PLoS ONE: Diatom-Afledt Flerumættet Aldehyder Aktiver celledød i menneskelige kræftceller, men ikke normale celler

Abstrakte

Kiselalger er en vigtig klasse af encellede alger, der producerer bioaktive flerumættede aldehyder (puas), der inducerer aborter eller misdannelser hos børn af hvirvelløse dyr, der udsættes for dem under svangerskabet. Her sammenligner vi virkningerne af puas 2-

trans

, 4-

trans

-decadienal (DD), 2-

trans

, 4-

trans

-octadienal (OD) og 2-

trans

, 4-

trans

-heptadienal (HD) på adenocarcinom cellelinjer lunge A549 og tyktarm COLO 205, og den normale lunge /brunch epitel BEAS-2B-cellelinje. Brug af levedygtigheden MTT /trypanblåt analyser, viser vi, at puas har en toksisk effekt på både A549 og COLO 205 tumorceller, men ikke BEAS-2B normale celler. DD var den stærkeste af de tre testede puas, på alle tidspunkter intervaller overvejes, men HD var så stærk som DD efter 48 h. OD var den mindst aktive af de tre puas. Virkningen af ​​de tre puas var noget stærkere for A549-celler. Vi studerede derfor død signalvejen aktiveres i A549 viser, at celler behandlet med DD aktiveret tumornekrosefaktorreceptor 1 (TNFR1) og Fas Associated dødsdomænet (FADD), der fører til necroptosis via caspase-3 uden at aktivere overlevelse pathway Receptor-interagerende protein ( HVIL I FRED). TNFR1 /FADD /caspase-vejen blev også observeret med OD, men først efter 48 timer. Dette var den eneste PUA der aktiveret RIP, i overensstemmelse med den konklusion, at OD forårsager mindre skade på cellen i forhold til DD og HD. I modsætning hertil celler behandlet med HD aktiveret Fas /FADD /caspase-vejen. Dette er den første rapport, puas aktivere en ydre apoptotisk maskiner i modsætning til andre anticancerlægemidler, der fremmer en iboende død pathway, uden at påvirke levedygtigheden af ​​normale celler fra den samme vævstype. Disse resultater har interessante konsekvenser også fra den økologiske synspunkt i betragtning af at HD er en af ​​de mest almindelige puas produceret af kiselalger

Henvisning:. Sansone C, Braca A, Ercolesi E, Romano G, Palumbo A, Casotti R, et al. (2014) Diatom-Afledt Flerumættet Aldehyder Aktiver celledød i menneskelige kræftceller, men ikke normale celler. PLoS ONE 9 (7): e101220. doi: 10,1371 /journal.pone.0101220

Redaktør: Srinivasa M. Srinivasula, IISER-TVM, Indien

Modtaget: Januar 14, 2014 Accepteret: 4 juni 2014; Udgivet 3. juli, 2014

Copyright: © 2014 Sansone et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Stazione Zoologica Anton Dohrn og af den italienske nationale operative Project PON01_02093 Undersøgelse af nye teknologier og teknologiske platforme til forbedring af produktionsprocesser af aktive farmaceutiske ingredienser i industriel interesse og søge efter nye bioaktive molekyler fra naturlige kilder. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne bekræfter, at medforfatter Adrianna Ianora er en PLoS ONE akademisk redaktør men at dette ikke ændrer forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Kiselalger er mikroskopiske, encellede alger, der repræsenterer dominerende fotosyntetiske organismer i verdenshavene. Deres gavnlige rolle som føde for grazers blev udfordret over et årti siden efter opdagelsen af, at nogle diatoméarter producere teratogene forbindelser såsom flerumættede aldehyder (puas), der inducerer aborter, fosterskader, dårlig udvikling og høj afkom dødelighed i aggressiv plankton og bunddyr [ ,,,0],1] – [3]. Puas er slutprodukterne med en lipoxygenase /hydroperoxid lyase metaboliske vej [4] initieret af beskadigelse algeceller, som sker gennem græsning af rovdyr. Cellebeskadigelse aktiverer lipaseenzymer som udvikler polyumættede fedtsyrer (PUFA) fra cellemembraner, der er umiddelbart oxiderede og spaltede inden for sekunder til dannelse puas og et væld af andre forbindelser betegnes samlet oxylipins [4], [5]. Der er blevet foreslået mange funktioner for puas såsom: grazer forsvar [6], [7]; allelopati [8], [9], celle til celle signalering [10], antibakteriel aktivitet [11], [12], og blomstre terminering [13], [14]. Således de samme sekundære metabolitter har flere funktioner fra græsning forsvar til signalmolekyler medierer flere plankton interaktioner.

