR-kontrastmiddel, som specifikt binder til PSMA receptorer for MR billeddannelse af prostatacancerceller. Vi præsenterer en metode til at udvikle denne funktionelle MR-kontrastmiddel ved hjælp af en kommercielt tilgængelig SPIO, Molday ION rhodamin-B Carboxyl (MIRB), konjugeret til anti-PSMA-receptor-antistof J591. Vi karakteriseret og valideret dette antistof: SPIO-nanopartikel kompleks for specifik påvisning af PSMA-positiv prostata cancer tumor celler under anvendelse immunfluorescens, flowcytometri og 3T klinisk MRI. Vores nye kontrastmiddel kan anvendes til det specifikke og ikke-invasiv detektion af prostatacancerceller med PSMA, en markør impliceret i prostata tumorudvikling og metastase [10] -. [17], [30], [31]

Materialer og metoder

Antistoffer, MR-kontrastmidler og reagenser

Murine J591 mAb, i en koncentration på 5 mg /ml og med kendt specificitet for PSMA, blev indkøbt fra Dr. Neil H Bander laboratorium (laboratoriet for Urologiske Oncology, Weill-Cornell Medical College, New York, NY, USA) gennem en institutionel materiale overdragelsesaftale. Den isotypekontrolantistof til syntese og celledyrkningsforsøg var et murint IgG1 (muse-monoklonalt IgG1 Klon # 11711; Cat #: MAB002, R kun en puffer (negativ kontrol) blev tilsvarende spaltet. Alle prøver blev kørt på Varian Vista Pro CCD samtidig ICP-OES instrument (Varian Inc, Palo Alto, CA, USA).

Scanning Electron Microscopy (SEM) og Energi Dispersive X-ray (EDX) spektroskopi

De komplekse muJ591: MIRB blev immobiliseret på en Nucleopore membran (Cat #: 800.280, Whatman, Florham Park, NJ, USA) og opvarmet ved 57 ° C i en varm ovn i 25 min luft for at fjerne fugt. Den immoblized kompleks blev derefter monteret og Katodeforstøvningscoatet med carbon. SEM billeder blev erhvervet ved 5000 og 10.000 × forstørrelse ved hjælp af en Hitachi Su-70 Schotty Field Emission SEM (Hitachi High Technologies America Inc, Dallas, TX, USA) med en opløsning på 1,5 nm ved 1 kV. Det samme system blev anvendt til at udføre Energy Dispersive X-ray (EDX) spektroskopi ved 5000 × forstørrelse for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​organisk stof og SPIO nanopartikler.

Particle-size analyse

Partikel størrelse muJ591: MIRB konjugat blev bestemt ved dynamisk lysspredning. The muJ591: MIRB konjugat blev dispergeret i 0,9% saltvand ved en proteinkoncentration på 0,01% w /v. Målingerne blev udført ved hjælp af en Zetasizer Nano ZS instrument (Malvern Instruments, Worchestershire, UK). størrelse resultater De partikel blev rapporteret som den harmoniske intensitet gennemsnit partikel diameter (eller Z-gennemsnittet), og de er udtrykt i nanometer.

kernemagnetisk resonans (NMR) analyse

For at afgøre, om muJ591 : MIRB konjugat genereret fra reaktionerne mærkning bibeholdt de super-paramagnetiske karakteristika for et MR-kontrastmiddel, målte vi T2-relaksationstiden i NMR. Prøver med lige samlet proteinkoncentration (0,04 ng /nl) af muIgG: MIRB og muJ591: MIRB komplekser blev fremstillet separat i 600 pi deuteriumoxid og overført til Wilmad NMR-rør (Cat #: Z272019, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO , USA). T2 relaksationstider blev opnået efter optimering af magnetfelt Innova Unity 500 NMR maskine og prøver blev kørt som pr fabrikantens anbefalinger.

Fluorimetrisk analyse

For at teste, om konjugering reaktion forårsaget fluorescensforøgelse eller slukning af rhodamin-B fluorophor på MIRB konjugater udførte vi en fluorimetrisk analyse. MIRB nanopartikler og muJ591: MIRB komplekser prøver med et lige jernkoncentration blev analyseret for fluorescensintensitet og bølgelængde ved topintensitet (λ

max) under anvendelse af en Synergy4 fluorimetrisk pladelæser (BioTek, Winooski, VT, USA). Den maksimale λ

max og λ

max skift blev bestemt ved at plotte værdierne fluorescens intensitet ved forskellige excitations- og emissionsbølgelængder.

