PLoS ONE: Ja-associeret protein (YAP) Modulerer Onkogene Funktioner og Stråling Følsomhed i Endometrie Cancer

Abstrakt

Baggrund

Ja-associeret protein (YAP) er en transkriptionel co-aktivator og regulerer celleproliferation og apoptose. Vi undersøgte den kliniske og biologiske betydning af YAP i endometriecancer (EMCA).

Metoder

YAP udtryk i 150 primære tumorvæv fra patienter med EMCA blev evalueret ved immunhistokemi og dens tilknytning til klinisk-patologisk data blev vurderet. De biologiske funktioner af YAP blev bestemt i EMCA cellelinjer gennem knockdown /overekspression af YAP. Rolle YAP i modulerende stråling følsomhed blev også undersøgt i EMCA celler.

Resultater

Øget nukleare YAP udtryk var signifikant forbundet med højere lønklasse, scene, lymfo-vaskulære rum invasion, postoperative gentagelse /metastaser og samlet overlevelse i østrogen medieret EMCA, kaldet type 1 kræft (p = 0,019, = 0,028, = 0,0008, = 0,046 og = 0,015, henholdsvis). I multivariat analyse blev nukleare YAP udtryk bekræftet som en uafhængig prognostisk faktor for den samlede overlevelse i type 1 EMCA. YAP knockdown af siRNA resulterede i et signifikant fald i celleproliferation (p 0,05), forankringsafhængige vækst (p = 0,015) og migration /invasion (p 0,05), og en signifikant stigning i antallet af celler i G0 /G1 fase (p = 0,002). Omvendt YAP overekspression fremmes celleproliferation. Klonogen assay vist bedre radiosensitivitet med ca. 36% i YAP hæmmede celler.

Konklusioner

Siden YAP fungerer som en transkriptionel co-aktivator, dens differential lokalisering i kernen af ​​kræftceller og efterfølgende indvirkning på celledeling kan få stor betydning i forhold til sin rolle som et onkogen i EMCA. Nuklear YAP ekspression kunne være nyttig som en prognostisk indikator eller terapeutisk mål og forudsige stråling følsomhed hos patienter med EMCA

Henvisning:. Tsujiura M, Mazack V, Sudol M, Kaspar HG, Nash J, Carey DJ, et al . (2014) Ja-associeret protein (YAP) Modulerer Onkogene Funktioner og Stråling Følsomhed i endometriecancer. PLoS ONE 9 (6): e100974. doi: 10,1371 /journal.pone.0100974

Redaktør: Hong Wanjin, Institut for Molekylær og Cell Biology, Biopolis, USA

Modtaget: Februar 22, 2014 Accepteret: 1 juni 2014; Udgivet: 27 juni 2014

Copyright: © 2014 Tsujiura et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Finansiering af arbejde i denne publikation var fra Grant SRC-075 Clinic Research Fund, Geisinger Medical center og Rice Cancer Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Endometriecancer (EMCA) er den fjerde mest almindelige kræftform og de mest almindelige gynækologisk kræft i amerikanske kvinder, med cirka 8200 dødsfald og 49500 nye tilfælde i USA i 2013 [1]. Mens kvinder med EMCA generelt har en god prognose med 81,5% 5-års overlevelse (2003-2009), har forekomsten og dødeligheden af ​​EMCA fortsatte med at stige i gennemsnit 1,1% og 0,4% henholdsvis hvert år i de sidste 10 år [2 ]. De seneste stigninger i forekomsten af ​​endometriecancer satser er blevet overvejet i høj grad tilskrives fedmeepidemien [3]. Selvom forbedringer i diagnostiske teknikker og peri-operative ledelse har resulteret i en stigning i tidlig påvisning af EMCA og gunstig prognose, kvinder diagnosticeret med fremskreden eller recidiverende sygdom har meget værre overlevelsesrater og begrænsede muligheder adjuverende behandling. Genekspressionsstudier har identificeret nogle gener, der udtrykkes forskelligt i EMCA, såsom

PTEN

,

KRAS

,

CTNNB1

,

PIK3CA

FGFR2

[4], [5], [6], [7]. I kliniske omgivelser imidlertid få molekyler er blevet analyseret som terapeutiske og /eller diagnostiske biomarkører. Derfor identifikation af biologiske markører og deres downstream mål er afgørende for personalisering behandlingsformer og forbedre resultatet og livskvaliteten hos patienter med EMCA.