Først beskrevet i marine kiselalger af Miralto et al. [15], som viste, at puas 2-

trans,

4-

cis

, 7-

cis

-decatrienal, 2-

trans

, 4

trans

, 7-

cis

-decatrienal og 2-

trans

, 4,

trans

-decadienal (DD) arresteret fosterudviklingen i vandlopper og søpindsvin, og havde antiproliferative og apoptotiske virkninger på den menneskelige adenocarcinom Caco2 cellelinje. Successivt, har både laboratorie- og feltundersøgelser påvist en skadelig virkning af diatoméarter kostvaner på vandlopper grazer reproduktiv succes [6], [16] – [19]. Puas kan afsondret under oocyt udvikling og videregives moderen til fosteret, eller kan virke direkte på fostre. Ved uanset hvilken rute, vil timingen af ​​reproduktion i forhold til giftige kiselalger overflod har vigtige konsekvenser for hvirvelløse rekruttering [6].

Lignende forbindelser er produceret af højere blomstrende planter, der menes at spille en central rolle i plante forsvar fordi de fungerer som kemiske attraktorer (f.eks feromoner, bestøver attraktion) eller alarmsignaler mod planteæder angreb (fx i tritrophic interaktioner) og beskyttende forbindelser (antibakterielle, sårheling) [20]. Diatom oxylipins viser også en høj lighed med flygtige organiske forbindelser, der frigives fra brune alger, som er foreslået at være involveret i kemisk signalering og feromon tiltrækning mellem mælke af forskelligt køn [20], og synes at være mellemprodukter til medfødte immunitet [21].

PUA DD er den bedst studerede metabolit af denne gruppe og er således blevet en model aldehyd til eksperimentelle undersøgelser af virkningen af ​​oxylipins på marine organismer (anmeldt i [1], [3]). Men flere marine kiselalger har vist, at producere andre end DD puas, herunder

Skeletonema marinoi

, en kosmopolitisk flor danner kiselalger, der producerer 2-

trans

, 4-

trans

-heptadienal (HD), 2-

trans

, 4-

trans

-octadienal (OD) og 2-

trans

, 4-

trans

7-octatrienal (octatrienal) [22], [23]. Af disse er den mest almindelige er HD [13], [24]. Ceballos og Ianora [25] udført eksperimenter teste effekten af ​​DD, OD og HD på copepod æg klækning succes viser, at jo længere kæde længde puas, jo stærkere den biologiske aktivitet af disse molekyler, som også bekræftes af [26] på bakterier, alger, svampe, pighuder, bløddyr og krebsdyr, og [27] ved hjælp af søpindsvin æg. Ribalet et al. [9] fandt også en koncentrationsafhængig reduktion i væksten i marine fytoplankton, der tilhører forskellige taksonomiske grupper, der udsættes for puas med længere-lænket aldehyder, der har større effekt på vækst end kortere-lænket aldehyder.

Her vi sammenligne virkningerne af forskellige puas, herunder DD, OD, og ​​HD på lungeadenocarcinom A549, colon adenocarcinom udvundet af metastatiske ascites COLO 205-cellelinien, og lungen /brunch normal epitelial cellelinje BEAS-2B. Puas vides at forårsage apoptose [15], [28] – [29], men i et tidligere studie [6] blev de vist sig at udøve dramatiske effekter kun på prolifererende, differentierede celler. Vi brugte derfor to meget aggressive tumorcellelinier til bedre at forstå de involverede veje i celledød og en normal en til at vurdere en hypotetisk specifik virkning mod prolifererende celletyper. Et andet vigtigt mål var at sammenligne effekten af ​​DD, en model PUA i toksikologiske forsøg, men ikke den mest almindelige PUA stede i marine fytoplankton (i en undersøgelse af 51 arter af marine diatoméer, DD var den mindste opdaget PUA, [24]) med den mere udbredte kiselalger puas HD og OD. Disse er mere tilbøjelige til at forårsage snigende (sensu [15]) antiproliferative virkninger på plankton og bundlevende græssere

in situ

under naturlige diatoméarter blomstrer som dem rapporteret af [3] og referencer deri.

