PLoS ONE: understregede Ubiquitin-Proteasome System uden 20S Proteolytisk Hæmning selektivt Kills Livmoderhalskræft Cells

Abstrakt

livmoderhalskræft celler udviser en øget krav til ubiquitin-afhængige protein nedbrydning forbundet med en forhøjet stofskifte omsætningshastighed, og til specifikke signalveje, især HPV E6-målrettet nedbrydning af p53 og PDZ-proteiner. Naturlige forbindelser med antioxiderende egenskaber, herunder flavonoider og triterpenoids holde lovende som anticancer midler ved at forstyrre ubiquitin-afhængige protein nedbrydning. Et stigende mængde beviser indikerer, at deres α-β umættet carbonyl system er den molekylære determinant for inhibering af ubiquitinmedieret proteinnedbrydning opstrøms af de katalytiske steder i 20S proteasomet. Heri rapporterer vi identificering og karakterisering af en ny klasse af chalcon-baserede, potente og celle permeable kemiske inhibitorer af ubiquitin-afhængigt protein nedbrydning, og en ledende forbindelse RAMB1. RAMB1 hæmmer ubiquitin-afhængige protein nedbrydning uden at kompromittere de katalytiske aktiviteter 20S proteasomet, en mekanisme forskellig fra Bortezomib. Behandling af livmoderhalskræft celler med RAMB1 udløser udfoldede protein reaktioner, herunder aggresome dannelse og Hsp90 stabilisering, og øger p53 steady state niveauer. RAMB1 behandling resulterer i aktivering af lysosomale-afhængige nedbrydningsveje som en mekanisme til at kompensere for stigende niveauer af poly-ubiquitin beriget giftige aggregater. Vigtigere er det, RAMB1 synergistisk udløser celledød af livmoderhalskræft celler, når det kombineres med lysosomet inhibitor klorokin

Henvisning:. Anchoori RK, Khan SR, Sueblinvong T, Felthauser A, Iizuka Y, Gavioli R, et al. (2011) understreger de Ubiquitin-Proteasome System uden 20S Proteolytisk Hæmning selektivt Kills Cervical Cancer Cells. PLoS ONE 6 (8): e23888. doi: 10,1371 /journal.pone.0023888

Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA

Modtaget: Indtil 30. juni, 2011; Accepteret: 29 Juli 2011; Udgivet: 31 August, 2011

Copyright: © 2011 Anchoori et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health ATIP og SPORE i livmoderhalskræft P50 CA098252 til SRK, RKA og RBSR og HERA fundament (Health, Empowerment, forskning og kendskab) og Department of Defense æggestokkene Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke konkurrerende interesser findes

Introduktion

ubiquitin-afhængige protein nedbrydning via ubiquitin-proteasom systemet (UPS) er afgørende for reguleringen af ​​mange cellulære processer, herunder cellecyklusprogression, differentiering og apoptose i både normale og cancerceller [1]. Afvigende ekspression af komponenter i UPS system, herunder ubiquitin-ligaser, de-ubiquitinating enzymer og proteasomer er blevet rapporteret i flere kræft indstillinger, herunder livmoderhalskræft [1], [2], [3], hvilket tyder på, at for at opretholde deres højere niveauer af metaboliske aktivitet kræftceller stole mere tungt på den korrekte funktion af UPS i forhold til deres normale modstykke [4], [5], [6], [7]. Således molekyler, der kan interferere med ubiquitin-afhængig proteinnedbrydning, herunder Bortezomib, show anticanceraktivitet [5]. Humant papillomvirus (HPV) er den primære årsag til livmoderhalskræft og ansvarlig for 5% af alle kræfttilfælde på verdensplan [8]. Mens HPV-vacciner kan være en effektiv forebyggende foranstaltning mod livmoderhalskræft, er der i øjeblikket ingen virus-specifikke terapier for det, og effekten af ​​standard kirurgisk og kemo /radiotherapies er begrænset til fremskreden sygdom [9]. Ekspression af to virale onkogener, E6 og E7, der er nødvendigt til induktion og vedligeholdelse af den transformerede fænotype [10]. E6-onkoprotein udøver dets oncogene aktivitet ved binding til E3 ubiquitin ligase E6-AP og omdirigerer sin indsats hen imod p53 og andre tumor suppressor proteiner for deres hurtige ubiquitinmedieret proteasomalaktivitet nedbrydning [11], [12], [13]. Dette reducerer niveauet af denne nøgle cellulære cellecyklus regulator uden dens mutation. Derfor vi hypotese, at en stabilisering af p53 via forhindre sin ubiquitinmedieret nedbrydning vil have terapeutisk potentiale for livmoderhalskræft og eventuelt for andre kræftformer vildtype for p53.

