PLoS ONE: WAVE3-NFKB Interplay er afgørende for overlevelse og Invasion of Cancer Cells

Abstrakt

WAVE3 cytoskeletal protein fremmer kræft invasion og metastase. Vi har vist, at WAVE3-medieret aktivering af cancercelleinvasion skyldes til dels, at dens regulering af ekspression og aktivitet af centrale (MMP’er), herunder MMP9, som er centralt involveret i invadopodia-medieret nedbrydning af den ekstracellulære matrix ( ECM). MMP9 er også en vigtig NFKB målgen, hvilket antyder en potentiel binding af WAVE3 til denne vej, som vi forsøgte at undersøge. Mekanistisk, fandt vi, at tab af WAVE3 i cancerceller fører til inhibering af NFKB signalering som følge af et fald i den nukleare translokation af NFKB og derfor tab af aktivering af NFKB målgener. Omvendt overekspression af WAVE3 var tilstrækkelig til at forøge NFKB-aktivitet. Både farmakologiske og genetiske manipulationer af NFKB effektormolekyler viser, at den biologiske konsekvens af tab af WAVE3 funktion i NFKB pathway resultere inhiberingen af ​​invadopodia dannelse og ECM nedbrydning ved cancerceller, og disse ændringer er en konsekvens af nedsat MMP9-ekspression og aktivitet. Tab af WAVE3 også sensibiliserede cancerceller for apoptose og celledød drevet af TNFa, gennem inhibering af AKT pro-overlevelse pathway. Vores resultater identificerer en ny funktion af WAVE3 i NFKB signalering, hvor dens aktivitet er afgørende for regulering af invadopodia og ECM nedbrydning. Derfor målrettet terapeutisk hæmning af WAVE3 vil bevidstgøre kræftceller til apoptose og celledød, og undertrykke cancer invasion og metastase

Henvisning:. Davuluri G, Augoff K, Schiemann WP, Plow EF, Sossey-Alaoui K (2014 ) WAVE3-NFKB Interplay er afgørende for overlevelse og invasion af kræftceller. PLoS ONE 9 (10): e110627. doi: 10,1371 /journal.pone.0110627

Redaktør: Chengfeng Yang, Michigan State University, USA

Modtaget: 13 juli, 2014 Accepteret: September 16, 2014; Udgivet: 16 Okt 2014

Copyright: © 2014 Davuluri et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde fik støtte fra tilskud P01 HL073311 og R01 HL096062, National Institute of Health, NIH.gov, EFP; og tilskud P30 CA43703, Case Comprehensive Cancer Center, Case.edu, at KS-A og WPS. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Metastase er en kompleks proces, der kræver cancerceller til at flygte fra deres primære site, overleve i blod /lymfesystemet og derefter at etablere en ny niche på et fjernt [1] site. Under denne proces, også omtalt som invasionen-metastase kaskade, cancerceller udnytter specialiserede F-actin rige fremspring kaldet invadopodia, at koncentrere den enzymatiske aktivitet af MMP’er at nedbryde ECM’en, således at cancercellerne at invadere og migrere gennem deres mikromiljø [2], [3]. Wasp /WAVE proteiner spiller centrale roller i flere cellulære processer, herunder celleform, motilitet, cytokinese samt cancercelleinvasion [4] – [6]. WAVE3 især har vist sig at være afgørende for motilitet og invasion af cancerceller [7] – [9] ved at bidrage til dannelsen af ​​lamellipodia udvidelser ved forkanten af ​​invasive celler [8], [10]. Ekspressionen af ​​WAVE3 er også stærkt beriget med flere kræftformer, herunder brystcancer (BC) [11] – [14]. Faktisk blev forstærket ekspression og aktivitet af WAVE3 vist sig at bidrage metastasen af ​​triple-negative brystcancere (TNBC), den mest aggressive subtype af BC [14] – [16].