EMCA er blevet kategoriseret i to typer. Type 1 cancer udgør ca. 80% af EMCA og karakteriseres som østrogen afhængige, østrogen receptor (ER) og progesteron receptor (PR) positiv med endometrioide morfologi og generelt en positiv prognose [8]. Omvendt type 2 kræft er østrogen-uafhængig, ER /PR negative, dårligt differentieret og forbundet med et langt dårligere prognose [9]. Standardbehandling for begge typer indeholder en kirurgisk fjernelse af livmoderen, livmoderhalsen, bilaterale æggeledere og æggestokke. Patienter, hvis tumorer demonstrerer høj risiko funktioner kan desuden undergå lymphadenectomy. Tidlige fase EMCA med høj risiko funktioner, såsom dyb myometrisk invasion, er lymfo-vaskulære rum invasion (LVSI) og høj kvalitet forbundet med en risiko 15-25% for tilbagefald [10]. Adjuverende strålebehandling, den mest almindelige form for terapi for debuterende højrisikopatienter, er blevet fundet i flere undersøgelser for at mindske bækken og vaginal recidiv 12-14% uden terapi til 3-4% med terapi, men stadig uden en tilsvarende forøgelse i samlet overlevelse [11], [12]. Med andre ord, strålebehandling udsætter et stort antal kvinder til toksicitet uden nogen klar fordel i den samlede dødelighed, især de fleste patienter, der vil være fri for sygdom i fravær af yderligere behandling. Strålebehandling bruges også til tidligere ubehandlede patienter med lokal /regional tilbagefald. Men trods stråling, 50% af patienterne med lokalt recidiv vil i sidste ende dø af deres sygdom [13], hvilket indebærer, at disse patienter har stråling tumorer og kan have haft fra alternativ behandling, såsom kemoterapi. Identificering markører for stråling følsomhed /resistens ville muliggøre skræddersyet terapi til den mest effektive kur og mindske unødig stråling-induceret toksicitet.

Ja-associeret protein (YAP) blev første gang identificeret i kraft af dets evne til at associere med Ja og Src proteintyrosinkinaser [14].

YAP

genet er lokaliseret på humant kromosom 11q22, koder en transkriptionel co-aktivator og er en af ​​de to vigtigste nedstrømseffektorer af Hippo tumor suppressive pathway [15]. Hæmning af Hippo sti fører til Yap aktivering, nuklear lokalisering og øget aktivitet af transkriptionelle målgener, såsom

CTGF

AREG

[16], [17]. Omvendt aktivering af Hippo sti fører til Yap phosphorylering, cytoplasmatisk binding og inaktivering. Yap serin 127 til alanin (S127A) mutanten er en konstitutivt aktiv form, der forbliver i kernen og er transkriptionelt aktiv. YAP regulerer balancen mellem celleproliferation og apoptose [18], [19], [20], og forstærkes i en række humane maligniteter herunder bryst-, esophageal, hepatocellulær, ependymoma, malignt mesotheliom og medulloblastom [21], [22] , [23], [24], [25], [26]. Desuden YAP udtryk korrelerer med dårlig prognose i forskellige kræftformer, såsom kolorektal, esophageal, mave, hepatocellulær, lunge- og ovariecancer [22], [27], [28], [29], [30], [31], [32],

Der er også crosstalk mellem YAP og steroidhormoner. Dhananjayan et al. viste, at YAP og WW-domænet bindende protein-2 (WBP-2) er co-aktivatorer af ER og PR [33], som spiller en central rolle i den normale menstruationscyklus og i ætiologien af ​​type 1 EMCA. Selv om flere rapporter viste onkogene funktioner til YAP i forskellige menneskelige kræftformer, dets biologiske og kliniske relevans i EMCA fortsat uklar. Desuden YAP overekspression fremmer radioresistance i medulloblastom celler gennem YAP /IGF2 /Akt vej [34], hvilket tyder YAP kan fungere i modulerende stråling følsomhed /resistens. Disse konstateringer tilskyndede os for yderligere at undersøge, om YAP kunne spille en rolle i onkogenese og udvikling af EMCA og modulation af stråling følsomhed.

