PLoS ONE: Small Molecule R1498 som en veltolereret og oralt aktivt kinaseinhibitor for hepatocellulært carcinom og Gastric Kræftbehandling via Målretning angiogenese og mitose Pathways

Abstrakte

Proteinkinaser spiller en vigtig rolle i tumor udvikling og progression. Masser af kinase hæmmere har indgået marked og viser lovende kliniske fordele. Her rapporterer vi opdagelsen af ​​en ny lille molekyle, veltolereret, oralt aktiv kinase inhibitor, R1498, majorly målrette både angiogene og mitotiske veje til behandling af hepatocellulært carcinom (HCC) og gastrisk cancer (GC). En række biokemiske og cellebaserede analyser indikerede, at målkinasen klynge af R1498 inkluderet Aurora kinaser og VEGFR2 et al. R1498 viste moderat

in vitro

væksthæmning på et panel af tumorceller med IC50 af mikromol rækkevidde.

in vivo

anti-tumor effekt af R1498 blev evalueret på et panel af GC og HCC xenografter i en parallel sammenligning med en anden multikinasehæmmer, sorafenib. R1498 viste overlegen effekt og toksicitet profil løbet sorafenib i alle testmodeller med 80% tumor væksthæmning og tumorregression i nogle xenogratfts. Den terapeutiske potentiale R1498 blev også fremhævet af dens effektivitet på tre humane GC primær tumor afledt xenograftmodeller med 10-30% tumorregression sats. R1498 blev vist til aktivt hæmme Aurora A-aktivitet

in vivo

, og mindske vaskularisering i tumorer. Desuden R1498 præsenterede god

in vivo

eksponering og terapeutisk vindue i de farmakokinetiske og dosis range finding studier. Specialer beviser tyder på, at R1498 er en potent, veltolereret, oralt aktiv multitarget kinase inhibitor med en unik antiangiogene og antiproliferativ profil, og yde stor tillid til videreudvikling for HCC og GC terapi

Henvisning:. Zhang C, Wu X, Zhang M, Zhu L, Zhao R, Xu D, et al. (2013) Small Molecule R1498 som en veltolereret og oralt aktivt kinaseinhibitor for hepatocellulært carcinom og Gastric Kræftbehandling via Målretning angiogenese og mitose Pathways. PLoS ONE 8 (6): e65264. doi: 10,1371 /journal.pone.0065264

Redaktør: Claude Prigent, Institut de Génétique et Développement de Rennes, Frankrig

Modtaget: Februar 22, 2013; Accepteret: April 23, 2013; Udgivet: 5 juni 2013

Copyright: © 2013 Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: Alle forfattere er medarbejdere eller tidligere medarbejdere i Roche R D center (Kina) undtagen Taiping Chen. , der er ansat i et CRO selskab ved navn Crown Bioscience Inc. Beijing, Kina. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Proteinkinaser tjene som mål for terapeutisk intervention i kræftsygdomme, som er valideret og bevist af vellykket og bred anvendelse af protein kinase inhibitorer i flere kræftformer, enten som enkeltstof eller i kombination regimer. Men som en heterogen sygdom forårsaget af akkumulerende multi-genmutationer i stedet drives af enkelt kinase mutant, cancere, der holder god respons på enkelt middel terapi er meget begrænsede. Hertil kommer, at erhvervet resistens af tumorer hjælpe sig selv hurtigt unddrage fra kemoterapi, derefter tilbagefald. Den komplekse afvigende signalering i kræft tiltrækker udviklingen af ​​strategier, der er rettet mod flere biologiske veje er relevante for tumor biologi såsom spredning, metastaser og anti-apoptose. En strategi indebærer rationelle lægemiddelkombinationer. For eksempel kombinationen af ​​VEGF målrettede monoklonale antistof med konventionel kemoterapi har vist signifikant overlevelsesfordel i bryst, colon og lungecancere [1]. En anden strategi er at udvikle de forbindelser, der dækker flere mekanismer i en enkelt agent. Denne fremgangsmåde har flere potentielle fordele i forhold til kombination strategier, herunder enkelhed udviklingsvej, hastighed til markedet, og mindre overlap af bivirkninger. I øjeblikket er multikinasehæmmer, sorafenib bruges som første linie behandling for avanceret og metastatisk HCC med forbedring af median overlevelse fra 7,9 måneder (placebogruppen) til 10,7 måneder [2]. Men behandling med sorafenib resultater i statistisk signifikante, men klinisk mild, forbedringer i samlet overlevelse, tid til progression og sygdomskontrolrate [3]. I mellemtiden er traditionel cisplatin-baseret behandling stadig meget udbredt i kliniske indstillinger for avanceret og metastatisk GC. For HER2 /neu overekspression gastriske adenokarcinomer, trastuzumab i kombination med kemoterapi forlænger den mediane samlede overlevelse fra 11,1 måneder (kemoterapi alene) til 13,8 måneder [4]. Selvom companioned diagnostisk metode blev etableret for at skærmen target patienter, trastuzumab har ingen aktivitet i et stort undergruppe af patienter, der huser højt HER2 /neu med årsagen til at identificere [5]. I betragtning af den høje dødelighed af HCC og GC og aktuelle behandlingsregimer med begrænset resultat, er der stadig stor udækket medicinsk behov for begge typer kræft.