Cell kultur

PSMA-positive LNCaP celler (CRL -1740) og PSMA-negative DU145 celler (HTB-81) blev indkøbt fra American Type Cell Culture, Manassas, VA, USA. Alle celler blev dyrket i en 37 ° C, 5% CO

2 incubator anvendelse af RPMI-1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika /antimykotika. Cellerne blev dyrket til 80% sammenløb i 75 cm

2 ventileret hætte, canted hals falk kolber (Cat #: 353136, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) med medier genopfyldes hver tredje dag

antistof: MIRB kompleks specificitet for PSMA Salg

celler blev podet ved en startkoncentration på 1000 (for DU145) og 2000 celler (for LNCaP) pr brønd i 96-brønds plader og dyrket i 3 dage før udførelse af forsøgene. Immunfluorescens undersøgelser blev derefter udført på både LNCaP og DU145 efter behandling med 0,1 ug /uL muJ591: MIRB i 1 time med eller uden tilsætning af sekundært antistof konjugeret til AlexaFluor-488 fluorofor. Derefter blev celler inkuberet med varm 0,5% BSA i RPMI-medium at tilskynde celler til at internalisere antistof. Cellerne blev derefter visualiseret ved forskellige tidspunkter (15 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 4 h, 6 h og 12 h) under en standard inverteret fluorescensmikroskop (Axiovert 200, Carl Zeiss. Gottingen, Tyskland ) fastgjort til et lukket kredsløb kamera (12-bit, Q-Imaging, Surrey, Canada).

a flowcytometrisk assay blev udført baseret på en modifikation af fremgangsmåden beskrevet af Peldschus K et al (2010) [ ,,,0],32]. Celler blev frigjort under anvendelse af trypsin-EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA), som blev inaktiveret ved vask med 10% FBS RPMI-1650. Celler blev derefter vasket to gange med serum-frit RPMI-1640, før tilsætningen af ​​250 uL muIgG, muIgG: MIRB, muJ591, muJ591: MIRB (proteinkoncentration på 0,05 ug /pi) efterfulgt af 1 times inkubation på is. De ubehandlede kontroller blev inkuberet i et ækvivalent volumen af ​​serum-frie medier. Cellebundet antistofkonjugater blev markeret til påvisning under anvendelse Phycoerthyrin-konjugeret ged anti-mus IgG (Cat # 550.589, BD Pharmingen). Flowcytometri blev derefter udført under anvendelse af et FACSCalibur indretning (Becton Dickson, Franklin Lakes, NJ, USA). Fluorescensmåling blev givet som geometriske middelværdier og medianer af 10.000 begivenheder og afbildet som diagrammer. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer, og vi sammenlignede signal intensitet skift mellem ubehandlede celler og celler behandlet med muIgG, muIgG: MIRB, muJ591 eller muJ591:. MIRB

Cell vedhæftning

Cell vedhæftning efter behandling af plader med muJ591 og muJ591: MIRB blev evalueret. The muJ591: MIRB kompleks og muJ591 mAb blev fremstillet i 1 × phosphatbufret saltvand (PBS) ved en koncentration på 0,01 ug /mL. Vi derefter præcoatede plader med 96 brønde med 100 pi muJ591: MIRB kompleks og muJ591 mAb i firdobbelte, og inkuberet natten over ved 4 ° C til immobilisering af komplekset på pladens overflade. Efter inkubation natten over, vi aspireret ud opløsningen og blokeret brøndene med 1% BSA i 1 × PBS i mindst 10 minutter og aspireret ud igen. Ikke-behandlede brønde blev anvendt som kontrol. Omkring 100.000 LNCaP eller DU145 celler blev derefter podet i præcoatede og kontrol brøndene og inkuberet ved 37 ° C, 5% CO

2 i 40 minutter. Celler blev til slut vasket med serum-frit RPMI-1640 indtil celler i ikke-coatede brønde stoppet afmontering. Alle celler blev derefter fikseret ved hjælp af is-kold methanol og farvet med 0,1% krystalviolet. Filtreret 2% SDS blev tilsat, og pladerne blev inkuberet under omrøring ved stuetemperatur i 30 minutter, hvorefter, absorbansaflæsninger ved 550 nm blev taget med PowerWave XS pladelæser (BioTek, Winooski, VT, USA). Vi sammenlignede absorbanslæsninger fra muJ591- og muJ591:. MIRB-coatede plader med hensyn til de ubehandlede kontrolbrønde at analysere vedhæftning