I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi potentielle anvendelighed af YAP som prognostisk og terapeutisk indikator i EMCA og den biologiske funktion af YAP i EMCA. Endvidere har vi vurderet YAP virkning med hensyn stråling følsomhed. Derfor vores data dokumenterer, at nuklear YAP udtryk er en markør for dårlig prognose og kan have terapeutiske implikationer for behandling af patienter med EMCA.

Materialer og metoder

Patienter og vævsprøver

undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle gennemgang bord på Geisinger Medical center (Geisinger Medical center IRB Protocol # 2011-0163) og et afkald på samtykke blev opnået fra IRB center til at udføre undersøgelsen. I alt 150 primære EMCA væv blev opnået fra patienter, som gennemgik en hysterektomi på Geisinger Medical Center mellem 2008 og 2011, herunder 120 tilfælde af type 1 EMCA og 30 tilfælde af type 2 EMCA. Demografiske og prognostisk information, herunder alder, body mass index (BMI), klasse, scene, LVSI og overlevelse data blev opnået fra alle fag. Makroskopiske og mikroskopiske klassifikationer af tumorer blev baseret på den internationale sammenslutning af Gynækolog og Fødselslæger (FIGO) iscenesættelse systemet [35], [36].

Immunhistokemi

Paraffin indlejret vævsprøver blev skåret til en tykkelse på 5 mikron og underkastet immunhistokemisk farvning af YAP protein med avidin-biotin-peroxidase metode. Antigen genfinding blev udført ved opvarmning af prøverne i citratbuffer (pH 6,0) i 5 minutter på høj effekt, derefter 10 minutter medium power, i en mikrobølgeovn. Objektglas blev afkølet og skyllet i destilleret vand og farvet under anvendelse af DAKO Autostainer som følger: Objektglas blev inkuberet i 3% hydrogenperoxid 5 minutter med efterfølgende skylning i TBST-buffer. Prøver blev derefter inkuberet i YAP antistof (1:200, NB110-58358) fra Novus Biologicals (Littleton, CO) i 30 minutter med en efterfølgende TBST vask og inkuberet i Dako Envision + HRP kanin-opløsning (Dako, Carpinteria, CA) (fortyndet i henhold til producentens anvisninger) i 30 minutter. Efter en TBST vask blev objektglassene derefter inkuberet i Dako DAB-opløsning i 10 minutter og skylles igen med TBST-buffer. Objektglas blev derefter modfarvet som følger: 20 anden inkubation i Gills Hematoxylin pletten, efterfulgt af en vandhane vask. Slides blev dehydreret og lufttørres derefter, og prøverne blev monteret i monteringsmedium. Immunofarvede slides blev evalueret for både nukleare og cytoplasmatisk glandulær farvning af YAP ved en gynækologisk patolog, (HK) i nettet til intensitet ved hjælp af en 5 point (0 til 4) skalere.

EMCA cellelinjer

Tre humane type 1 EMCA cellelinier, HEC-1-A, HEC-1-B og Ishikawa, blev anvendt i denne undersøgelse. HEC-1-A (ATCC HTB112) og HEC-1-B (ATCC HTB113) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Ishikawa-celler blev tilvejebragt af Dr. Jennifer Richer (University of Colorado) [37], [38], [39]. HEC-1-A blev dyrket i McCoys 5A-medium (ATCC, Manassas, VA) suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), HEC-1-B i Eagles minimum essentielt medium (EMEM) (ATCC, Manassas, VA) suppleret med 10% (vol /vol) FBS og Ishikawa i minimalt essentielt medium (MEM) (Life Technologies, Carlsbad, CA) suppleret med 1% ikke-essentielle aminosyrer ( NEAA), 6 ng /ml insulin og 5% (v /v) FBS. Antibiotika (10 enheder /ml penicillin og 10 ug /ml streptomycin) blev sat til alle dyrkningsmedier. Alle cellelinier blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% carbondioxid.