Angiogenese baseret kræftbehandling, herunder anti-VEGFR-2-antistof, små molekyler mod VEGFR -2 signalering [6], [7], og VEGFR kimære protein [8], har vist sig at være en effektiv strategi til behandling af flere typer kræft. Desuden ville effektiviteten af ​​multikinasehæmmer inhibitorer sunitinib og sorafenib delvis tilskrives VEGF-signalering blokering [9]. Men en række patienter er uløseligt resistent eller udvikle resistens over for anti-antiangiogenisk terapi efter flere behandlingscykler [10], [11]. Således er kliniske forsøg kombinerer angiogene inhibitorer og medikamenter med alternativ virkningsmekanisme forventes at forbedre effektivitet eller overvinde modstanden mod antiangiogenisk behandling [12]. Det har været almindeligt anerkendt, at overekspression af aurora kinaser i forskellige kræftformer er involveret i processen med tumorigenese [13], [14]. Aurora-kinase inhibitor VX-680 var i stand til effektivt at hæmme væksten kræftceller

in vitro

in vivo

, og efterfølgende indgik i kliniske forsøg, hvilket tyder på, at Aurora kinaser er druggable mål [15] .

i lyset af de akkumulerende beviser på angiogenese og Aurora-kinaser i kræft og deres terapeutiske værdier bevist af de biologiske og små molekyler hæmmere, opdagede vi en kinase inhibitor, R1498, som væsentligt påvirket de vigtigste veje for angiogenese og mitose. R1498 har unikke kinase hæmning profil, høj potens, og god farmakokinetiske og toksikokinetiske profiler, alle disse støtter videre klinisk udvikling.

Materialer og metoder

Etik Statement

brug og pleje af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC), Roche R 98%). Blev syntetiseret af Roche R D center (Kina). For enzymatiske assays og

in vitro Salg cellebaserede assays, R1498 blev opløst i DMSO som 0,01 mol /l stamopløsning. For dyreforsøg, blev R1498 opløst i 1% Klucel EF /0,1% polysorbat 80 /0,09% methylparaben /0,01% propylparaben vand, blev fremstillet på en ugentlig basis. Sorafenib blev syntetiseret af Roche R . D center (Kina). Mandlige nøgne mus (kropsvægt: 19 til 24 g) blev anvendt i SDPK undersøgelse. Før farmakokinetisk undersøgelse blev dyrene randomiseret til stikprøvespørgsmålene grupper (3 dyr pr tidspunkt). Ti yderligere mus blev anvendt til opsamlet plasma blank for kalibreringskurver. Musene blev fastet natten før oral indgivelse.