celledeling og apoptose

For celledeling vurdering, en resazurin -baserede fluorimetrisk analyse (Cat # AR002, R A, B og T2 er montering parametre [34]. En parametrisk billeddannelse af T2-relaksationstiden blev opnået for alle billeder af antistof-prøver og antistof-behandlede celler. Den gennemsnitlige T2-relaksationstiden for hvert antistof og levende celleprøve blev opnået fra T2 værdier for hver pixel i disse parametriske billeder.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af Graphpad Prism software ( GraphPad Software Inc, La Jolla, CA, USA). Alle data blev testet for normalitet og varianshomogenitet ved hjælp af en Shapiro-Wilks test og en Bartlett test, henholdsvis før du vælger en egnet parametrisk eller ikke-parametrisk statistisk test. En resulterende p-værdi på mindre end 0,05 blev anset for at være betydelig. Parametriske datasæt blev analyseret ved anvendelse Students t-test eller envejs-ANOVA efterfulgt af en passende post hoc såsom en Tukey HSD. Ikke-parametriske datasæt blev analyseret ved hjælp af en-vejs Kruskal Wallis ANOVA efterfulgt af en Nemenyi indlæg hoc, og Friedman tests efterfulgt af en parvis sammenligning ved hjælp af en Wilcoxon-test med en justering Bonferroni.

Resultater

antistof: MIRB kompleks molekylær karakterisering

ICP-AES blev brugt til at anslå mængden af ​​elementært jern til stede i hver af de konjugerede muIgG: MIRB og muJ591: MIRB komplekser. Vi observerede, muJ591: MIRB komplekser havde 1958 ± 611 (n = 8) elementært jern pr antistof mens muIgG: MIRB komplekser havde 2906 ± 631 (n = 8) elementært jern pr antistof. Det jern nanopartikler tilstedeværelse på muJ591: MIRB kompleks blev yderligere bekræftet af Energy Dispersive X-ray spektroskopi (figur 1). Tilstedeværelsen af ​​jern blev også bekræftet ved en hurtig T2 relaksationstiden opnået ved NMR-analyse ved 400 MHz, som var 12,9 ± 0,7 ms ved den muJ591: MIRB kompleks og 10,2 ± 0,6 for muIgG:. MIRB kompleks

A. Scanningselektronmikrograf (SEM) af immobiliseret muJ591: MIRB komplekser og B. Energy Dispersive X-ray (EDX) kortlægning til Fe, C, O og N overlejret på SEM. Tilstedeværelsen af ​​MIRB nanopartikler kan observeres som jern signal (udfyldt pil), og antistoffet som organisk materiale signal (stiplet pil). De store hvide strukturer er salte fra den tørrede buffer

Tilstedeværelsen af ​​muJ591:. Kan observeres MIRB kompleks immobiliseret på saltkrystaller fra bufferen i de overlejrede EDX-SEM billeder (figur 1). EDX kortlægning viste tilstedeværelsen af ​​carbon, nitrogen og hydrogen tyder tilstedeværelsen af ​​organiske komponenter (antistof) samt jern fra MIRB nanopartikel

De gennemsnitlige partikelstørrelser for muJ591:. MIRB konjugater var 34,75 ± 14,41 nm med en polydispersitet indeks (PDI) værdi på 0,23 ± 0,01. Til sammenligning, vi udførte partikelstørrelse målinger for de MIRB nanopartikler alene og opnåede 34,64 ± 10,83 nm med en PDI på 0,25 ± 0,02, som ligger inden for de værdier, der rapporteres af fabrikanten (35 nm)

Antistof:. MIRB kompleks specificitet

immunfluorescensmikroskopi blev anvendt til at bestemme, om PSMA positive LNCaP-celler specifikt blev påvist ved den muJ591: MIRB kompleks. Figur 2 viser 2 timer efter behandling tid-punkt for både LNCaP og DU145 celler behandlet med muJ591: MIRB kompleks. AlexaFluor-488 farvning tillod lokalisering af antistoffet i under-cellulære og ekstracellulære regioner af PSMA-udtrykkende LNCaP-celler (figur 2A). Rhodamin-B fluorophor (rød), som er fastgjort til MIRB specifikt påvist i PSMA-udtrykkende LNCaP-celler (figur 2C). Ingen røde eller grønne fluorescerende signaler blev observeret i DU145 kontrol cellelinje (figur 2B og 2D) tyder høj specificitet muJ591: MIRB kompleks i påvisning PSMA-positive prostatacancerceller

Fluorescens mikroskopi-baseret detektion af PSMA-. positiv prostatacancer-cellelinie med muJ591: MIRB kompleks: Sekundært antistof-farvning konjugeret til AlexaFluor-488 viser bindingen af ​​J591 antistof i (A) LNCaP og henviser (B) DU145 kontrolceller har ingen binding; og (C) Rhodamin-B fluorophor blev observeret på LNCaP-celler (PSMA-positive) og ikke på (D) DU145 celler (PSMA-negative).