Materiale og metoder

cellekulturer og behandling

A549 (ATCC CCL185) human lunge adenocarcinom og COLO 205 (ATCC CCL-222) colonadenocarcinom metastatiske ascites-udledning cellelinjer blev opretholdt i DMEM ( Dulbeccos modificerede Eagles medium) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder ml

-1 penicillin og 100 ug ml

-1 streptomycin. Celler blev inkuberet i en COZ 5%

2 befugtet kammer ved 37 ° C i vækst. A549 og COLO 205 celler (2 x 10

4 celler godt

-1) blev udsået i en 24-brønds plade og holdes natten over til fastgørelse. Den næste dag blev mediet erstattet med frisk medium med tre koncentrationer (2, 5 og 10 uM) for hver af tre puas (dd, OD, og ​​HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italien) testede; Cellerne fik lov at vokse i 24, 48 og 72 timer. Efter inkubation blev supernatanten fjernet, og adhærerende celler blev undersøgt for levedygtighed. A549 celler, der anvendes til protein /RNA-ekstraktion og cellecyklus-analyse 2 × 10

6 blev udsået i petriskåle (90 mm diameter) og behandles som rapporteret ovenfor.

et uafhængigt forsøg, A549-celler (2 × 10

3 celler well-1) blev podet i en 96-brønds plade og holdes natten over til fastgørelse. Den næste dag blev mediet erstattet med frisk medium med tre koncentrationer (2, 5 og 10 uM) for hver af tre puas (dd, OD, og ​​HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italien) testet og med caspase-3 Inhibitor (C

30H

41FN

4O

12, sc-3075, Santa Cruz) på 9,7 uM; Cellerne fik lov at vokse i 24, 48 og 72 timer. Efter aldehyd behandling blev levedygtige celler evalueret som beskrevet nedenfor. Den BEAS-2B (ATCC CRL-9609) lunge /brunch normal epitelial cellelinje blev holdt i DMEM (Dulbeccos modificerede Eagles medium) suppleret med 50% føtalt bovint serum (FBS), 100 enheder ml

-1 penicillin og 100 ug ml

-1 streptomycin. Celler blev inkuberet i en COZ 5%

2 befugtet kammer ved 37 ° C i vækst. BEAS-2B (2 × 10

3 celler godt

-1) blev podet i en 96-brønds plade og holdes natten over til fastgørelse. Den næste dag blev mediet erstattet med frisk medium med tre koncentrationer (2, 5 og 10 uM) for hver af tre puas (dd, OD, og ​​HD, Sigma-Aldrich Inc., Milano, Italien) testede; Cellerne fik lov at vokse i 24, 48 og 72 timer. Efter inkubation blev supernatanten fjernet, og adhærerende celler blev undersøgt for levedygtighed

Levedygtighed assays

Vi udførte to typer af rentabiliteten assays:. MTT og trypanblå assay. Vi her vælger at repræsentere de væsentligste data opnået med den ene eller den anden type test, afhængigt af egenskaberne ved de behandlede celler. Især normale celler (BEAS-2B), som ikke blev ramt af puas behandling (og dermed var der ingen døde celler) blev undersøgt med MTT kolorimetrisk assay henviser A549 og COLO 205 celler blev farvet med trypanblåt der farver kun døde celler. Endvidere A549-celler behandlet med puas i nærvær af caspase-3-inhibitor blev også undersøgt med MTT-assayet til at vurdere inhibering af toksicitet.

I Trypan blå, A549 og COLO 205 celler (2 x 10

4 /brønd) blev podet i hver brønd på en plade med 24 brønde og holdt natten over til fastgørelse i nærvær af Dulbeccos medium. Den næste dag blev mediet erstattet med frisk medium indeholdende 0, 2, 5 eller 10 uM DD, OD eller HD. Behandlede celler blev inkuberet i 24, 48 og 72 timer. Efter inkubation blev supernatanten opsamlet og kasseret, mens adhærente celler blev behandlet med en 0,4% trypanblåt-opløsning (Hyclone, Kat.nr.: JRH27098) ifølge den trypanblåt Udelukkelse assay [30]. Efter farvning blev cellerne løsrevet med trypsin, centrifugeret, og pelleten vasket med phosphatbuffer saltvand (PBS); 10 pi af denne opløsning blev anbragt i et Burker tællekammer. Blue-celler (indikerer døde celler) blev talt i hvert område og i forhold til kontroller til at beregne levedygtighed% celle.