Blodprøver blev opsamlet ved retro-orbital punktur ved prædosis og 0,033, 0,083, 0.25,0.5, 1, 2, 4, 6, 8, og 24 timer efter dosering. Plasmaprøverne og dosis formulering blev opbevaret ved -20 ° C indtil bioanalyse. erhvervelse og kontrol af data system blev skabt ved hjælp af Analyst 1.4 software fra ABI Inc. Koncentrationerne i plasma under grænsen for kvantificering (LOQ = 1 ng /ml) blev udpeget som nul. Den farmakokinetiske dataanalyse blev udført ved anvendelse noncompartmental analyse moduler i WinNonlin Professional V5.2 (Pharsight, USA) .Den biotilgængelighed blev beregnet som F (%) = (Dose

iv × AUC

po (0-∞)) /(Dosis

po × AUC

iv (0-∞)) * 100%. For rotte, hund og abe SDPK blev blodprøver indsamlet fra halsvene punktering.

xenotransplantat effektstudie med cellelinjer og Patient Afledt Tumorer

Anvendelse og pleje af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, Roche R 1:200 i TBS /T) ved 4 ° C natten over, derefter inkuberet i 100 pi DAKO Envision + /HRP, kanin /mus efter at være blevet vasket grundigt med TBS. Et hundrede mikroliter substrat-chromogen opløsning (DAB) blev påført objektglassene og inkuberes ved stuetemperatur i 10 min. Objektglassene blev skyllet forsigtigt med postevand i 15 minutter. Counterstain og dehydrering blev udført ved XL ST5010 ved stuetemperatur. Endelig blev objektglassene monteres med Permount montering medium (Fisher Scientific, Miami, FL).

Dose Range Finding og Toksikokinetisk Study

Dose range finding og toksikokinetiske undersøgelse blev udført i rotter og Beagle hunde baseret på

in vitro

metabolitter identifikation. Wistar-rotter (hanner: 3, kvindelige 3 i hver gruppe, fra Vital River, Beijing, Kina) blev fastet natten over, og derefter modtog test- artikler som 0, 6,25, 50 og 100 mg /kg to gange dagligt pr oral sonde for en 14 -dag kontinuerlig regime. Motilitet observation blev påført på en daglig baser for at finde den maksimale tolerante dosis for dyrene. Dyrene blev aflivet på D14, og følgende toksikologi observation blev udført herunder ændringer i kropsvægt, klinisk observation, makroskopisk, hæmatologi kemi og histopatologi. På dag 1 og dag 14 blev blodprøver opnået via halsvene punktur fra alle dyr (hvis levende, under anvendelse EDTA-K2-rør). Prøver blev blandet forsigtigt og placeres på knust våd-is indtil centrifugering, som blev udført straks. Prøverne blev centrifugeret i ca. 15 minutter ved 4 ° C 2.700 rpm. Den resulterende plasma blev separeret, overført til entydigt mærkede klare polypropylenrør og straks nedfrosset i fast carbondioxid (tøris), indtil overført til ca. -80 ° C. Hvert dyr blev åreladet ved følgende tidspunkter: ca. 5 min, 15 min, 30 min, 1, 2, 4, 8 og 24 timer efter den første dosis på selve dagen. De medikamentkoncentrationer i plasmaet blev bestemt ved LC-MS /MS. Den farmakokinetiske analyse blev udført ved anvendelse af WinNonlin software (Version 5.2, Pharsight Corporation, CA, USA), og de farmakokinetiske parametre blev beregnet ved anvendelse af en ikke-kompartment model metode. Salg

beaglehunde (ca. 8-10 måneder, fra Beijing Marshall Biotechnology Co. Ltd., Beijing, Kina) blev udsat for forsøgsprotokollen, som beskrevet ovenfor. Hver gruppe har en han og en hun hund, doserne af testartiklen var: 0, 1, 7,5 og 15 mg /kg. Brugen og pleje af forsøgsdyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, Roche R . D Center (Kina)

Dataanalyse og statistik

Uafhængig t-test blev anvendt til kontinuerlig data analyse, og χ2 test blev anvendt til kategoriske data. Data blev betragtet som signifikante, når p-værdier var. 0,05