Nuclear faktor NFKB-aktivering er kendt for at være impliceret i overlevelsen, invasion og metastase af forskellige typer af cancere [17], [18]. Aktivering af NFKB pathway er nødvendig for forskellige fysiologiske og patologiske reaktioner spænder fra monteringen af ​​en vellykket immunrespons og overlevelse og proliferation af cancerceller [19] – [21]. NFKB-familien af ​​transkriptionelle faktorer består af fem medlemmer, p50, p52, RelA (p65), RelB og c-Rel, som danner homomere eller heteromere dimerer for at aktivere transkription af målgener [22]. I hvilende celler, er NFKB opretholdes i en transkriptionelt hvilende tilstand ved at blive afsondret i cytoplasmaet i proteinkomplekser med medlemmer af inhibitorer af IkappaB (IKB) familie, herunder kBa, IκBβ, IκBε. I klassiske forløb, kan TNFa inducerer IKB kinase (IKK) medieret phosphorylering og proteasomalaktivitet nedbrydning af kBa, efterfulgt af phosphorylering og nuklear translokation af p50-p65 heterodimer for at aktivere transskription af NFKB målgener [23]. NFKB er blevet vist at stimulere produktionen af ​​MMP’er, herunder MMP1, MMP3, og MMP9 [24] – [26]. Interessant nok har vi og andre vist, at WAVE3 også kan regulere ekspressionen og aktiviteten af ​​disse MMP’er, hvilket tyder på potentielle rolle WAVE3 /NFKB samspil i reguleringen af ​​MMP9 og invadopodia aktivitet i cancerceller [8], [10].

Her præsenterer vi beviser for, at metastaser fremmer aktiviteten af ​​WAVE3 opnås dels gennem dens regulering af NFKB signalering i kræftceller. Vi viser, at tabet af WAVE3 i den metastatiske BC MDA-MB-231 celler resulterer i inhibering af NFKB-aktivitet. Omvendt overekspression af WAVE3 forbedrer NFKB signalering. Vi viser, at WAVE3-medieret modulering af NFKB er påkrævet for invadopodia dannelse samt MMP9-ekspression og aktivitet, der er nødvendige for kræftceller at nedbryde ECM’en. Endelig viser vi, at målrettet-inhibering af WAVE3 sensibiliserer cancerceller for apoptose og celledød gennem hæmning af Akt og caspase overlevelse veje nedstrøms for NFKB. Derfor vores data etablere en ny funktion for WAVE3, der er afgørende for reguleringen af ​​NFKB signalering og understøtte brugen af ​​WAVE3 hæmmere i kombinationsbehandlinger til specifikt at målrette kræft metastaser.

Eksperimentelle Procedurer

Antistoffer

Rabbit anti-WAVE3 (1:1000), kanin-anti-MMP9 (1:1000), kanin-anti-MMP2 (1:1000), kanin-anti-p38 (1:1000), kanin-anti phospho p38 (1:1000), kanin phospho ERK (1:1000), kanin ERK (1:1000), kanin-anti phospho AKT (Ser473, 1:1000), kanin-anti panAKT (1:1000), kanin-anti phospho JNK (1 :1000), kanin-anti-JNK (1:1000), muse-anti-phospho p65 (Ser536) (1:1000), kanin-anti-Cortatcin er fra cellesignalering Technologies. (Danvers, MA); muse-anti-GFP, muse-anti-Wave2 (1:3000), muse-anti-WAVE1 (1:3000) er fra Santa Cruz Biotechnology Inc (Santa Cruz, CA); kanin-anti-NFKB p65 (1:5000) fra Biolegend (San Diego, CA), kanin-anti NAP1 (1:2000), kanin-anti ABI1 (1:5000), kanin-anti CYFIP2 (1:3000), muse-anti-actin (1:5000), kanin-anti-Myc (1:1000) er fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); ged peberrodsperoxidasekonjugeret anti-muse-IgG (1:5000) og gede-peberrodsperoxidasekonjugeret anti-kanin IgG (1:5000) fra Calbiochem; og Alexa 488-konjugeret anti-kanin IgG og Alexa 568-konjugeret anti-muse-IgG, Alexa 568-konjugeret phalloidin er fra Invitrogen. Vecta-skjold med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole var fra Vector Laboratories (Burlingame, CA). Gelelektroforese reagenser var fra Bio-Rad (Hercules, CA).

siRNA og shRNA genekspression knockdown

Vi brugte On-Targetplus SMARTpool (Thermo Scientific) siRNA L-012141-00- 0010, L-1012301-00-0010, CYFIP2HSS120271, ABI1HSS11589 (Invitrogen), og SignalSilence kBa siRNA (Cell Signaling Technology) for transient knockdown af ekspressionen af ​​Wave2, WAVE3, CYFIP2 og ABI1 henholdsvis som tidligere beskrevet (14). Stabil knockdown af WAVE3 blev opnået gennem transfektion af MDA-MB-231 og BT549 BC-celler med enten kontrollen ikke-targeting shRNA eller WAVE3 MISSION shRNA kloner (Sigma) efterfulgt af puromycinselektion af positive kloner som beskrevet tidligere (12).