Fluorescens afkølende og forbedring emission er blevet rapporteret for metal-fluoroforen konjugat systemer [35]. Vi bestemt, at fluorescerende quenching fandt sted i vores system ved at sammenligne fluorescensintensiteten og peak λ

max MIRB alene og muJ591: MIRB kompleks (figur 3). Den λ

max for MIRB alene var 575 nm, mens for muJ591: MIRB komplekset, λ

max viste to distinkte toppe mellem 560-575 nm. Desuden fluorescensintensiteterne mellem peak Å-

max værdier var 40 ± 2% lavere for muJ591: MIRB kompleks sammenlignet med MIRB alene. Denne reduktion i spidsværdi og skiftet i peak λ

max værdier for rhodamin-B fluorofor tyder på, at konjugation kan quenche fluorescensen kapacitet Rhodamin-B fluorofor for komplekset.

Virkning af antistofkonjugering på den relative fluorescensintensitet af Molday ION rhodamin-B-kompleks (n = 3)

specificitet og optagelse af muJ591:. MIRB sammenlignet med den ikke konjugerede muJ591 og styre muIgG blev undersøgt på live prostatakræft cellelinjer under anvendelse af flowcytometri. LNCaP-celler behandlet med muJ591 eller muJ591: MIRB viste en signifikant fluorescensintensitet skift på FL-2 sammenlignet med de ubehandlede celler eller MIRB-eneste behandling og de begge havde en lignende forskydning (figur 4A). Skiftet til muJ591 og muJ591: MIRB behandling af LNCaP-celler viser, at der er specifik og høj optagelse af antistoffet og antistof-nanopartikel komplekset ved PSMA-positive celler, og at den ikke ændre sig efter konjugering med nanopartikel. Ikke-specifik binding som testet af muIgG og muIgG: MIRB blev ikke observeret (Tabel 1). Kontrol DU145 celler blottet for PSMA viste ikke skift i intensitet for enhver behandling (figur 4B)

specificitet og Forbruget af muJ591:. MIRB, muIgG: MIRB, muJ591 og muIgG af prostata kræftceller. A. LNCaP celler præsenterede et skift, der viste optagelse af muJ591 og konjugat muJ591: MIRB og ingen optagelse for kontrollerne muIgG antistof eller muIgG: MIRB antistofkonjugat. B. Kontrol DU145 celler viste ikke optagelsen

Antistof:. MIRB komplekse funktionalitet

Vi bestemmes de potentielle anti-proliferative, pro-apoptotiske og anti-tumorigene effekter af den muJ591: MIRB konjugeret nanopartikler. På plader overtrukket med både muJ591 og muJ591: MIRB absorbansaflæsningen viste en reduceret klæbeevne på LNCaP-celler podet efter overtrækning (figur 5A, s 0,01). Der var ingen forskel på virkningen på klæbeevnen mellem muJ591 antistoffet og muJ591: MIRB kompleks (p = 0,7). Overtrækket havde også en virkning på DU145 celler klæbeevne, men det var mindre udtalt (figur 5B). Disse resultater antyder, at virkningen af ​​muJ591 antistof på celle klæbeevne forblev upåvirket af antistoffet mærkning med MIRB.

A. Markant reduceret vedhæftning på LNCaP-celler (t-test, ** p 0,01, n = 4) blev observeret som en reduktion på absorbans forårsaget af både muJ591 mAb og muJ591: MIRB belægning. B. Adhæsion blev også reduceret med denne belægning på DU145 celler, men effekten var ikke så udtalt.

Resazurin-baserede fluorometriske assays udført ved 2, 6, 12, og 24 timer efter behandling bestemmes anti-proliferative virkninger af muJ591: MIRB på PSMA-positive LNCaP prostata kræftceller. En tidsafhængig formindskelse i celleproliferation for LNCaP-celler og ingen ændring i PSMA-negative DU145 celler blev observeret (figur 6). Dette antyder, at muJ591: MIRB var yderst specifikt at begrænse celledeling af LNCaP celler

Effekt på celleproliferation af LNCaP og DU145 prostata cancer celler efter muJ591:. MIRB behandling på forskellige tidspunkter opnået som den normaliserede resazurin fluorescerende enhed (RFU) værdi for behandlede celler end ikke-behandlede celler. LNCaP celler viste en signifikant lavere RFU end kontrol vehikelbehandlede LNCaP celler, der starter ved 6 timer tid-point, mens der sås ingen signifikante ændringer i muJ591: MIRB-behandlede DU145 celler. Student t-test, * p 0,05 betragtes som væsentlig, n = 4.

Der var signifikant højere niveauer af Annexin V-positive celler i muJ591: MIRB-behandlede LNCaP-celler sammenlignet med kontrollen (vehikel eller muIgG : MIRB) behandlet LNCaP-celler. Figur 7 viser procentdelen af ​​levende og døde LNCaP-celler som vurderet af Annexin V flowcytometri i nærvær af muJ591: MIRB og kontrolbehandlinger;