For MTT blev A549 og BEAS2B celler podet i 96-brønds plade (2 × 10

3 celler /brønd), efter behandlingstider, og inkuberet med 10 pi (10 mg /ml) MTT (3- [4,5-methylthiazol-2-yl] -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromide, AppliChem A2231). Antallet af levedygtige celler efter aldehyd (DD, OD, HD) behandling blev bedømt ved spektrofotometrisk MTT assay ifølge producentens protokol og beregnet som forholdet mellem gennemsnitlig absorbans (λ = 570 nm) af prøve og gennemsnitlige absorbans af kontrol og udtrykt som procentvise levedygtighed.

Acridin orange /ethidiumbromid dobbelt farvning test for morfologisk analyse

Kontrol og behandlede adhærente A549-celler blev trypsinbehandlet og opsamlet ved centrifugering ved 500 g i 5 min. Celler blev vasket 3 × med PBS og ændringer i cellemorfologi blev påvist med acridinorange /ethidiumbromid farvning test. Celler blev resuspenderet i 25 pi farvestof (100 ug ml

-1 af acridinorange og 100 ug ml

-1 ethidiumbromid fremstillet i PBS og forsigtigt blandet). 10 pi farvet celler blev anbragt på et objektglas, dækket med et dækglas og undersøges under et konfokalt mikroskop (Zeiss LSM510, laser 488 med LP505 filter til grøn fluorescens, laser 543 med LP 560 filter til rød fluorescens) med 25 × målsætning. Acridinorange trænger både levende og døde celler udsender grøn fluorescens, når interkalateret i normale dobbeltstrengede nukleinsyrer (DNA) og rød fluorescens ved binding med beskadigede enkeltstrengede nukleinsyrer. Ethidiumbromid trænger kun døde celler med beskadigede membraner udsender rød fluorescens. Fire celletyper blev identificeret i henhold til [31] på grundlag af fluorescensemission og morfologiske aspekt af kromatin kondensering i farvede kerner: (1) levedygtige celler med ensartet lysegrønne kerner og en organiseret struktur (kontrol); (2) tidlig apoptotiske celler med uregelmæssige grønne kerner med kondenseret kromatin og med apoptotiske legemer farvet i rødt, (3) sent apoptotiske celler med orange til røde kerner med meget fragmenteret kromatin; (4) ensartet orange til røde kerner med en organiseret struktur henføres til nekrotiske celler.

RNA isolering og RT

2 Profiler PCR Arrays

Efter behandling blev A549 celler vaskes i vævskultur skålen ved tilsætning kold PBS og vugger. Celler blev vasket direkte i en dyrkningsskål ved tilsætning af 1 ml Trizol Reagent (Life Technologies, kat. 10.296-010) pr skål diameter på 10 cm og skrabning med celleskraber. RNA blev isoleret i overensstemmelse med producentens protokol. RNA koncentration og renhed blev vurderet ved hjælp af nanophotomer NanoDrop (Euroclone). RNA (400 ng) blev underkastet revers transkription reaktion under anvendelse af RT

2 første streng (Qiagen, cat.330401) ifølge producentens protokol.

For at vurdere ekspressionen af ​​apoptotiske gener, real- time kvantitativ revers transkription-PCR (QRT-PCR) blev udført under anvendelse af RT

2 Profiler PCR Arrays (Qiagen, cat.330231). Eksperimenter blev udført i triplikater for A549-cellelinje behandlet med puas ved 5 uM koncentration i 2 timer eksponeringstid.

Pladerne blev kørt på en VIIa 7 (Applied Biosystems 384 brønde blokke), Standard Fast PCR Cycling protokol med 10 gl reaktionsrumfang. Cykling betingelser var – 1 cyklus initiering ved 95,0 ° C i 10 minutter og efterfulgt af amplifikation i 40 cykler ved 95,0 ° C i 15 s og 60,0 ° C i 1 min. Amplification data blev indsamlet via VIIa 7 RUO Software (Applied Biosystems). CT-værdier blev analyseret med PCR array-dataanalyse online software (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen).