Naturlige forbindelser flavonoid og triterpenoider familier herunder curcumin, Celastrol, grøn te polyphenoler og chalconer har vist sig lovende som antineoplastiske midler i en række indstillinger cancer, herunder cervikal [14], colon [15], [16], øsofageal [17], pancreas [18] og prostata [19], [ ,,,0],20], [21] cancer, bundet til pro-apoptotiske egenskaber som er forbundet med proteasomalaktivitet inhibering. Vi har for nylig vist, at chalcon-derivater indeholdende enkelt aminosyre substitutioner i deres struktur virker som proteasominhibitorer og at arten af ​​den aminosyredel bestemmer deres selektivitet over de forskellige katalytiske aktiviteter af 20S proteasomet [14]. andre resultater tyder imidlertid, at chalcon molekyler kan indeholde i deres α- umættet carbonyl-system den molekylære afgørende for hæmning af ubiquitinmedieret proteinnedbrydning opstrøms for 20S proteasomet [22], [23], [24], [25].

Vi rapporterer for første gang, at en række af chalcon-derivater mangler aminosyredel komponenter, her betegnet RAMBs, er ubiquitin-proteasom systemet (UPS) -stressors via hæmning af ubiquitinmedieret proteinnedbrydning opstrøms for 20S proteasomalaktivitet katalytiske aktiviteter . Specifikt vores RAMBs forbindelser er i stand selektivt drab af livmoderhalskræft celler via akkumulering af poly-ubiquitineret protein efterfulgt af udløsning af ufoldede protein responser herunder aggresome dannelse og Hsp90 stabilisering. Yderligere er denne akkumulering af poly-ubiquitineret proteiner ledsages af en kompenserende aktivering af lysosom-afhængig proteinnedbrydning, stabilisering af p53, destabilisering af cyclin D1 og indtræden af ​​apoptose. Vores resultater tyder på, at behandling Ramb sammensatte, eventuelt kombineret med lysosomet inhibitor Klorokin, har løftet som ny vej til behandling af livmoderhalskræft.

Materialer og metoder

Cell kultur

Cervikal cancercellelinier HeLa, SiHa, CaSki og ME180, blev opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin ved 5% CO

2. Keratinocytter blev opnået fra Invitrogen (Carlsbad, CA) og dyrket i defineret keratinocyt-SFM.

Cellelevedygtighed assay

Cellelevedygtighed blev bestemt med 2,3-bis [2-methoxy-4- nitro- 5-sulfophenyl] -2H-tetrazolium-5-carboxanilid indre salt (XTT) assay (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland). Celler podet i en koncentration på 1.000 per brønd i 100 pi medium i 96-brønds plade blev behandlet med chalcon-baserede derivater ved specificerede koncentrationer. Efter de indikerede tidsrum, blev cellerne inkuberet ifølge producentens protokol med blandingen XTT mærkning i 4 timer. Formazan farvestof blev kvantificeret ved anvendelse af en spektrofotometrisk pladelæser at måle absorbansen ved 450 nm (ELISA-læser 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Alle eksperimenter blev udført tre gange.

Bestemmelse af apoptotiske celler ved flowcytometri

Induktion af apoptose blev bestemt ved Annexin-V /7-AAD-farvning. Annexin-V /7-AAD-farvning blev udført under anvendelse annexin V-PE Apoptose Detektion Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA) ifølge producentens protokol. Kort fortalt, 1 x 10

5-celler blev resuspenderet i bindingspuffer, 5 pi Annexin V-PE og 5 pi 7-AAD blev derefter tilsat til cellerne, som derefter blev inkuberet ved stuetemperatur i 15 minutter, og analyseret ved flowcytometri på en Becton Dickinson FACSCalibur. Dataanalyse blev udført med CellQuest software (Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, CA).