Resultater

1. Karakterisering af R1498 som en multikinasehæmmer,

Pyrazolobenzodiazepine analog R1498, med et stillads baseret på fusionen af ​​et benzodiazepin og pyrazolring (figur 1A), er tidligere blevet identificeret til at være en svag cyclin-afhængig kinase 2 (CDK2) inhibitor [19]. Dette molekyle viste karakter af en multikinasehæmmer, når vi analyserede kinaseinhibitor bibliotek. Den kinaseinhibering profil R1498 (1 uM) blev karakteriseret via KINOMEScan® i ATP-koncentration omkring Km af hver kinase. Inhiberingen på R1498 er over 80% mod 39 kinaser ud af 402 kinaser, herunder 359 vildtypekinaser og 43 kinase mutanter (Figur S1). Dissociationskonstanterne (Kd) af 39 hit kinaser blev derefter bestemt, og kinaserne med Kd 0,2 uM blev vist i figur 1B. De fleste af de potentielle hits tilhører tyrosinkinasen (TK) familie og AGC familie. Desuden blev Z-Lyte assay udføres for yderligere bestemmelse af kinasen hæmning aktivitet af R1498. Resultaterne viste, at IC50’er af R1498 var 25 ± 6, 67 ± 4, 167 ± 13 nM mod VEGFR2, Aurora kinase A og B henholdsvis (figur 1C). Så vores undersøgelse blev fokuseret på de antiangiogene og anti-mitotiske veje majorly ramt af R1498

(A) Kemisk struktur R1498.; (B) R1498 blev underkastet KINOMEScan® og de mest potente hits med Kd 0,2 um er vist; assayet blev udført i tre eksemplarer, og data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse; (C) R1498 blev testet i Z-Lyte kinaseassays herunder VEGFR2, Aurora A og B, blev dosisresponskurve den viste og betyde IC50-værdier fra tre uafhængige forsøg blev angivet. (D)

in vitro

anti-tumorvækst aktivitet R498 blev analyseret på 16 cellelinjer, herunder HCC, GC og NPC. Data fra triplikerede uafhængige assays blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse.

Et panel af 16 cancercellelinjer, herunder leverkarcinom, mavekræft og nasopharyngeale carcinomer cellelinier, blev anvendt til at bestemme

i vitro

anti-spredning evne R1498. De fleste af de cellelinier etableret fra asiatiske cancere, som de asiatiske udbredte kræftformer er vores fokus. Den leverkarcinom og gastrisk cancercellelinie panel var mere følsomme over for R1498 behandling end nasopharyngeale cancercellelinier. Gennemsnitskoncentrationer IC50’er var 7,81, 7,55 og 30,07 uM, svarende til epatocellular carcinoma, gastrisk cancer, og nasopharyngeale carcinomer cellelinier hhv. Følsomheden af ​​cellelinjer afledt af asiatiske befolkning (BEL-7402, QGY-7701 og QGY-7703) var sammenlignelig med følsomheden af ​​Hep3B der var fra kaukasisk (Figur 1D).

2. R1498 Hæmmer Aurora kinaser og inducerer cellecyklusstop

Aurora kinase hæmning af R1498 blev visualiseret ved immunfluorescens i mavekræft cellelinje SGC-7901. Direkte phosphoryleringssteder phospho-Aurora kinase A (T288) og phospho-histon H3 (S10) blev anvendt til at indikere kinaseaktiviteten af ​​Aurora A og B henholdsvis [20], [21]. Phospho-Ser /Thr-Pro Mitotisk protein monoklonalt # 2 (MPM2) blev anvendt som en mitotisk markør (rød) til mærkning mitotiske celler. Aurora kinase A (T288) phosphorylering forekommer i centrosom af mitotiske celler (grøn). Efter cellerne blev behandlet med 5 uM MR1498 i 24 timer, Aurora A T288 grøn foci i mitotiske celler blev svagere eller forsvundet (figur 2A, øverste panel), der viser, at aktiviteten af ​​Aurora kinase A faldt på R1498 behandling. Phosphoryleringen af ​​histon H3 (S10) er hovedsageligt lokaliseret i centromerer i mitotiske celler. Efter at cellerne var behandlet med R1498, phospho-histon H3 (S10) faldt kraftigt (grøn). Denne observation tydede på, at aktiviteten af ​​Aurora kinase B også faldet ned på R1498 behandling. Disse resultater fra immunofluorescens blev bekræftet ved Western blot. Som vist i figur 2B, phosphorylering af phospho-Aurora kinase A (T288) og phospho-histon H3 (S10) faldt i en koncentrationsafhængig måde ved akut behandling af R1498.