Protein udvinding

A549 cellelysat efter behandling, blev fremstillet ved at skrabe cellerne af hver petriskål i 1 ml RIPA-lysepuffer (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI pH 7,6, 5 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5% natriumdeoxycholat, 0,1 % SDS) suppleret med proteasehæmmere (1 uM PMSF og komplet proteaseinhibitorcocktail Tabletter, Roche, Monza, Italien) og phosphatase inhibitorer (PhosSTOP Cocktail Borde, Roche). Lysatet blev inkuberet på is i 15 minutter og derefter klaret ved centrifugering ved 14.000 g i 20 minutter. Total proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af et Bio-Rad Protein Assay Reagent (Bio-Rad, Milano, Italien) med bovint serumalbumin (BSA) som en standard. Proteinet ekstrakt blev opbevaret ved – 80 ° C indtil anvendelse

Elektroforese

Før elektroforese blev proteinprøver inkuberet ved 100 ° C i 5 min.. Efter 10% SDS-PAGE, blev gelerne farvet med Coomassie eller blottet på nitrocellulose (Hybond, GE Healthcare) membran. Membraner blev blokeret i 1 time i 1X Tris saltvand (TBS), med 0,1% Tween-20 med 5% vægt /volumen fedtfri tørmælk og inkuberet natten over ved 4 ° C med de primære antistoffer fortyndet i 1X TBS, 0,1% Tween -20 med 5% BSA. Primære antistoffer var fra Death Receptor Antibody Sampler Kit (Cell Signaling Technology, 8356S), herunder anti-TNFR1 (1:1000), anti-TNFR2 (1:1000), anti-FADD (1:1000), anti-RIP (1 :1000), anti-Fas /FasL (1:1000). Anti-aktiv Cas-3 (1:1000) købt fra BioVision. Positiv kontrol blev opnået ved anvendelse af anti-actin-antistof (1:500) (Sigma). Actin blev anvendt som en kontrol for hver analyserede protein. Her viser vi kun en repræsentativ gel til actin. Efter inkubation blev membranerne vasket tre gange i 5 min hver med 15 ml TBS /Tween og inkuberes derefter med HRP-konjugeret sekundært antistof-anti-kanin (1:2000, Cell Signaling Technology) under forsigtig omrøring i 1 time ved stuetemperatur. Efter inkubation blev membranerne vasket tre gange i 5 min hver med 15 ml TBS /Tween. Blottet membraner blev immunodetekteret ved anvendelse af ECL Prime Western blotting påvisningsreagens (GE Healthcare). Proteiner blev visualiseret med Amersham Hyperfilm (GE Healthcare). Densitometrisk analyse af immunpositive bånd blev udført ved anvendelse Billede J software.

Cellecyklusanalyse

A549-celler blev opsamlet fra plader under anvendelse af 1 ml trypsin-EDTA (Lonza, Italien), fikseret i 70% ethanol og opbevaret ved -20 ° C. Celler blev derefter vasket to gange med PBS, resuspenderet i PBS indeholdende 1 mg ml

-1 RNase A (Qiagen, Cat.19101), inkuberet ved 37 ° C i 45 minutter og derefter farvet med propidiumiodid (PI, 10 ug ml

-1) i 15 min. DNA fordeling i celler blev derefter estimeret under anvendelse af et FACScalibur flowcytometer (BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA, USA). Procentdelen af ​​celler i de forskellige faser af cellecyklussen blev beregnet ved anvendelse ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME, USA).

Statistisk analyse

Statistiske forskelle mellem behandlede og kontrolceller for cellelevedygtighed tællinger blev bestemt ved En-vejs ANOVA og Dunns Multiple Sammenligning Test med betydelige p-værdier ≤ 0,05 ved hjælp af GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego California USA).

genekspression blev analyseret ved PCR-array data analyse online software (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php, Qiagen). Histogrammerne viser relative udtryk forhold mellem de analyserede gener i forhold til kontroller uden puas. Kun ekspression værdier større end en 1,55 ganges forskel i forhold til kontroller blev betragtet som signifikante.