Western blot-analyse

Celler blev lyseret i Tris-buffer (10 mmol /l, pH 7,4) indeholdende 5 mmol /l EDTA, 300 mmol /l NaCl, 10% glycerol, 1% Triton X-100, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS og en proteasehæmmer cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) og underkastet SDS-PAGE . Anti-YAP antistof (NB110-58358) blev købt fra Novus Biologicals (Littleton, CO); anti-phospho-YAP (ser127) (# 4911) fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA); anti-NF2 (sc-331) fra Santa Cruz; anti-LATS2 (ab70565) og anti-GAPDH (ab9485) fra Abcam (Cambridge, Storbritannien). Passende peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (anti-kanin /Mouse, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) blev anvendt. Proteinbånd blev visualiseret med en forøget kemiluminescens-substrat (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) og påvist under anvendelse af LAS-3000 (Fujifilm, Tokyo, Japan).

Immunofluorescens og billeddannelse

Dyrkede celler blev vasket med PBS og fikseret i 4% (vægt /volumen) paraformaldehyd. Efter permeabilisering med 0,2% Triton X-100 i PBS blev celler blokeret i 5% (vægt /volumen) gedeserum i PBS og inkuberet med primært antistof (YAP, 1:500) ved stuetemperatur i 1 time efterfulgt af Alexa Fluor 488 gede-anti kanin (1:500) som sekundært antistof i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter at være monteret med 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) for kerne-farvning blev celler undersøgt ved anvendelse af et fluorescens mikroskop (Olympus IX81, Olympus, Tokyo, Japan).

lille interfererende RNA (siRNA ) behandling

siRNA rettet mod

YAP

gen (sc-38637; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) blev anvendt til tab-of-funktion eksperimenter. Styringen siRNA (sc-37007; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) blev anvendt som en negativ kontrol. Hver siRNA (37,5 nM) blev transficeret ind EMCA celler under anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. Knockdown af et målgen blev verificeret ved Western blotting.

Celleproliferationsassay

Antallet af levedygtige celler på forskellige tidspunkter efter transfektion af siRNA’er blev bedømt ved en kolorimetrisk vandopløseligt tetrazoliumsalt assay (Cell optælling kit-8; Dojindo, Kumamoto, Japan). som beskrevet andetsteds [40]

Soft agar assay

til in vitro test af forankringsuafhængig koloni udvikling, 5000 celler transficeret med siRNA’er i 48 timer blev udpladet i 1 ml 0,4% smeltet agar i EMEM med 10% (vol /vol) FBS i 6-brønds plader overlejret med 1,5 ml 0,9% smeltet agar i det samme medium. Plader blev inkuberet ved 37 ° C i en fugtig atmosfære indeholdende 5% carbondioxid. Plating blev udført i seksdobbelt og en lille mængde af EMEM komplet medium blev forsigtigt tilsat hver par dage på toppen af ​​hver brønd for at sikre ernæringsmæssige forsyninger og for at forhindre udtørring. Efter inkubation i ca. fire uger blev celler fikseret og farvet med en opløsning indeholdende 2% ethanol og 0,03% krystalviolet, og antallet af kolonier blev bedømt ved to blindede uafhængige undersøgere.

Invasion og Migration assays

Transwell migration og invasion-assays blev udført ved anvendelse af 24-brønds BioCoat cellekultur indsatser (BD, Franklin Lakes, NJ). Den øvre overflade af filtre med en diameter 6,4 mm med 8 um porer porer blev forud belagt med (invasion assay) eller uden (migration assay) ekstracellulær matrix belægning (Matrigel). 50.000 siRNA transficerede celler i serum-frit medium blev podet på det øvre kammer af hver indsats, med komplet medium tilsat til bundkammeret. Efter 24 timers inkubation migreret eller invasive celler på den nedre overflade af filtrene blev fikseret og farvet med Differential Quik Stain Kit (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA), og antallet af farvede celler, som havde migreret /invaderet til bunden af filteret blev talt direkte af to uafhængige blindet undersøgere.