Cell Culture

Humant MDA-MB-231 BT549 og MCF7 BC-celler blev anskaffet fra American Type Culture Collection (ATCC) og blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder af penicillin /ml, 100 ug streptomycin /ml. For stimulering med TNFa blev cellerne først udsættes for serumudsultning natten over i DMEM uden kalvefosterserum, og derefter behandlet med 50 ng /ml TNFa eller fortyndingsmidlet DMSO (basale betingelser) som den negative kontrol behandling i 15 min. For proteinsynteseinhibering, blev celle behandlet med cycloheximid (CHX; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 50 ug /ml og inkuberet i 24 timer. For proteasomhæmning blev celler behandlet med MG-132 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ved 20 uM koncentration og inkuberet i 24 timer. Den Akt-inhibitor MK-2206 (Select Chemicals, Yorktown, TX) blev anvendt ved en slutkoncentration på 10 uM til behandling celler i 16 timer, mens IKKβ-inhibitor (EMD Millipore, Billerica, MA) blev anvendt ved en slutkoncentration på 10 uM til behandling celler i 24 timer.

Flowcytometri

MDA-MB-231 eller BT549-celler, transficeret med enten kontrollen ikke-targeting shRNA eller shWAVE3, blev behandlet med TNFa for 3 timer og opformeret i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) dyrkningsmedium suppleret med 10% FBS og puromycin (5 ug /ml). Subkonfluente cellekulturer blev frigjort ved trypsinisering og vasket med Hanks balancerede saltopløsning med Ca2 +, Mg2 +, og 0,1% BSA. Celler blev bearbejdet til flowcytometri som beskrevet af producenten (Roche In-situ Celledød Detection Kit, Fluorescein). Propidiumiodid er blevet anvendt til at detektere døde celler. Alle data er erhvervet i en BD LSRII instrument og analyseret med FlowJo 7.6.3 (Treestar) software. Ikke-specifik binding af det sekundære antistof alene til cellerne blev trukket fra alle flowcytometrisk data til opnåelse af de heraf fluorescens intensitetsværdier, der vises.

immunoblotanalyse Salg

Helcellelysater indeholder lignende mængder af total protein (-50 ug) blev opløst på en 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel, efterfulgt af overførsel til nitrocellulose (Bio-Rad, Hercules, CA) eller Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA) membraner ved hjælp af Bio-Rad gel og overførsel apparat. Membraner blev inkuberet i 5% sødmælk eller bovint serumalbumin i 1 time ved stuetemperatur, vasket med phosphatbufret saltvand (PBS) efterfulgt af inkubation med det primære antistof (som beskrevet) natten over ved 4 ° C. Membraner blev derefter vasket og inkuberet i det passende sekundære antistof ved stuetemperatur i 1 time, og immunkomplekser blev visualiseret under anvendelse af Western Lights kemiluminescensdetektion kit fra Perkin-Elmer (Boston, MA). Signaler blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ software i henhold til de parametre, der er beskrevet i ImageJ brugerguide (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Gennemsnitlige værdier fra 3 forskellige blots er vist.

NFKB Luciferase Reporter Assay

Cignal NFKB reporter assay kit fra Qiagen Inc (Valencia, CA) blev anvendt ifølge producentens instruktioner. Kort fortalt, MDA-MB 231 eller BT549-celler blev co-transficeret med siWAVE3 eller siWAVE2 med NFKB reporter, negative og positive kontroller, sammen med en Renilla luciferase reporter konstrukt for intern normalisering. Efter 24 timer blev celler behandlet med 50 ng /ml af rekombinant human TNFa i 30 minutter med mindre andet er angivet. Dual luciferase assays (Promega, Madison, WI) blev udført i en 96-brønds plade under anvendelse Veritas Microplate Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA), og promotoraktivitet værdier er udtrykt i arbitrære enheder efter normalisering til luciferaseaktivitet af Renilla reporter. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer, og standardafvigelserne af værdier er angivet.