Immunoblotting-proteinekspression blev beregnet som procentdelen af ​​integreret område i hvert enkelt gel bånd i forhold til den samlede gelbane område, repræsenteret som pixels. Statistiske forskelle mellem behandlede og kontroller blev bestemt ved T-student analyse med signifikante p-værdier ≤ 0,05. Data, signifikant forskellig fra kontrol, med p-værdier. 0,001 er markeret med 2 stjerner i tallene

Resultater

levedygtighed A549 og COLO 205 cancer cellelinjer, og normal BEAS-2B-celle linje efter behandling med PUA decadienal (DD)

Som vist i fig. 1A-1B, behandling af A549 og COLO 205 celler med 2, 5 eller 10 uM af DD resulterede i en signifikant dosis- og tidsafhængig reduktion i cellelevedygtighed sammenlignet med kontroller (P lt; 0,05). Efter 24 timer blev et fald i procentdelen af ​​levedygtige A549 celler observeret med alle testede doser (70%, 50% og 18% levedygtige celler ved 2, 5 og 10 um DD koncentrationer, henholdsvis). Lignende resultater blev opnået med COLO 205-celler (80%, 44% og 26% levedygtige celler ved 2, 5 og 10 um DD koncentrationer, henholdsvis). Efter 48 timers behandling, blev der observeret en yderligere reduktion, især ved højere DD koncentrationer på 5 og 10 uM for A549 celler; COLO 205 levedygtighed formindsket langsommere (67%, 43% og 23% levedygtige celler ved 2, 5 og 10 um DD koncentrationer, henholdsvis). Ved 10 viste pM A549 celler tydelige morfologiske ændringer, såsom tab af kontakt tilslutning med andre celler samt med pladen substrat. Efter 72 timer, A549 cellelevedygtighed faldt til 0% med 5 og 10 uM DD og til 26% med 2 pM DD; COLO-205 cellelevedygtighed var 30%, 21% og 13% med 2, 5 og 10 uM DD hhv.

(D) Effekt af DD på A549-cellelinje i nærværelse af caspase-3 inhibitor ( 9,7 uM). Procentuelle andel af levedygtige celler for A549 og COLO 205 beregnet med Trypan blå levedygtighed assay og for BEAS-2B med MTT levedygtighedsassayet. Værdier rapporteres som middelværdier ± standardafvigelse sammenlignet med kontroller (100% levedygtighed); ▴ 2 uM; ▪ 5 uM, ♦ 10 uM.

Behandling af BEAS-2B celler med 2, 5 eller 10 uM DD ikke signifikant reducerer cellelevedygtigheden i forhold til kontrolgruppen (Fig. 1C). Efter 24 timer DD behandling BEAS-2B cellelevedygtighed faldt en smule (74%, 65% og 85% levedygtige celler ved 2, 5 og 10 uM DD koncentrationer, henholdsvis), men efter 48 og 72 timer cellelevedygtighed udvundet og kunne sammenlignes med kontroller , hvilket indikerer mild toksiske effekter efter kun 24 timer. Endelig, for at vurdere den specifikke cytotoksiske virkning registreres for A549-cellelinien, blev MTT-assayet forsøg udført i nærvær af en caspase-3 inhibitor for alle aldehyd- behandlinger. Figur 1D viser, at procentdelen af ​​cellelevedygtighed er sammenlignelig med celler behandlet med puas uden inhibitor ved 2 uM; ved 5 og 10 uM der er en langsommere fald i cellelevedygtighed sammenlignet med behandlingen uden caspase-3-inhibitor efter 48 timer (figur 1A), men efter 72 timer de samme koncentrationer inducerede en forøgelse i celledød.

levedygtighed A549 og COLO 205 cancercellelinier og normal BEAS-2B-cellelinje efter behandling med PUA octadienal (OD)

behandling af A549-celler med 2, 5 eller 10 uM OD inhiberede celleproliferation med tiden, især ved højere koncentrationer (10 uM), når cellelevedygtighed faldt til 35% efter 72 timer (fig. 2A). Ved 2 uM koncentrationer, effekten på cellelevedygtighed efter 24 timer var ikke signifikant forskellig i forhold til kontrolgruppen, men blev så efter 72 timer (p 0,05). Betragtninger COLO 205 cellelevedygtighed efter 24 timer ikke falde betydeligt (Fig. 2B), cytotoksiske virkninger blev stærkere efter 72 timer for alle tre OD koncentrationer (60%, 60% og 41% levedygtige celler ved 2, 5 og 10 pM OD-koncentrationer henholdsvis p. 0,05)

(D) Effekt af OD på A549-cellelinje i nærværelse af caspase-3 inhibitor (9,7 uM). Procentuelle andel af levedygtige celler for A549 og COLO 205 beregnet med Trypan blå levedygtighed assay og for BEAS-2B med MTT levedygtighedsassayet. Værdier rapporteres som middelværdier ± standardafvigelse sammenlignet med kontroller (100% levedygtighed); ▴ 2 uM; ▪ 5 uM, ♦ 10 uM.