Cellecyklusanalyse

i flowcytometrisk analyse blev celler trypsiniseret 72 eller 96 timer efter transfektion af siRNA’er, efterfulgt af inkubation i en farvning buffer (0,1% Triton X-100, 0,2 mg /ml RNase A, og 40 ug /ml propidiumiodid i PBS). Celler blev analyseret for DNA-indhold ved anvendelse af Beckman Coulter, Cytomics FC 500 (Brea, CA).

Ekspressionskonstruktioner og kolonidannelse assayet

plasmider, der udtrykker vildtype YAP (pEGFP-C3-WT- YAP) blev opnået ved kloning den fulde kodende sekvens af YAP med 504 aminosyrer [41] i vektoren pEGFP-C3 (en gave fra Gregory Matera og Channing Der, University of North Carolina, Chapel Hill, NC). S127A mutantform af YAP (pEGFP-C3-S127A-YAP) blev genereret gennem PCR-medieret mutagenese af pEGFP-C3-WT-YAP. pEGFP-C3-WT-YAP, pEGFP-C3-S127A-YAP eller tom vektor (pEGFP-C3-EV) som en kontrol blev indført i EMCA celler under anvendelse af Lipofectamine LTX og Plus Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Ekspressionen af ​​YAP protein i transficerede celler blev bekræftet ved Western blotting. Efter inkubation i ca. fire uger med passende koncentrationer af G418 blev celler fikseret og farvet med en opløsning indeholdende 10% formaldehyd og 1% krystalviolet. Det farvede område blev beregnet ved densitometri under anvendelse ImageJ software.

klongenicitetsassayet og bestrålingsforhold Salg

eksponering Overlevelse efter strålebehandling blev defineret som evnen af ​​cellerne til at opretholde deres klonogene kapacitet. Kort beskrevet stigende antal celler transficeret med kontrol siRNA eller YAP-specifik siRNA i 48 timer blev udpladet i 6-brønds plader. Celler blev bestrålet med fra 0 til 6 Gy under anvendelse af en lineær accelerator og returneres til inkubatoren i flere uger, indtil celler i kontrolbrønde var dannet tilstrækkeligt store kolonier. Dannede kolonier blev fikseret og farvet med en opløsning indeholdende 10% formaldehyd og 1% krystalviolet og dem med mindst 50 celler blev talt ved to uafhængige blindet undersøgere. Antallet af kolonier opnået fra tre replikater blev midlet for hver betingelse. Disse middelværdier blev korrigeret efter udpladningseffektivitet af respektive kontroller at beregne celleoverlevelse for hvert dosisniveau. Den lineære andengradsligning var monteret til datasæt, generere overlevelseskurver, og dosis enhancement faktor blev beregnet til 10% overlevende fraktion (DEF 0,1).

Statistisk analyse

Korrelationer mellem nuklear /cytoplasmatisk farvning niveauer og klinisk-patologiske faktorer vurderet af t-test, Chi square test eller Fishers test i overensstemmelse hermed. Mann-Whitney

U

-test og den studerendes t-test blev brugt til at sammenligne forskellen i biologisk adfærd mellem transfekterede celler og kontrol celler. Til analysen af ​​overlevelse, blev Kaplan-Meier overlevelseskurver konstrueret til grupper baseret på univariate prædiktorer og forskelle mellem grupperne blev testet med log-rank test. For de variabler er statistisk signifikant i univariat analyse blev Cox proportional hazards model med sandsynligheden kvotientkriteriet anvendes til yderligere evaluering af multivariat overlevelsesanalyse. P-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af JMP 10 (SAS Institute Inc., Cary, NC).