Antistoffer og Western blot analyse

I alt cellulære protein (10-20 mg) fra hver prøve blev separeret ved SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner og underkastet Western blot analyse. Antistoffer til Western blot-analyse blev opnået ved de følgende kommercielle kilder: anti-ubiquitin (Santa Cruz Bioteknologi, Santa Cruz, CA), anti-p53-klon DO-1 (Calbiochem, Gibbstown, NJ) anti-PARP (BD Pharmingen, San Diego , California), anti-GAPDH (Sigma, St. Louis, MO), peroxidase-bundet anti-muse-immunglobulin G (Amersham, Piscataway, NJ) og anvendes ved koncentrationen anbefalet af fabrikanten. Anti-ubiquitin og anti-vimentin antistoffer til immunofluorescensanalyse blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas red-mærket gede-anti-muse-immunoglobulin G og fluorescein-mærket hest-anti-kanin-immunoglobulin G blev opnået fra Molecular Probes (Carlsbad, CA) og Vector Laboratories (Burlingame, CA) henholdsvis og anvendes ved den koncentration, der anbefales af producenten.

cellulær morfologi og immuno-fluorescens analyser

Et Nikon Eclipse TE 2000E omvendt mikroskop blev anvendt til billeddannelse af cellulære morfologi med fase kontrast og immunofluorescens. Til analyse af ubiquitin og vimentin sub-cellulære lokalisering blev kulturer af HeLa-celler dyrket som beskrevet i Lab-Tek II kamre dækglas (Nalge Nunc International, Rochester, NY). På de angivne tidspunkter blev celler fikseret og permeabiliseret med methanol og inkuberet med de angivne primære antistoffer. Fluorescerende sekundære antistoffer blev anvendt til at visualisere proteinlokalisering og nuklear DNA visualiseret ved 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning. Monteret prøver blev set under et Nikon Eclipse TE 2000E omvendt mikroskop og billeder taget med Spot 3.5.8 erhvervelse software (Diagnostiske Instrumenter, Sterling Heights, MI).

Måling af proteasomalaktivitet i 20S Renset Proteasomer

Celler (5 x 10

8) blev vasket i kold PBS og resuspenderet i buffer indeholdende 50 mM TRIS-HCI (pH 7,5), 5 mM MgC

2, 1 mM DTT (Sigma), 2 mM ATP og 250 mM sucrose. Glasperler svarende til volumenet af cellesuspensionen blev tilsat, og blandingen blev hvirvelbehandlet i 1 min ved 4 ° C. Perler og cellerester blev fjernet ved 5 minutters centrifugering ved 1000 g, efterfulgt af 20 min centrifugering ved 10.000

g

[27]. Lysater blev klaret ved ultracentrifugering i 1 time ved 100.000

g

, og supernatanter blev yderligere ultracentrifugeret i 5 timer ved 100.000

g

. Proteasom-holdige pellets blev resuspenderet i 0,5 ml homogeniseringsbuffer [50 mM TRIS-HCI (pH 7,5), 100 mM KCI, 15% glycerol]. Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af BCA-protokollen (Pierce, Rockford, IL). Fluorogene substrater Suc-LLVY-AMC, Boc-LRR-AMC og Ac-YVAD-AMC blev anvendt til måling chymotryptisk-lignende, tryptisk-lignende og caspase-lignende aktiviteter, hhv. Semioprenset proteasomer (10 l), forbehandlet eller ikke med inhibitorer i 30 minutter ved 37 ° C, blev analyseret ved 37 ° C i 45 minutter under anvendelse af de forskellige peptidsubstrater i en buffer indeholdende 50 mM TRIS-HCI (pH 7,5), 5 mM MgCl

2 og 1 mM DTT (endelig volumen 100 l). Reaktionen blev standset med 1 ml 1% SDS og fluorescens bestemmes ved fluorimeter (Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK) med excitation ved 380 nm og emission ved 440 nm [18]. Data er udtrykt som procent inhibering i forhold til ubehandlede proteasomalaktivitet præparater.