immunfluorescensmikroskopi

Celler blev dyrket på dækglas og fikseret i 4% paraformaldehyd i 20 minutter i PBS ved stuetemperatur og vasket med PBS. Cellerne blev derefter permeabiliseret i 0,2% Triton X-100 i PBS i 15 minutter, vasket igen med PBS og inkuberet i blokeringsopløsningen indeholdende 5% bovint serumalbumin (Sigma) i PBS i 2 timer ved stuetemperatur. Primære såvel som sekundære antistoffer blev fortyndet til den anbefalede koncentration i 5% bovint serumalbumin i PBS. Celler blev inkuberet med det primære antistof i 1 time, vasket med PBS og derefter inkuberet med det sekundære antistof i 1 time. Actinfilamenter (F-actin) blev farvet med rhodamin-konjugeret phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR) i PBS. Dækglassene blev monteret på objekt objektglas under anvendelse Vectashield mounting medium indeholdende 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Fluorescens billeder blev taget med et Nikon TE2000-E omvendt mikroskopi. Signaler blev kvantificeret ved hjælp af ImageJ software i henhold til de parametre, der er beskrevet i ImageJ brugerguide (https://rsbweb.nih.gov/ij/docs/guide/146.html). Gennemsnitlige værdier for 5 forskellige billeder blev afbildet.

gelatinezymografi

gelatinezymografi acrylamidgeler (10%) blev fremstillet ifølge standardprocedurer [8]. Gelatine blev tilsat til gelen opløsning til en endelig gelatine koncentration på 1 mg /ml. Den cellefri supernatant blev blandet med 2 x prøvebuffer, inkuberet ved stuetemperatur i 10 minutter, og 25 pi af blandingen blev fyldt på gelerne. Efter elektroforese blev gelen inkuberet i Zymogram renaturering puffer med forsigtig omrøring i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt inkubation i zymogrammet udvikle buffer ved 37 ° C i mindst fire timer. Gelatinaseaktivitet blev visualiseret ved farvning af gelerne med Coomassie Brilliant Blue G250 og affarvet i eddikesyre-methanol-dH

2O (01:03:06). Områder af protease aktivitet blev fotograferet med et spejlreflekskamera.

Invadopodia dannelse Assay

FITC-gelatine nedbrydning blev udført som pr fabrikantens procedure (Invitrogen). Kort fortalt blev dækglas (18 mm diameter) overtrukket med 50 ug /ml poly-L-lysin i 20 minutter ved stuetemperatur, vasket med PBS, fikseret med 0,5% glutaraldehyd i 15 minutter og vasket med PBS i 3 gange. Efter vask blev dækglassene inverteret på en dråbe 0,2% FITC konjugeret gelatine i PBS indeholdende 2% saccharose, inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur, vasket med PBS i 3 gange, standset med natriumborhydrid (5 mg /ml) i 3 min og endelig inkuberet i 2 ml komplet medium i 2 timer. Celler (2 x 10

5 hver brønd) blev udpladet i FITC gelatineovertrukne dækglas og inkuberet ved 37 ° C i 12 timer. Invadopodia og ECM nedbrydning blev dokumenteret ved hjælp af fluorescens konfokal mikroskopi som beskrevet [27], [28]. Signal analyse og rekonstruktion af 3D-billeder blev udført ved hjælp af ImageJ software.

statistiske analyser

Data præsenteres som betyder ± standardafvigelser af mindst tre uafhængige forsøg. Resultaterne blev testet for signifikans under anvendelse af en uparret Students

t

test. En

s Drømmeholdet værdi mindre end 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

WAVE3 er nødvendig for NFicB aktivitet

For at dokumentere samspillet mellem WAVE3 og NFKB signalering brugte vi en luciferase-baserede NFKB reporter assay at vurdere ændringer i NFKB-aktivitet i nærvær og fravær af WAVE3. Som en positiv kontrol for NFKB-aktivering, vi anvendte TNFa, en kendt stimulator af NFKB-signalering. Vi fandt, at TNFa behandling af MDA-MB-231 eller BT549-celler forøget NFKB-aktivitet med mindst 3 gange i begge cellelinier sammenlignet med ikke-stimulerede celler (fig. S1 i File S1). Men i WAVE3-knockdown (sh-W3) celler (fig. 1A indsat), luciferaseaktiviteten, og derfor NFKB-aktivitet, blev reduceret med mindst 4 gange sammenlignet med MDA-MB-231 transficeret med kontrol ikke-målretning shRNA (Ctrl-sh) (fig. 1A). Således blev WAVE3 kræves til NFKB-aktivitet. Denne inhibering af NFKB-aktivitet var specifik for tabet af WAVE3 siden knockdown af Wave2 ekspression, et andet WAVE isoform, havde ingen virkning på af NFKB-aktivitet (fig. S2 i File S1).