Resultater

YAP proteinekspression i primære EMCA væv

For at bestemme om YAP udtrykkes i human EMCA blev YAP proteinekspression i primære EMCA væv vurderes ved immunhistokemi. Repræsentative mikrografer demonstrerer nuklear og cytoplasmatisk YAP ekspression er vist i figur S1. Eftersom den intracellulære lokalisering af YAP generelt opfattes som vigtig for dens oncogene funktion [42], både de nukleare og cytoplasmiske farvende niveauer blev analyseret og bedømt for intensitet ved anvendelse af en 5 punkts skala (0 til 4). Demografiske data og YAP farvende niveauer sammenligner type 1 og 2 EMCA er opsummeret i tabel 1. Type 2 EMCA havde højere trin, højere frekvens af LVSI og postoperative metastase /fornyet, og højere nuklear YAP ekspression sammenlignet med type 1 EMCA. Vi næste evalueret sammenhængen mellem klinisk-patologiske faktorer og YAP farvning i type 1 og type 2 EMCA, individuelt. Som vist i tabel 2, var højere nuklear YAP ekspression signifikant associeret med højere kvalitet, patologiske stadium LVSI og postoperative gentagelse /metastase i type 1 EMCA (p = 0,019, = 0,028, = 0,0008, = 0,046, henholdsvis). Ingen signifikant sammenhæng mellem nuklear YAP udtryk og disse variable blev observeret i type 2 EMCA (tabel S1). Cytoplasmatisk udtryk for YAP var ikke forbundet med klinisk-patologiske faktorer i enten type 1 eller type 2 kræftformer (data ikke vist). Kaplan-Meier overlevelse estimater viste, at øget nuklear immunoreaktivitet af YAP var signifikant associeret med dårligere samlet overlevelse i type 1 kræft. (P = 0,015, log-rank test, figur 1). Univariate analyse viste fremskredent stadium og tilstedeværelse LVSI også korreleret med dårlig samlet overlevelse (p = 0,0005 og 0,003, log-rank test, henholdsvis figur S2). Der var ingen sammenhæng mellem total overlevelse og YAP cytoplasmatisk farvning i type 1 EMCA eller YAP nukleare /cytoplasmatisk plet i type 2 EMCA (Figur S3). Ved multivariat Cox proportionel risiko regressions analyse, der anses for fase, LVSI og nuklear YAP niveau, kun nukleare YAP niveau (score 2/3/4 versus score 0/1) blev uafhængigt associeret med samlet overlevelse (p 0,021). Vores data viste, at nukleare YAP er forbundet med dårlige prognostiske funktioner og nedsat samlet overlevelse i Type 1 EMCA.

Øget nukleare immunoreaktivitet af YAP var signifikant associeret med dårligere samlet overlevelse (P = 0,015, log-rank test). Vejviser

YAP proteinekspression i EMCA cellelinjer

for at opnå yderligere indsigt i de biologiske roller YAP i EMCA, valgte vi at bruge tre type 1 EMCA celle linjer; HEC-1-A, HEC-1-B og Ishikawa. Vi evaluerede første proteinniveauer Yap og phospho-YAP (inaktiv YAP) (figur 2A). HEC-1-B viste de højeste niveauer af total YAP og meget lave niveauer af inaktive phospho-YAP ved western blotting. I modsætning hertil HEC-1-A udtrykte de laveste niveauer af total YAP og de højeste niveauer af inaktive phospho-YAP. Immunofluorescens bekræftede høje nukleare og cytoplasmatisk YAP i HEC-1-B-celler og lave niveauer af nukleare og cytoplasmatisk YAP i HEC-1-A-celler, i overensstemmelse med resultaterne af western blotting (figur 2B). Derfor blev HEC-1-B-celler anvendes til et tab af funktion eksperiment, og omvendt HEC-1-A-celler blev anvendt til en forstærkning af funktion eksperiment.

(A) Ekspression af YAP og phospho-YAP (Ser127) i tre EMCA cellelinjer ved western blotting. (B) Immunfluorescerende cytokemisk farvning af endogen YAP hjælp anti-YAP antistof (YAP: grøn, DAPI: blå).

YAP knockdown i EMCA celler

For at udvide vores immunhistokemiske resultater demonstrerer en sammenhæng mellem nuklear YAP og fattige prognostiske funktioner i EMCA patienter, vi bestemt virkningerne af YAP knockdown på celleproliferation ved hjælp YAP-specifikke siRNA (siYAP) og kontrol siRNA (siCont) i HEC-1-B-EMCA celler. Endogen ekspression af YAP protein blev effektivt inhiberet ved 72 og 96 timer efter transient transfektion af siRNA (figur 3A). Celleproliferation blev signifikant reduceret i Yap hæmmede celler sammenlignet med kontrolcellerne med 26,2% (72 timer) og 42,9% (96 timer), henholdsvis (figur 3A). Denne tilsvarende vækst-inhiberende virkning i celleproliferation blev bekræftet under anvendelse af en alternativ YAP siRNA-sekvens (data ikke vist).