Måling af proteasomalaktivitet i 26S Proteasomer i levende celler Salg

Eksponentielt voksende celler (1 x 10

6) blev udpladet i 60 mm skåle og enten mock behandlet eller behandlet med forskellige koncentrationer RAMB1 over en periode på 4 timer. Proteasomalaktivitet i cellelysater (NP-40 lysispuffer: 0,1% NP-40, 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol og 1 mM DTT) blev bestemt ved måling tilbageværende luminescens aktivitet efter tilsætning af Suc -LLVY-Glo ™ substrat (Promega, Madison, WI) specifik for chymotrypsin-lignende aktivitet af proteasomet i henhold til producentens anbefalinger.

analyse af 4XUbiquitin-Luciferase degron

4Xubiquitin- luciferase fusion konstruktion der betegnes Ub-FL og kontrol plasmid designet CMV-FL blev venligst stillet til rådighed af Dr. David Piwnica-Worms (Washington University, St. Louis, MO) [26]. Sub-konfluerende kulturer af HeLa-celler blev transficeret med plasmider DNA ved anvendelse af lipofectamin 2000-reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA). FL og Ub-FL transficerede HeLa-celler blev podet ved 50.000 celler /brønd i plader med 24 brønde eller 200.000 celler /brønd i 6-brøndsplade 24 timer efter transfektion og inkuberet med forbindelser eller vehikel (DMSO) ved de doser og tidspunkter angivet. Luciferaseaktivitet i cellelysatet blev bestemt med et luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. Billeder blev erhvervet i 1 min med en Xenogen IVIS 200 (Caliper, Hopkinton, MA). Lige store områder blev analyseret ved anvendelse Living Billede 2,20 software.

klongenicitetsassayet

Eksponentielt voksende SiHa, CaSki og HeLa cervicale cancerceller blev podet ved enten 1.000 eller 100 celler /brønd i 6-brønds plader. En dag efter podning blev cellerne behandlet med enten vehikel alene (mock) eller RAMB1 i de angivne doser, og inkuberet ved 37 C i 5% CO

2 i 10 dage. Ved afslutningen af ​​behandlingen blev mediet fjernet, og cellerne blev skyllet med PBS før fiksering og farvning af kolonierne under anvendelse af en blanding af 6,0% glutaraldehyd og 0,5% krystalviolet som beskrevet tidligere [27]. Kolonier blev afbildet og talt under anvendelse af et Nikon Eclipse TE 2000E omvendt mikroskop og billeder taget med Spot 3.5.8 erhvervelse software (Diagnostiske Instrumenter, Sterling Heights, MI). Alle forsøgene blev udført tredobbelt.

Statistisk analyse

Resultater er rapporteret som middelværdi ± standardafvigelse (SD). Statistisk signifikans af forskelle blev vurderet ved to-halet Students

t

anvendelse af Prism (V.5 Graphpad, San Diego, CA) og Excel. Niveauet af signifikans blev sat til p ≤ 0,05. Kombinationen index (CI) for RAMB1 og chloroquin blev beregnet ved median-effekt-analyse i overensstemmelse med fremgangsmåden af ​​Chou og Talaly [28]. CI 1 angiver synergisme, CI = 1 angiver additivitet, og CI 1 angiver antagonisme. Yderligere regression blev udført for at stabilisere skøn.

Resultater

Ramb forbindelser selektivt reducere levedygtigheden af ​​livmoderhalskræft celler uafhængigt af HPV-genotype

via

blokade af proteasomalaktivitet nedbrydning

flavonoider og triterpenoider familiemedlemmer, herunder celastrol [19], resveratrol [29], [30], curcumin [17], epigallocatechin-3-gallate [20], [31], [32], [33], [ ,,,0],34] og chalkone [35], [36] udviser anti-cancer egenskaber forbundet med deres aktivitet som proteasominhibitorer [14], [15], [16], [21]. Vi har for nylig rapporteret, at arten af ​​aminosyren del af molekylet i chalcon-baserede proteasominhibitorer bibringer specificitet mod katalytiske aktiviteter af 20S proteasomet [14]. Baseret på adskillige tidligere undersøgelser [22], [23], [37], fremsatte vi den hypotese, at α-β keton system med chalconer kan repræsentere den mindste molekylære determinant for inhibering af ubiquitinmedieret proteinnedbrydning opstrøms for proteasomer.