(A) Luciferase-baserede NFKB reporter assay i MDA-MB-231 celler med stabil transfektion af en ikke-targeting shRNA (Ctrl-sh) eller WAVE3-trageting shRNA (sh-W3). (Indsat) Western blot-analyse af proteinlysater af celler, der er beskrevet i (A) med anti-WAVE3 antistof. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. (*, P 0,05). (B) Western blot-analyse med de angivne antistoffer af proteinlysater fra Ctrl-sh MDA-MB-231 og to forskellige shWAVE3-afledte kloner (sh-W3-1 og sh-W3-2), før og efter TNFa behandling (50 ng /pl i 15 min). Tallene under p-p65 og WAVE3 paneler angiver gange ændring af p-p65 og WAVE3 niveauer, henholdsvis i forhold til de ubehandlede Ctrl-SH-celler. (C) Kvantificering af p-p65-niveauer i de angivne betingelser. (D) Western blot analyse med p65 antistof af de nukleare lysater fraktion fra Ctrl-sh og sh-W3 MDA-MB-231-celler, med eller uden TNFa behandling. H2b blev anvendt som en loading kontrol for den nukleare fraktion. Tallene under H2b panelet angiver fold ændring p65 niveauer med hensyn til de ubehandlede Ctrl-SH-celler. (E) Immuno-farvning for nuklear translokation (hvide pile) i p65-protein (rød) i Ctrl-sh og shWAVE3 MDA-MB-231-celler. Celler kerner er counter-farvet med DAPI (blå). (F) Kvantificering af p65 nuklear farvning. Alle data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter, eller er middelværdier ± SD (n = 3; *, p 0,05; t-test)

phosphorylering af NFKB p65-underenheden i serin 536 og dets nukleare translokation er nødvendige foranstaltninger for NFKB aktivering. Vi fandt tab af WAVE3 i MDA-MB-231-celler signifikant at hæmme (3- til 8-fold reduktion) p65 phosphoryleringsniveauerne (fig. 1B og 1C). Selv efter stimulering med TNF, kunne p65 phosphoryleringsniveauerne i WAVE3-knockdown celler ikke gendannes til de niveauer, der findes i ikke-targeting shRNA-transfekterede celler (Fig. 1B og 1C). Lignende resultater blev fundet i BT549-celler (Fig. S3 i File S1). Derudover nuklear translokation af p65, hvilket er den ultimative trin i aktiveringen kaskade af NFKB-signalering, blev også signifikant inhiberet i WAVE3-knockdown MDA-MB-231-celler, som målt ved niveauerne af p65-protein i kernen (10 fold fald) af både immunblotting af den nukleare fraktion af cellelysater (fig. 1D) og immunfarvning analyser (5 gange formindskelse) af hele celler (fig. 1E, 1F og fig. S4 i File S1). Igen, stimulering af WAVE3-knockdown celler med TNF undladt at øge p65 indenfor den nukleare fraktion til niveauer, der findes i kontrol celler transficeret med kontrollen ikke-targeting shRNA (fig. S4 i File S1). Tilsammen udgør disse data understøtter yderligere inddragelse af WAVE3 i aktiveringen af ​​NFKB signalvejen.