Behandling af BEAS-2B celler med 2 og 5 pM OD ikke signifikant reducerer cellelevedygtigheden sammenlignet med kontroller efter 24, 48 og 72 timer (Fig. 2C ), mens ved 10 uM OD, BEAS-2B cellelevedygtighed faldt en smule efter 72 timer (75% levedygtige celler). Behandling af A549 celler med OD i tilstedeværelse af caspase-3-hæmmer ikke medføre betydelige forskelle i procent cellelevedygtighed (fig. 2D).

levedygtighed A549 og COLO 205 cancer cellelinjer og normal BEAS-2B cellelinie efter behandling med PUA heptadienal (HD)

Som vist i fig. 3A, behandling med 2, 5 og 10 uM af HD på A549 celler lidt hæmmede celledeling efter 24 timer, men effekten var stadig signifikant forskellig med hensyn til kontrol (p 0,05). Effekten var mere tydelig med tiden. Især ved 10 uM kun 10% af cellerne var levedygtige efter 48 timer og 0% efter 72 timer. HD behandling på COLO 205 celler forårsagede også en reduktion i cellelevedygtighed, men effekten var ikke så stærk som med A549-celler. Efter 48 og 72 timer (fig. 3B), blev der observeret en signifikant toksisk effekt ved høje HD-koncentrationer (40% og 28% cellelevedygtighed ved 10 uM HD).

(D) Effekt af HD på A549 celle linje i nærvær af caspase-3 inhibitor (9,7 uM). Procentuelle andel af levedygtige celler for A549 og COLO 205 beregnet med Trypan blå levedygtighed assay og for BEAS-2B med MTT levedygtighedsassayet. Værdier rapporteres som middelværdier ± standardafvigelse sammenlignet med kontroller (100% levedygtighed); ▴ 2 uM; ▪ 5 uM, ♦ 10 uM.

Som i tilfældet med DD og OD, behandling af BEAS-2B celler med HD inducerede ikke toksicitet (fig. 3C). Behandling af A549-celler med HD i nærvær af caspase-3-inhibitor resulterede ikke i forskelle i procentdelen af ​​levedygtige celler ved højere HD-koncentrationer (5 og 10 um) (fig. 3D). Ved 2 pM var der en signifikant stigning i dødeligheden celle i nærvær af caspase-3-inhibitor efter 72 timer (Fig.3D).

Morfologiske virkninger af diatoméen puas DD, OD og HD på A549-cellelinje

at observere morfologiske ændringer i celler behandlet med DD, OD og HD og at kontrollere, om nedsat levedygtighed efter behandling var korreleret med apoptose induktion, vi fordoble farvede celler med fluorescerende farvestoffer til nukleinsyrer, acridinorange (AO) og ethidiumbromid (EO) efter 48 timers behandling. Levedygtige celler blev identificeret ved lysegrønne kerner i intakte celler (AO). Tidligt apoptotiske celler blev identificeret ved uregelmæssigt strukturerede grønne kerner med kondenseret kromatin og orange eller lys røde pletter. Sene apoptotiske celler indeholdt positivt farvede kerner med begge farvestoffer (EB og AO), der optræder orange eller lyserød sammen med apoptotiske legemer. Kerner af nekrotiske celler havde intakt chromatin og optrådte rød. Alle kontroldyr kerner optrådte grøn med en regelmæssig sfærisk struktur og chromatin organisation bortset fra et par senescentceller i en nekrotisk fase, der viste rødt fluorescerende kerner (fig. 4A). Ved 10 pM DD, alle celler var i den sene apoptose scenen og blev karakteriseret ved gulorange dobbelt farvning (AO /EB) grundet chromatinkondensering og tab af membran-integritet (fig. 4B). Ved 10 pM OD, celleskade var mindre tydelig med særskilte ændringer i morfologi og tilstedeværelsen af ​​røde farvning i nogle celler, hvilket indikerer progression i celle apoptose (pile i fig. 4C). Ved 10 uM HD, blev celle morfologi ændres væsentligt med spredte kromatin i kerner som optrådte forstørret. Kendetegnende for sent apoptose som nuklear fragmentering var også synlige (pile i fig. 4D).