for at teste denne hypotese vi oprindeligt screenede et bibliotek af chalcon-baserede derivater udøver forskellige substituenter på de aromatiske ringe støder op til α-β keton system og manglede aminosyredel portioner, for deres inhiberende kapacitet cellevækst i eksponentielt voksende HPV18-positive HeLa cervical cancercellelinie i et koncentrationsområde fra 100 til 0,01 pM (ikke vist). Fire chalcon derivater, herefter benævnt RAMBs, kan reducere cellelevedygtighed af eksponentielt voksende HeLa cervical cancerceller på en dosis-afhængig måde med IC

50 værdier 5 um, blev valgt til yderligere evaluering (figur 1). For at bestemme muligheden for at anvende RAMBs forbindelser til behandling af livmoderhalskræft, vi testede, om RAMB1-4 behandling specifikt ville hindre celle levedygtighed livmoderhalskræft celler end normale keratinocytter og hvorvidt reduktionen i levedygtighed celle i livmoderhalskræft celler er afhængig af HPV -genotype. Som vist i figur 2, RAMB1 eller RAMB4 behandling frembragte en dosisafhængig reduktion i levedygtigheden af ​​HPV16-positive SiHa og Caski-celler og HPV-39-positive ME180 cervikale cancercellelinier henholdsvis med minimale virkninger på levedygtigheden af ​​primære humane keratinocytter og med IC

50 ligner den opnået med HeLa. Lignende resultater med lidt højere IC

50 blev opnået ved anvendelse RAMB2 og RAMB3 (ikke vist). For at teste, om reduktionen i cellelevedygtighed observeret i cervicale cancerceller efter eksponering for de RAMB1-4 forbindelser skyldtes deres kapacitet forstyrre ubiquitinmedieret proteinnedbrydning, monitorerede vi niveauerne af akkumulering af poly-ubiquitineret proteiner efter behandling. Specifikt blev HeLa-celler behandlet med 5 pM af RAMB1, RAMB2, RAMB3 eller RAMB4 eller 10 nM bortezomib, sidstnævnte anvendes som UPS-stressor positiv kontrol, over et tidsrum på 6 timer. Som vist i figur 3 (

venstre panel

), immunoblotanalyse af ubiquitinerede protein ekspressionsniveauer i HeLa-celler viste et klart mønster for akkumulering af poly-ubiquitineret proteiner i RAMBs -behandlet HeLa kulturer. En semikvantitativ analyse af de polyubiquitinated proteinniveauer viser, at GAPDH-normaliseret niveau polyubiquitinated proteiner er konsekvent højere (op til 3 gange) i Ramb-behandlede versus mock-behandlede celler (figur 3,

højre panel

). Disse resultater antyder, at faldet i cellelevedygtighed observeret i den cervikale cancercellelinie panel, men ikke i normale celler efter RAMBs behandling er forbundet med den forstyrrelse af ubiquitinmedieret proteinnedbrydning og forekommer uanset den onkogene HPV-type.

IC

50 værdier blev bestemt ved XXT assay. IC

50 værdi rapporteret er gennemsnittet af tre uafhængige bestemmelser.

Kulturer af HPV-transformerede cervicale cancerceller (SiHa, CaSki og ME180) eller primære humane keratinocytter blev behandlet med de angivne koncentrationer af RAMB1 (

venstre panel

) eller RAMB4 (

højre panel

) over en periode på 48 timer. Cellernes levedygtighed blev bestemt ved XTT assay og plottet som en brøkdel af de ubehandlede kontrolkulturer

Venstre panel:.

Immunoblotanalyse af ubiquitinerede proteiner i HeLa-celler efter 6 timers eksponering med eller uden 10 uM RAMBs. Bortezomib blev anvendt som positiv kontrol. Lig protein loading i hver bane blev verificeret ved anvendelse af et antistof mod GAPDH.

Right panel:.