WAVE3 overekspression aktiverer NFicB signalering aktivitet

For bedre at forstå, hvordan WAVE3 modulerer NFKB signalering, vi anvendte en kombination af genetiske og farmakologiske midler til at manipulere effektormolekyler i NFKB-vejen. Først undersøgte vi, om overekspression af eksogen WAVE3 kan påvirke NFicB aktivitet. For at gøre dette, vi overudtrykt enten GFP alene eller GFP-WAVE3 fusionsproteinet i MDA-MB-231 celler og vurderet for NFicB aktivitet. Brug af luciferase-baserede NFKB reporter assay beskrevet i figur 1A, fandt vi overekspression af WAVE3 (fig. 2A) stimulerede NFKB-aktivitet ved 3 ganges forøgelse (fig. 2B). I overensstemmelse med denne observation, WAVE3-overexpresion også stimuleret ( 3-dobling) p65 phosphorylering uden at påvirke den samlede p65 ekspressionsniveauerne (Fig 2C.). Omvendt behandling med en specifik inhibitor af IKKβ (IKKβ-I), opstrøms aktivator af NFKB-signalering, sløvet den TNFa-medierede stimulering af phospho-p65 i WAVE3-overudtrykker MDA-MB-231-celler (0,9-fold ændring i TNFa og IKKβ-i-behandlede celler vs. 3,2-gange ændring i TNFa alene behandlede celler (fig. 2D)). Således er disse data understøtter yderligere rolle WAVE3 i reguleringen af ​​NFKB signalering. Dernæst monitorerede vi p65-protein-phosphorylering og omsætning i GFP og WAVE3-overudtrykker MDA-MB-231-celler efter behandling med cyclohexamid (CHX), en potent inhibitor af

de novo

proteinsyntese. Mens phosphorylering niveauer af p65 blev forøget (~3- til 4 gange stigning) i WAVE3-overekspression celler, har behandling med CHX ikke påvirke ekspressionsniveauerne af total p65 (fig. 2E). Ligeledes havde behandling med MG-132, en forbindelse, der inhiberer proteasomet-medieret proteinnedbrydning, ikke påvirke WAVE3-medierede stigning i phosphoryleret p65 i WAVE3 overudtrykker celler (fig. 2F), mens niveauerne af total p65 forblev uændret ( fig. 2F). Således viser disse data, at WAVE3-medierede modulering af NFKB signalering ikke kræver inddragelse af WAVE3 i protein neo-syntese (den CHX data, fig. 2E) eller t proteasom-medieret proteinnedbrydning (MG-132 data, Fig . 2F).

(A) Western blot-analyse af WAVE3-GFP-proteinniveauer i GFP og GFP-W3-udtrykkende celler. (B) Luciferase-baserede NFKB reporter assay i GFP og GFP-WAVE3 udtrykkende celler (*, p 0,05). (C F) Western blot-analyse med de angivne antistoffer af cellelysater fra GFP og WAVE3-GFP-udtrykkende celler efter behandling med cyclohexamid (CHX, E) og proteasominhibitor MG132 (F). Tallene under GFP panel angiver fold-change p-p65 niveauer med hensyn til GFP-celler. p-actin blev anvendt en belastning kontrol. Alle data er repræsentative for 3 uafhængige eksperimenter, eller er middelværdier ± SD (n = 3; *, p 0,05; t-test)

WAVE3-medieret modulering af NFKB-signalering ikke gør kræve andre medlemmer af WAVE regulatoriske kompleks

WAVE3, ligesom de øvrige medlemmer af WASP /WAVE familie, er kendt for at fungere som en aktivator af ARP2 /3-komplekset til fremme af actinpolymerisation og cytoskelettet remodeling. For WAVE proteiner til at udføre denne cytoskeletal reorganisering funktion, skal det inkorporeres i et pentamert proteinkompleks, også benævnt WAVE regulatoriske kompleks (WRC) at der ud til WAVE proteiner, indeholder også NAP1, ABI1 /2, CYFIP2 og HSPC300 [29]. Derfor vi behandlet spørgsmålet om, hvorvidt WAVE3-medierede modulering af NFKB signalering kræver inddragelse af de øvrige medlemmer af WRC. Først viste vi, at mens siRNA-medieret knockdown af WAVE3 resulterede i en signifikant hæmning ( 8-fold fald) i WAVE3 udtryk, var det ikke påvirke ekspressionsniveauerne af de øvrige fire medlemmer af WRC (figur 3A.). Omvendt siRNA’er rettet mod enten ABI1 eller CYFIP2, hvilket resulterede i selektiv tab af udtryk for deres respektive mål, påvirkede ikke ekspressionsniveauerne af de øvrige medlemmer af WRC (fig. 3A). Funktionelt, og som forventet, WAVE3-knockdown inhiberede NFKB signalering (5 gange formindskelse), som målt ved tabet phosphorylering af p65 (fig. 3B). Ikke desto mindre faldt udtryk for nogen af ​​de andre medlemmer af WRC (ABI1 og CYFIP2) påvirkede ikke phosphoryleringsniveauerne af p65 (fig. 3B). Endvidere mens stimulering med TNF forøget p65 phosphoryleringsniveauerne i både kontrol- og knockdown-celler, phosphorylering niveauer i WAVE3-knockdown celler var mere end to gange mindre end i kontrolgruppen siRNA celler eller ABI eller CYFIP2 siRNA-celler (fig. 3B). Tilsammen udgør disse resultater klart tyder på, at WAVE3-medierede modulering af NFKB signalering ikke kræver deltagelse af medlemmerne af WRC, og derfor repræsenterer en aktivitet WAVE3 uafhængig af sin traditionelle actin polymerisering ejendomsret i WRC.