(A) SGC-7901 gastrisk cancer-celler blev behandlet med 5 pM R1498 i 24 timer, derefter fikseret og farvet for phospho-Aurora A (T288) (grøn), MPM2 (rød) og DNA (blå). MPM2 blev anvendt til at lokalisere de mitotiske celler. Lysegrønne foci pegede af hvide pilespidser angivet det høje phospho-Aurora A (T288) i centromer (øverste felt). R1498 behandlet SGC-7901 gastrisk cancerceller som ovenfor blev farvet for phospho-Histone H3 (H10) (grøn), MPM2 (rød) og DNA (blå) (nedre panel). Repræsentative billeder fra 2 uafhængige analyser er vist. (B) R1498 behandlet SGC-7901-celler som ovenfor, blev underkastet DNA-analyse ved flowcytometri via propidiumiodidfarvning. Histogrammerne blev yderligere analyseret ved Modfit 3.0 til cellecyklusfordeling. Cellerne med DNA-indhold mere end 4 N ( 4N) betyder aneuploidi forårsaget af endoduplication. Repræsentative histogrammer 3 uafhængige assays er vist. (C) SGC-7901 synkroniseret med nocodazol (300 nM) i 12 timer blev behandlet med forskellige koncentrationer af R1498 og derefter lyseret og underkastet til western blot med tilsvarende antistoffer. (D)

In vitro

tubulin polymerisering assay blev udført med R1498 og docetaxel, og OD340 blev målt og registreret i en tid gået måde. Repræsentative histogrammer fra 2 uafhængige analyser er vist.

Hæmning af Aurora-kinaser A og B fremstiller forskellige fænotypiske ændringer i cellecyklus. Undertrykkelse af Aurora A inducerede cellecyklus G2 fasen [22], mens inhibering på Aurora kinase B er rapporteret at forårsage polyploidi i celler som følge af endoduplication uden cytokinese [15]. Efter at cellerne var behandlet med 10 pM R1498, både SGC-7901 (mavekræft celle) og BEL-7402 (hepatocellulært carcinom celle) viste G2 /M-fase standsning og akkumulation af polyploide celler. For BEL-7402, cellerne distribuerer i G2 /M faser steget fra 25,6% til 57,0%, i mellemtiden, cellerne med 4 N DNA-indholdet steg fra 6,7% til 17,6%. SGC-7901 var mere følsom, med G2 /M population steg fra 25,2% til 75,5%, og polyploide celler steg fra 3,1% til 21,6% (Figur 2C). Mikrotubulus stabilisator (f.eks taxol) og destabilisator (f.eks colchicin) vil forårsage G2 /M-fase standsning samt. At forstå, om R1498 er en mikrotubulus målrettet reagens,

in vitro

tubulinpolymerisation assay blev udført. Dataene viste, at R1498 hverken stabiliseret eller destabiliseret mikrotubulus polymerisation selv under høj R1498 koncentration (40 uM)

in vitro

(figur 2D), hvilket antyder, at cellecyklussen G2 /M arrest ikke var forårsaget af mikrotubuluscytoskelettet forstyrrelse. Taget sammen foreslår disse data, at R1498 inhiberede Aurora-kinaser A og B i celler og produceret de fænotypiske forandringer i cellerne.