Kvantificering af ubiquitinpromotoren /GAPDH nøgletal

Ramb behandling udløser en Ubiquitin-Proteasome-System (UPS) -stress respons uden at påvirke 20S proteasom katalytiske aktiviteter

for at teste, om den hurtige (seks timer eller derunder, upublicerede data) ophobning af poly-ubiquitineret proteiner efter RAMBs eksponering sker samtidig med direkte hæmning af de katalytiske aktiviteter proteasomer, vi testet for evnen af ​​RAMB1 og RAMB4 (som inducerede en større akkumulering af polyubiquitinated protein end de andre RAMBs, at figur 3) inhibere specifikke katalytiske underenheder i 20S proteasom. Specielt de RAMBs blev testet for deres evne til at hæmme chymotrypsin-lignende (CT-lignende), trypsin-lignende (T-lignende) og peptidylglutamyl peptid hydrolyserende-lignende (PGPH-lignende) aktiviteter i 20S renset proteasom forhånd udsat for stigende doser op til 10 uM RAMBs i en periode på 30 minutter efter tilsætning af fluorogene substrater [38]. FDA licenseret proteasominhibitor Bortezomib blev anvendt som positiv kontrol. Som vist i figur 4 profil proteasomhæmning viser, at i modsætning Bortezomib, RAMB1 og RAMB4 behandling inhiberede ikke proteasomalaktivitet funktioner ved prøvning koncentrationer op til 10 uM (lignende resultater blev opnået med de andre forbindelser i serien, ikke vist).

Oprensede 20S proteasomer blev behandlet i 30 minutter med eller uden Ramb forbindelser eller Bortezomib, her anvendt som positiv kontrol, ved de angivne koncentrationer og de specifikke fluorogene substrater for chymotrypsin-lignende, trypsinlignende og peptidylglutamyl peptid hydrolyserende-lignende hydrolytiske proteasom kapacitet blev efterfølgende tilføjet. Et repræsentativt eksempel på to uafhængige forsøg er vist.

For at vurdere, om den manglende hæmme proteasomalaktivitet funktion

in vitro

kan sammenfattet i ubeskadiget proteasom findes i levende celler, vi udnyttet to forskellige tilgange. Først, vi udnyttet den ubiquitin-luciferase bioluminescerende reporter 4XUb-FL, som modstår spaltning med ubiquitin hydrolaser [26], til transfektion af HeLa-celler. Brug af Ub-FL og FL transficerede HeLa-celler har vi overvåget luciferaseaktivitet efter udsættelse for RAMBs over en periode på 6 timer. Som vist i figur 5

(venstre)

modsætning Bortezomib eller vores nyligt identificeret proteasominhibitor RA1 [14], her anvendt som proteasominhibitorer positive kontroller, RAMB1 eller RAMB4 behandling inducerede en svagere stabilisering af Ub-FL reporter når testet ved koncentration op til 20 uM end set for enten RA-1 eller Bortezomib. Kvantificering af Ub-FL /FL-forholdet i mock versus RAMBs eksponerede kultur leveres i figur 5 (

midterste

panel). Dernæst blev den manglende inhibering af 20S proteasomalaktivitet i Ramb-behandlede celler bekræftes ved at måle den tilbageværende fluorogene aktivitet i 20S proteasom oprenset fra CaSki cervikal cancerceller forud eksponeret for RAMB1 eller RAMB4 i 4 timer. Som vist i figur 5 (

højre panel

), i modsætning Bortezomib, RAMB1 behandling undladt at inhibere chymotryptisk aktivitet af proteasomer ved prøvning koncentrationer op til 20 uM. Tilsammen har dette tyder på, at tabet af cellelevedygtighed i livmoderhalskræft celler efter RAMBs eksponering sker samtidig med ophobning af polyubiquitated proteiner uden direkte hæmning af 20S proteasomalaktivitet

Venstre panel:.

luciferaseaktivitet i lysater af Ub-FL eller FL-vektor transficerede celler enten med eller uden behandling med Ramb forbindelser eller Bortezomib blev kvantificeret i relative luminescensenheder (RLU) og udtrykt som% af kontrol. Fejl barer er Standardafvigelse (SD) i tre uafhængige forsøg.

Mellemøsten panel:

Kvantificering af Ub-FL /FL-forholdet.