(a) Western blot-analyse med de angivne antistoffer af MDA-MB-231-celler transient transficeret med en ikke-targeting siRNA (Ctrl-si) eller siRNA targeting enten WAVE3 (si-W3), ABI1 si-ABI1), eller CYFIP2 (si-CYFIP2). (B) Western blot-analyse med p-p65 og total p65 antistoffer fra cellelysaterne beskrevet i (A). Tallene under β-actin-panel angiver fold-change p-p65-niveauer i forhold til de ubehandlede Ctrl-si-celler. I både (A) og (B), blev β-actin-anvendt som en loading kontrol.

Ekspression og aktivitet af MMP9, en større NFKB målgen, inhiberes af tab af WAVE3

Vi har tidligere vist, at stabile knockdown af WAVE3 resulterer i tab af ekspression og aktivitet af adskillige MMP’er, herunder MMP1, 3 og 9 [8]. Blandt disse MMP, MMP9 er et vigtigt mål for NFKB vej, øge muligheden at WAVE3 kan være involveret i NFicB-medieret regulering af MMP9. Først brugte vi Western blotting for at fastslå, at MMP9-ekspression blev inhiberet som et resultat af stabil knockdown af WAVE3; faldet i MMP9 protein var -5-fold i MDA-MB-231 (Fig. 4A) og -4-fold i BT549-celler (Fig. S5 i File S1). Notatet blev ekspressionsniveauerne af WAVE1 og Wave2 ikke påvirket af tab af WAVE3, og har derfor ingen indflydelse på ændringerne i MMP9 niveauer forårsaget af WAVE3-knockdown (fig. 4A). Dernæst brugte vi gelatinase zymografi analysen at vise MMP9 aktivitet blev også hæmmet (5-fold fald) i de WAVE3-knockdown celler (fig. 4B). Derudover stimulering med TNFa, som er en vigtig aktivator af NFKB-signalvejen, forstærkede (~3.5 gange stigning) MMP9-aktivitet i kontrolcellerne (Ctrl-sh). Men i WAVE3-knockdown celler, stimulering med TNF ikke var i stand til at aktivere MMP9 til niveauet i kontrol celler (Fig. 4C). Således disse resultater tyder, at WAVE3-medieret regulering af MMP9 kan udøves gennem modulation af NFKB signalering. Derfor kan ekspression og aktivitetsniveauer af MMP9 anvendes som udlæsning til WAVE3-medieret modulering af NFKB aktiveringsniveauer.

(A) Western blot-analyse med de angivne antistoffer af cellelysater af MDA-MB-231-celler transficeret med ikke-targeting shRNA (Ctrl-sh), og to forskellige sh-WAVE3 kloner (sh-W3-1 og sh-W3-2). Tallene under WAVE3 og MMP9 paneler angiver fold ændring WAVE3 og MMP9 niveauer med hensyn til de ubehandlede Ctrl-SH-celler. p-actin blev anvendt som en loading kontrol. (B) gelatinezymografi af aktiveret MMP9 og MMP2 i konditionerede medier af Ctrl-sh to sh-W3-kloner. C) gelatinezymografi af aktiveret MMP9 før og efter behandling med TNFa i de konditionerede medier af Ctrl-sh og to sh-W3 kloner. I begge (B) og (C), er Red-Ponceau-farvede geler vist som lastning kontrol. Tallene under de zymografi paneler angiver fold ændring af MMP9 niveauer i forhold til de ubehandlede Ctrl-sh celler.