(A) inhiberede protein ekspression af YAP af YAP-specifikke siRNA (siYAP) blev bekræftet ved western blotting både 72 og 96 timer efter transfektion (venstre). Antallet af levedygtige celler mellem 24-96 timer efter transfektion af siYAP eller kontrol siRNA (siCont) blev evalueret i HEC-1-B-celler under anvendelse af vandopløselige tetrazoliumsalt assay (Celletælling kit-8) (højre). 26,2% og 42,9% inhibering af celleproliferation blev bekræftet ved knockdown af YAP ekspression efter 72 og 96 timer. (* P 0,05 (Mann-Whitney U-test)). Resultaterne er vist i middel ± standardafvigelser (søjler) i firdobbelte forsøg. Lignende tendenser blev opnået i to andre uafhængige eksperimenter. (B) Antallet af kolonier i blød agar blev sammenlignet mellem YAP inhiberede celler og kontrolcellerne at evaluere forankringsuafhængig cellevækst i HEC-1-B-celler. Repræsentativt billede af dannede kolonier i blød agar (venstre). Kvantitativ analyse i antallet af dannede kolonier (højre), viser et signifikant fald i siYAP transficerede celler. (* P 0,05 (Mann-Whitney U-test)). Kolonner og søjler repræsenterer midler og standardafvigelse i seksdobbelt eksperimenter. Lignende tendenser blev opnået i en anden uafhængigt forsøg. (C) Transwell migration og invasion assay. Repræsentativt billede af migreret /invaderede HEC-1-B-celler (venstre). Kvantitativ analyse i antallet af migrerede /invaderede celler (højre), som viste et signifikant fald i siYAP transficerede celler. (* P 0,05 (Mann-Whitney U-test)). Kolonner og søjler repræsenterer midler og standardafvigelse i firdobbelte eksperimenter. Lignende tendenser blev opnået i en anden uafhængigt forsøg. (D) Flowcytometrisk analyse. Repræsentative resultater af befolkningen i hver fase af cellecyklussen i HEC-1-B EMCA celler 72 og 96 timer efter transfektion med siCont /siYAP (venstre). Kvantitativ analyse i befolkningen i hver fase (højre). siYAP transficerede celler viste en signifikant akkumulering af celler i G0 /G1 fasen og signifikante fald i S og G2 /M faser på 72 og 96 timer (* P 0,05, ** P 0,001, den studerendes t-test). Kolonner og søjler repræsenterer midler og standardafvigelse i tredobbeltforsøg. Lignende tendenser blev opnået i en anden uafhængig eksperiment.

Vi bestemt også rolle YAP i forankringsuafhængig cellevækst, migration og invasion evne, der almindeligvis betragtes som kendetegn for maligne transformerede celler. I blød agar-kolonidannelse assays knockdown af YAP i HEC-1-B-celler reducerede evne kolonidannelse i sammenligning med kontrolceller (p = 0,015, figur 3B). I cellemigration /invasion assays blev et signifikant fald i antallet af celler, som migrerede /invaderet gennem uovertrukne /Matrigelcoatede membraner observeret i siYAP transficerede celler sammenlignet med siCont transficerede celler (p 0,05, figur 3C). Disse eksperimenter viser, at YAP udtryk er forbundet med celleproliferation, forankringsuafhængig vækst og migration /invasion potentiale i denne EMCA cellelinje.

Cell cyklus analyse i EMCA celler

For at bestemme om væksthæmning induceret af YAP knockdown forårsagede ændringer i cellecyklussen, flowcytometrisk analyse blev udført i HEC-1-B EMCA celler transficeret med YAP-specifikke og kontrol siRNA’er. I overensstemmelse med resultaterne af de celleproliferationsassays, siYAP behandlet HEC-1-B-celler udviste en signifikant akkumulering af celler i G0 /G1-fasen og signifikante fald i S og G2 /M-faser ved 72 og 96 timer, sammenlignet med siCont behandlede celler (figur 3D). Tilsammen tyder disse data, at YAP knockdown producerer G0-G1 cellecyklusstop i denne EMCA cellelinje.