Right panel:

Luminescence aktivitet i cellelysater afledt CaSki livmoderhalskræft celler med eller uden Ramb eller Botezomib behandling kvantificeret i relative luminescensenheder (RLU’er). *, P 0,05, **, P. 0,02

RAMB1 behandling inducerer aggresome dannelse og udløser varmechok-respons

Vi og andre har vist, at hæmning af ubiquitinmedieret protein nedbrydning via proteasomalaktivitet hæmning udløser varme-chok og udfoldede protein reaktioner, herunder dannelse af cytobeskyttende strukturer, der kaldes aggresomes som en mekanisme til at kompensere for hæmning af proteasomalaktivitet funktioner og stigende niveauer af UPS stress i kræftceller [4], [6], [39] . For at teste om den hurtige akkumulering af poly-ubiquitineret protein ved RAMB1 behandling sker samtidigt med varme-shock protein responser (UPR) vi overvåges protein ekspressionsniveauer af Hsp90 i HeLa cervical cancerceller udsat for 10 uM RAMB1-3 i 8 timer. Som vist i figur 6A (

venstre panel

) immunoblotanalyse af Hsp90 protein ekspressionsniveauer afslørede, at en stærk mønster for akkumulering af Hsp90 i RAMB1-behandlede versus mock-behandlede HeLa-cellekulturer (lignende resultater blev opnået med den anden derivat af serien, ikke vist). En semikvantitativ analyse af Hsp90 proteinniveauer viser, at GAPDH-normaliseret niveau polyubiquitinated proteiner er næsten 2 gange højere i behandlede versus ikke-behandlede celler er vist i figur 6A (

højre panel

).

A.

Venstre panel:

immunoblotanalyse af Hsp90 ekspressionsniveauerne i HeLa livmoderhalskræft celler efter 8 timers eksponering med eller uden 10 pM RAMBs behandling. Bortezomib blev anvendt som positiv kontrol. Lig protein loading i hver bane blev verificeret ved anvendelse af et antistof mod GAPDH.

Right panel:

Kvantificering af Hsp90 /GAPDH-forhold. B. HeLa-celler blev inkuberet med eller uden 5 uM RAMB1 eller 10 nM Bortezomib i 18 timer før fiksering og immuno-fluorescerende farvning af DNA (blå), ubiquitin (grøn) og vimentin (rød) før billeddannelse (60 ×).

Dernæst vi hypotese, at ophobning af poly-ubiquitineret proteiner efter Ramb sammensatte eksponering ville føre til aktivering af alternative kompenserende veje til ubiquitinmedieret protein nedbrydning, specifikt til lysosomale pathway aktivering. For at teste denne hypotese monitorerede vi sub-cellulære lokalisering af ubiquitin ved immunfluorescens mikroskopi-analyse i HeLa cervical cancerceller udsat for 10 uM RAMB1. Som vist i figur 6B immunfluorescensanalyse af poly-ubiquitineret proteiner i HeLa-celler behandlet med RAMB1 afslører tilstedeværelsen af ​​vimentin-bur, ubiquitin-positive, aggresomes struktur i overensstemmelse med den tidligere beskrevne ved behandling med bortezomib [6]. Tilsammen disse resultater viser, at i RAMB1-behandlede celler ophobningen af ​​poly-ubiquitineret resultater i lignende cytobeskyttende reaktioner som hæmning af proteasom katalytiske aktiviteter ved Bortezomib, men sker gennem en mekanisme, uafhængig af det.

RAMB1 behandling kundeemner til p53 stabilisering, cyclin D1 destabilisering og indtræden af ​​apoptose

E6 onkoprotein af HPV udøver dets oncogene aktivitet ved at målrette p53 og andre tumor suppressor proteiner til hurtig ubiquitinmedieret proteasomalaktivitet nedbrydning. Dette reducerer niveauet af denne nøgle cellulære cellecyklus regulator uden mutation af p53. For at teste, om forringelse af ubiquitinmedieret proteinnedbrydning efter RAMBs behandling fører til stabilisering af p53 som en potentielt bidrager mekanisme initierende celledød undersøgte vi ekspressionsniveauerne af p53 efter 6 timers eksponering for forbindelser 10 um af RAMBs. Som vist i figur 7A, er 8 timer RAMB1 eksponering forbundet med dosisafhængig akkumulering af p53 i CaSki cervikal cancerceller sammenlignet med mock kontrol. Vigtigere, p53 stabilisering forårsager undertrykkelse af cyclin D1-promotoren resulterer i aktiv undertrykkelse af cyclin D1 transkription [40]. For at teste om dette resulterer i reduktion af cyklin D1 ekspressionsniveauerne blev CaSki livmoderhalskræft celler udsat for stigende doser af RAMB1 over en periode på op til 8 timer. Som vist i figur 7B

(venstre panel)

RAMB1 behandling forårsager tidsafhængig (

top

) og dosisafhængig (

bund

) fald i cyclin D1 niveauer tyder fiasko af livmoderhalskræft at indtaste S- fase af cellecyklussen som en årsag til celletoksicitet [41]. En semikvantitativ analyse af β-actin-normaliseret cyclin D1-niveauer er givet i figur 7B (

højre panel øverste og nederste

).