WAVE3 er nødvendig for invadopodia dannelse og ECM nedbrydning gennem NFKB signalering

den biologiske betydning af tab af WAVE3 og dens effekt på NFKB signalering blev undersøgt gennem evnen af ​​kræftceller til at danne invadopodia og forringe ECM, som begge kræver MMP9 aktivering drevet af NFKB signalering. MDA-MB-231-celler, som mest invasive cancercellelinier, danner invadopodia

in vitro

når podet på komponenter af den ekstracellulære matrix. Til overvågning af MMP9 aktivitet i invadopodia blev MDA-MB-231-celler coatet på fluorescerende gelatineovertrukne dækglas. Efter farvning for F-actin blev invadopodia observeret som dot-lignende klynger af F-actin på den ventrale overfladen af ​​cellerne, der er i direkte kontakt med gelatine underlag (fig. 5A panel a). Disse invadopodia strukturer overlapper lokaliteter af nedbrydning af gelatine matrix (fig. 5A, panel b og c) og kan visualiseres i 3-dimensional (3-D) rekonstruerede billeder som invaginationer i gelatine seng (fig. 5A panel d) . Cortactin er en velkendt markør for invadopodia (fig. S6 i File S1). Vi fandt, at TNF-behandling af MDA-MB-231 resulterede i co-lokalisering af WAVE3 med Cortactin på invadopodia strukturer (fig. 5B), i overensstemmelse med inddragelse af WAVE3 i invadopodia formation.

(A) Konfokal mikroskopisk mikrografier af MDA-MB-231-celler dyrket på FITC-mærket gelatine og farvet for (a) F-actinfilamenter (rød). De hvide pilespidser peger på invadopodia strukturer (hvide pletter). (B) Områder i ECM-nedbrydning (sort pil-hoved) er vist som sorte pletter. De invadopodia strukturer falder sammen med de områder, ECM nedbrydning i det flettede billede (c). (D) I den 3-dimensionelle rekonstruerede billede de sorte pile peger på invadopodia (rød) infiltrerer gelatine seng (grøn). (B) Konfokal mikroskopiske mikrografier af MDA-MB-231 celler dyrket på collagen-coatede dækglas, behandlet med TNFa (50 ng /pl) i 15 min, og farvet for WAVE3 (venstre panel) og Cortactin (midterste panel). De pilespidser peger på områder med invadopodia hvor både Cortactin og WAVE3 colocalize i det flettede billede i højre panel (gule pletter).

Vi anvendte denne gelatine-baserede invadopodia assay til at vurdere effekten af WAVE3 på dannelsen af ​​invadopodia og efterfølgende nedbrydning af ECM ved MDA-MB-231-celler. Vi fandt en signifikant reduktion af både antallet af invadopodia (fig. 6A, venstre panel, og fig. 6B), samt det samlede areal af invadopodia-medieret nedbrydning af gelatine i WAVE3-knockdown-celler sammenlignet med den ikke-targeting shRNA kontrol (Ctrl-sh) MDA-MB-231 celler (figur 6A, midterste panel og fig. 6C). Der var mere end 3 gange reduktion (p 0,05) i antallet af invadopodia (Fig 6B.) Og mere end 10 gange reduktion (p 0,05) inden for ECM-nedbrydning i WAVE3-knockdown-celler sammenlignet med den kontrolceller (fig. 6C). Mens Vore data viser, at tabet af WAVE3 hæmmer både invadopodia dannelse og nedbrydning af ECM, dette fænomen synes at påvirke flertallet af de observerede under mikroskopet celler, og omhyggelig analyse af vores data fandt ikke et fald i antallet af celler, der danner invadopodia og nedbryde ECM’en, snarere, tab af WAVE3 synes at have en global effekt. Behandling med TNFa, hvilket resulterede i en betydelig stigning i antallet af invadopodia i kontrolcellerne (p 0,01), var ikke i stand til at redde inhiberingen af ​​invadopodia grund af nedsat WAVE3 (Fig 6D . 6E). Omvendt overekspression af WAVE3 i de ikke-invasive MCF7 BC-celler (Fig S7A i File S1), som vi tidligere havde vist sig at stimulere deres invasionsevne [30], resulterede i en klar stigning i både invadopodia dannelse og gelatine nedbrydning af TNF -stimulerede celler (fig. S7B i File S1).

(A) konfokal mikroskopi mikrografier af kontrol shRNA- eller sh-WAVE3-udtrykkende MDA-MB-231-celler dyrket på FITC-mærket gelatine og farvet for F actin filamenter (venstre paneler). De hvide pilespidser peger på invadopodia strukturer (hvide pletter). β-actin blev anvendt som en loading kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. β-actin blev anvendt som en loading kontrol.