Kontrol og behandlede celler dobbelt farvet med acridinorange og ethidiumbromid efter 48 uM DD, OD og HD observeret ved den konfokalmikroskop . Tal angiver (1) normale celler; (2) tidlig apoptotiske celler; (3) sent apoptotiske celler; (4) nekrotiske celler (se materialer og metoder for detaljer). Pile angiver celler med fragmenterede kerner.

Immunoblot analyser af død receptorer (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) og effektorer (caspase-3) på A549-cellelinje behandlet med puas (DD, OD og HD )

efter 24 timers behandling, DD inducerede en dosisafhængig stigning i ekspressionen af ​​tumornekrosefaktor-receptor 2 (TNFR2) især ved 5 og 10 uM, sammenlignet med kontroller, som afsløret ved densitometrisk analyse af fotografisk ark (fig. 5A) af immunoblotting membran. Tværtimod blev TNF-receptor associeret faktorer (TRAF1 og TRAF2) ikke aktiveret indikerer fravær af en overlevelse pathway. Desuden DD inducerede en aktivering af TNFR1 i celler behandlet med 5 og 10 uM koncentrationer (fig. 5A). Downstream Fas-associeret protein med dødsdomænet (FADD) blev også stærkt aktiveret ved 10 uM koncentrationer, mens niveauer af receptor-interagerende protein (RIP) faldt drastisk på alle tre DD-koncentrationer (Fig. 5A). Reduktion i ekspressionen af ​​RIP betegner en tidlig død signalvejen som angivet ved fraværet af adapter proteiner, såsom Tumornekrosefaktor Receptor type 1-associerede dødsdomænet protein (TRADD) eller TNF-receptor associeret Faktorer TRAF1 og TRAF2 (data ikke vist). DD aktiveres også caspase-3 bekræfter celledød via apoptose efter 24 timer (fig. 5A). Andre dødsreceptorer impliceret i ydre apoptotiske vej (Fas, DR3, DR4, DR5) samt nogle faktorer aktiveres i iboende apoptotiske veje (Akt1, Akt2, PARP, Apaf1) blev ikke involveret i cellen respons på DD (data ikke vist ).

Immunblotanalyse viser, at puas inducerer TNF-signalering efter 24 (DD og HD) og 48 timer (OD) af behandling med actin. Stjerne angiver signifikant stigning i proteinniveauer målt. ** P ≤ 0,05 versus kontrol; fejl søjler repræsenterer ± SD.

Den samme vej blev observeret efter OD behandling, men først efter 48 h. TNFR2 udtryk steget en smule i forhold til kontrol, men forskellen var ikke signifikant. TNFR1 og FADD viste en signifikant respons ved de højeste koncentrationer (5 og 10 uM) (fig. 5B). I modsætning til DD, viste OD-behandlede celler en stærk og vedvarende ekspression af RIP, hvilket indikerer sameksistensen af ​​en overlevelse og død signalering respons (fig. 5B). Caspase-3 blev også aktiveret som med DD (fig. 5B).

HD ikke signifikant øge ekspressionen af ​​TNFR2 (fig. 5C) og ikke udløser nogen reaktion i TNFR1 efter 24 timer og 48 timer. Efter 24 timer HD stærkt forøget ekspression af Fas-receptor (Fas /FasL-Ligand System) på en dosis-afhængig måde. Maksimal effekt af HD på Fas blev observeret ved 5 og 10 uM koncentrationer (fig. 5C). HD øgede også FADD ekspression og aktiveret caspase-3 (fig. 5C). Derimod niveauer af RIP faldt drastisk efter 24 timer (fig. 5C). Desuden Apaf1 blev ikke afsløret efter HD behandling på 24 og 48 timer (data ikke vist).

Expression analyse af gener, der koder for død receptorer (TNFR1, TNFR2, RIP, FADD) og effektorer (caspase-3, AIFM1) på A549-cellelinje behandlet med puas (DD, OD og HD)

for bedre at forstå de toksiske virkninger på det molekylære niveau, blev A549 celler analyseret efter 2 timer af puas behandling, fordi alle proteiner til DD og HD var allerede udtrykt og aktiveres efter 24 timer. Vi valgte at bruge 5 uM koncentration siden ved højere koncentrationer effekter var for svær.

Kontrol gener for real-time qPCR var Actin-beta (ACTB), Beta-2-mikroglobulin (B2M), Hypoxanthin phosphoribosyltransferase (HPRT1