A. Immunoblotanalyse af p53 ekspressionsniveau i CaSki celler behandlet med den angivne koncentration af RAMB1 over en periode på 8 timer. Equal loading er hver bane blev verificeret ved amidsortfarvning. B.

Top venstre panel:

Immunblotanalyse af cyklin D1 udtryk niveau i CaSki celler med eller uden 10 uM RAMB1 for en periode på op til 8 timer. Protein loading blev undersøgt under anvendelse af et antistof mod β-actin.

Top højre panel:

Kvantificering af cyklin D1 /β-actin-forholdet.

Nederst venstre panel:

Immunblotanalyse af cyklin D1 udtryk niveau i CaSki celler med eller uden RAMB1, ved den angivne koncentration i en periode på 8 timer. Lig protein loading i hver bane blev verificeret ved anvendelse af et antistof mod β-actin.

Nederst til højre panel:

Kvantificering af cyklin D1 /β-actin-forholdet. C.

Venstre panel

. HeLa-celler blev behandlet med 10 uM RAMB1 i 8 timer og analyseret ved flowcytometri efter farvning for annexin V-binding og 7-AAD inkorporering.

midterste panel

: Immunoblotanalyse af fuld længde og spaltes PARP i HeLa-celler behandlet 10 uM RAMBs over en periode på 8 timer. Protein loading blev vurderet under anvendelse af et antistof mod β-actin.

Right panel

:. Kvantificering af spaltet PARP /β-actin forhold

For at teste om dette resulterer i reduktion af cyklin D1 ekspressionsniveauerne blev CaSki livmoderhalskræft celler udsat for stigende doser af RAMB1 over en periode på op til 8 timer. En semikvantitativ analyse af p-actin-normaliseret cyclin D1-niveauer er givet i figur 7B (

højre panel øverste og nederste

). Som vist i figur 7B

(venstre panel)

RAMB1 behandling forårsager meget hurtig (

top

) og dosisafhængig (

bund

) fald i cyclin D1 niveauer tyder svigt af livmoderhalskræft at indtaste S-fasen af ​​cellecyklussen kan bidrage til tab af cellelevedygtighed [41].

stabilisering af p53 steady state-niveauerne og destabilisering af cyclin D1 niveauer tyder på, at reduktionen i cellelevedygtighed observeret i panelet for livmoderhalskræft celler efter RAMBs eksponering kan udløse indtræden af ​​apoptose. For at teste denne hypotese blev HeLa cervical cancerceller udsat for 5 uM RAMB1 og analyseret ved flowcytometri efter farvning for annexin V-binding og 7-AAD inkorporering. Annexin V og 7-AAD farvning gør det muligt at skelne levedygtige (annexin V

neg /7-AAD

neg), apoptotiske (annexin V

pos /7-AAD

neg), og døde (annexin V

pos /7-AAD

pOS) celler. Som vist i figur 7C (

venstre panel

), 24 timers udsættelse for RAMB1 forårsagede en stigning i både den tidlige (annexin V positiv befolkning) og sent (annexin V og 7-AAD dobbelt positive population) og apoptotisk befolkning i behandlede kulturer i forhold til kontroller. At vurdere, om dette skyldes caspaseaktivering målte vi niveauerne af PARP-spaltning i HeLa cancerceller efter eksponering for RAMB1. Som vist i figur 7C (

midterste panel

), højere niveauer af spaltet PARP er tydelig i behandlede versus ubehandlede kulturer indikerer caspase-3-aktivering. Kvantificering af den spaltede PARP /GAPDH er tilvejebragt i figur 7C (

højre panel

). Disse resultater understøtter vores hypotese, at RAMBs behandlingen udløser apoptose i livmoderhalskræft celler.

RAMB1 behandling forebygger forankring-afhængige tumor-koloni dannelse af livmoderhalskræft celler og synergistisk med lysosomet inhibitor Klorokin

Et kendetegn