3. R1498 antagoniserer Angiogenese Udvikling af humane endotelceller

Angiogenese blev initialiseret ved sekretion af angiogen vækstfaktor fra tumorceller, og derefter endothelcellerne prolifererer, migrerer og formen fartøj rør i reaktioner på VEGF stimulation. For at løse specificiteten af ​​R1498 antagonisere endotelcellevækst stimuleret af VEGF blev humane navlevene-endotelceller (HUVEC’er) udsat for to forskellige stimuli, VEGF og FBS, under behandlingen af ​​R1498 i 72 timer. Under de dyrkningsbetingelser, der indeholder VEGF eller FBS, viste HUVEC’er anderledes reaktion på R1498. De IC50-værdier var 89 og 2064 nM for VEGF og FBS, henholdsvis; disse foreslog, at R1498 antagoniserede HUVEC vækst drevet af VEGF mere potent end med FBS (figur 3A). I HUVEC rørdannelse assay efter 8 timers udsættelse for R1498, HUVEC’er dannet færre intakte rør masker end DMSO behandlede grupper (figur 3B). R1498 påvirkede ikke HUVEC proliferation under denne behandling syndrom (data ikke vist).

(A) HUVEC’er dyrket i 10% FBS, eller 0,5% FBS med VEGF165 blev behandlet med forskellige R1498 i 72 timer, og derefter analyseret for proliferation endepunkt. Kurverne blev tilpasset med Graphpad Prism5.0. De tre uafhængige assays blev udført i triplikerede og IC50-værdier blev angivet som middelværdi ± standardafvigelse; (B) HUVEC’er dyrket på Matrigel ™ blev behandlet med 3 uM R1498 eller tilsvarende DMSO i 8 timer. Repræsentative billeder fra 2 uafhængige analyser er vist.

4. R1498 Undertrykker væksten af ​​humane Cancer Xenografter

De farmakokinetiske egenskaber med enkelt dosis af R1498 i flere arter, blev bestemt. Halveringstiden tid (T1 /2) og oral biotilgængelighed (Oral BA%) begunstiger yderligere effektstudie i nøgne mus (tabel S1) med en to gange dagligt oral sondeernæring tidsplan. Et panel af xenografter herunder asiatisk mavekræft, leverkarcinom og nasopharyngeal kræft var ansat til sammenligning mellem R1498 og anden multikinasehæmmer, sorafenib (figur 4, tabel S2). Sorafenib er godkendt som første linie behandling for leverkarcinom [2], og er i kliniske forsøg for kombinatorisk behandling for avanceret mavekræft [23]. Den parallelle sammenligning bestod af tumorvækst inhibering, regression og ændringer i kropsvægt af dyr med dosering på 25 mg /kg, to gange dagligt peroralt. I alle testede xenotransplantater viste R1498 bedre tumorvækst hæmning rate (TGI%) i løbet af sorafenib. For leverkarcinom, at TGI% af R1498 er 10-19% mere end TGI% af sorafenib for mavekræft, 2-12% i løbet af TGI% af sorafenib. Regressionen på tumor blev også inkorporeret som et andet terapeutisk slutpunkt. I leverkarcinom panel blev tumorregression observeret i BEL-7402 model, 8/10 (80%) dyr havde tilbageskridt i R1498 gruppe, mens 1/10 (10%) dyr havde tilbageskridt i sorafenib gruppe (figur 4, BEL-7402) . For mavekræft panel, MGC-803 og SGC-7901-xenografter havde samme regression sats som svar på de test artikler: 5/10 (50%) for R1498, og 2/10 (20%) for sorafenib (figur 4, SGC -7901, og tabel S2). Baseret på effektmål fra alle 7 testede modeller, R1498 har bedre effekt end sorafenib under samme behandlingsplan. Desuden viste R1498 god effekt på en nasopharyngeal carcinoma xenograft, TGI% af R1498 (90%, 25 mg /kg, to gange dagligt, pr oral sonde) var overlegne i forhold til standard af pleje-cyclophosphamid (60%, hver 10 dage, intraperitoneal injektion) (figur 4, CNE-2). De ændringer i legemsvægt, som blev optaget i alle modeller for toksicitet sammenligning viste, at den nøgne mus viste mere tåleligt for R1498 under hele behandlingen i BEL-7402, SGC-7901 og CNE-2 modeller, selv om vægtøgning faldt en smule 10 dage efter behandling (figur 4, tabel S2).