YAP overekspression i EMCA celler

Baseret på vores resultater fra tab af funktion assays, vi hypotese, at overekspression af YAP i EMCA celler med lave endogene YAP niveauer ville øge celleproliferation. Vi undersøgte evnen hos danner kolonier efter transient transfektion af YAP udtrykkende konstruktioner i HEC-1-A-celler, som udviste relativt lave niveauer af YAP og høje niveauer af phospho-YAP (figur 2). Overekspression af GFP-mærkede vildtype YAP og GFP-mærkede konstitutivt aktiv S127A mutant YAP i HEC-1-A-celler blev verificeret ved Western blotting (figur 4A). Celler, der overudtrykker WT-YAP eller S127A-YAP producerede signifikant flere kolonier sammenlignet med celler transficeret med kontrol tom vektor (EV). Mens S127A-YAP transficerede celler produceret flest kolonier, blev en signifikant forskel ikke observeret sammenlignet med WT-YAP transficerede celler (figur 4B). Disse resultater understøtter endvidere en rolle for YAP i celle spredning af EMCA.

(A) Endogen udtryk for YAP (ca. 65 kDa) og eksogen udtryk for YAP tagget med GFP protein (ca. 92 kDa i alt) i HEC -1-A celler transficeret med vildtype YAP (WT-YAP) og S127A mutant YAP (S127A-YAP). (B) repræsentativt billede af kolonidannelse assayet (venstre). Celler blev transient transficeret med tom vektor (EV) /WT-YAP /S127A-YAP og udvalgt med passende koncentrationer af G418 i fire uger. De resistente kolonier dannet af de YAP-transficerede celler var signifikant talrige sammenlignet med kontrollen (Mann-Whitney U-test). Kolonner og søjler repræsenterer midler og standardafvigelse i firdobbelte eksperimenter. Lignende tendenser blev opnået i en anden uafhængig eksperiment.

Rolle YAP i modulerende stråling følsomhed

I betragtning af betydningen af ​​strålebehandling i EMCA behandling og for nylig offentliggjort data implicerer YAP i modulere stråling følsomhed medulloblastom celler, Derefter bestemte vi effekten af ​​YAP på stråling følsomhed i EMCA celler under anvendelse af en klonogen overlevelse assay. Knockdown af YAP ekspression ved siRNA reducerede klonogen overlevelse i HEC-1-B-celler, hvilket resulterer i en stigning i stråling følsomhed med en DEF 0,1 på 1,36 (Figur 5). Konkret 90% celle drab ved stråling i siYAP transfekterede celler krævede 3,48 Gy, mens det samme niveau af celle drab i siCont transfekterede celler krævede 4,72 Gy. Derfor er vores resultater viser en forøget følsomhed over for stråling med tab af YAP ekspression i HEC-1-B EMCA celler.

Knockdown af YAP ekspression ved siRNA reducerede klonogen overlevelse i HEC-1-B-celler, hvilket resulterer i en stigning i stråling følsomhed med en dosisforstærkning faktor ved 10% overlevelse (DEF 0,1) på 1,36. Resultaterne er vist i middel ± standardafvigelser (søjler) i tredobbelte eksperimenter. Lignende tendenser blev opnået i andre tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Vores data identificere onkogene funktioner YAP i EMCA. Det Hippo vej, især den direkte opstrøms regulator, LATS1 /2, modulerer negativt YAP aktivitet ved phosphorylering af sin S127 site. Phosphoryleret-YAP er adskilt i cytoplasmaet og målrettet for ubiquitinmedieret proteolyse [43], [44]. Derfor den subcellulære lokalisering af YAP er blevet overvejet, afgørende for dets biologiske funktioner i forskellige kræftformer [42]. Nuklear YAP udtryk som en dårlig prognostisk markør er blevet vist i andre typer af kræft, såsom esophageal, mave- og ovariecancer [22], [28], [31], [32].