PLoS ONE: Selektiv Calcium Følsomhed i Umodne Gliom cancerstamceller

Abstrakte

Tumor-initierende celler er en delpopulation i aggressive kræftformer, der udviser træk deles med stamceller, herunder evnen til at forny sig selv og differentiere, der almindeligvis omtales som stemness. Desuden er sådanne celler er resistente over for kemo- og stråleterapi frembyde en terapeutisk udfordring. At afdække stemness-associerede funktioner i gliom-initierende celler (GICS) blev transkriptom profiler i forhold til neurale stamceller (NSC) og gen-ontologi analyse identificeret en berigelse af Ca

2+ signalering gener i NSC og mere dæmme-lignende (NSC-proksimal) GICs. Funktionel analyse i et sæt af forskellige GIC linjer vedrørende følsomhed over for forstyrret homeostase hjælp A23187 og thapsigargin, afslørede, at NSC-proksimale GICs var mere følsomme, bestyrke transkriptomet data. Endvidere blev Ca

2+ narkotika følsomhed reduceres i GICs efter differentiering, med mest potente effekt i NSC-proksimale GIC, støtte en stemness-associeret Ca

2+ følsomhed. NSC og NSC-proksimale GIC linje udtrykt et større antal ionkanaler permeable for kalium, natrium og Ca

2+. Omvendt et større antal og højere ekspressionsniveauer af Ca

2+ bindende gener, der kan buffer Ca

2+, blev udtrykt i NSC-distale GICs. Især udtryk for AMPA glutamat receptor subunit GRIA1, viste sig at associere med Ca

2 + følsomme NSC-proksimale GICs, og faldt som GICs differentierede sammen med reduceret Ca

2+ narkotika følsomhed. Sammenhængen mellem høj ekspression af Ca

2+ kanaler (såsom GRIA1) og følsomhed over for Ca

2 + narkotika blev bekræftet i yderligere ni nye GIC linjer. Calcium narkotika følsomhed også korreleret med udtryk for NSC markører nestin (NES) og FABP7 (BLBP, hjerne lipid-bindende protein) i denne udvidede analyse. Sammenfattende NSC-associerede NES

+ /FABP7

+ /GRIA1

+ GICs var selektivt følsomme over for forstyrrelser i Ca

2+ homeostase, giver et potentielt mål mekanisme til udryddelse af en umoden befolkning maligne celler

Henvisning:. Wee S, Niklasson M, Marinescu VD, Segerman A, Schmidt L, Hermansson A, et al. (2014) Selektiv Calcium Følsomhed i Umodne Gliom cancerstamceller. PLoS ONE 9 (12): e115698. doi: 10,1371 /journal.pone.0115698

Redaktør: Alfredo Quinones-Hinojosa, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: Juli 24, 2014 Accepteret: November 26, 2014; Udgivet: 22 December, 2014

Copyright: © 2014 Wee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og støtte Information filer

Finansiering:. Svensk Childhood Cancer Foundation PR2013-0084 (www.barncancerfonden.se), svensk Cancer Foundation CAN 2011/783 (www.cancerfonden.se), Svensk Forskningsråd 2011-4567 (vr.se), Karolinska Institutet (www.ki.se), Linné center i Developmental Biology for regenerativ medicin (www.dbrm.se). SW blev delvist finansieret af Karolinska Institutet ph.d.-stipendium program. MN blev finansieret af en post-doc stipendium fra det svenske Cancer Foundation. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

glioblastoma multiforme (GBM) er en meget ondartet form for kræft i hjernen med dårlig prognose for de ramte personer. På trods af den kombination af kirurgi, kemoterapi og strålebehandling, mere end 90% af patienterne viser tilbagefald [1], og den gennemsnitlige overlevelse forbliver så lav som 14-16 måneder [2]. Selvom malignt gliom tumorer er stærkt heterogen, en subpopulation af umodne celler, betegnet gliom initierende celler (GICs) [2] – [6] sameksistere med mere differentierede cellepopulationer. GICs har vist sig at være resistente over for radio- og kemoterapi og menes at være ansvarlig for tumor tilbagefald [7]. Afspejler umodenhed GICs og deres evne til at differentiere [8], er disse celler blevet vist at dele en stamcelle (stemness) associeret genekspression med stilk cellepopulationer, såsom teratoma-dannende normale embryonale stamceller [9] – [ ,,,0],11], og det foreslås, at GICs løbende få nye forsyninger bulk tumorceller gennem selvstændig fornyelse og differentiering [11], [12]. Meget af forskningen for GBM behandling lægemiddeludvikling har fokuseret på at målrette bulk-celler, hvoraf de fleste mangler tumor-initierende kapacitet. En stor udfordring, der forbliver øger effekten af ​​kræftbehandlingen målrette GICs som disse celler udvise resistens over for kemo- og strålebehandling ved hjælp nuværende strategier.

Selvom flere signalveje som Notch, Hedgehog-Gli, RTK-Akt, BMP /TGF-β, WNT-β-catenin og STAT3 er blevet vist at understøtte selvfornyelse af stamceller og umodne cancerceller [13], potentielle terapeutiske mål, der selektivt kan udrydde GICs er få [14]. En alternativ strategi til at gøre GICs mindre aggressive blev påvist ved BMP-induceret differentiering terapi [8]. Også dopamin D2 receptorantagonister er blevet identificeret til at drive differentiering af relativt differentierings-resistent leukæmiske og bryst tumorfremkaldende celler [15].

Ionkanaler har længe været tildelt rollen styrende grundlæggende cellulære processer ud over elektrisk ophidselse og for eksempel kalium og Ca

2+ kanal signalering kontrol forskelligartede funktioner som proliferation og migration i stamceller og kræft cellelinjer [16], [17]. Ca

2+ har også været impliceret i cancer celleoverlevelse [18]. For nylig blev det også vist, at indblanding i en Ca

2+ subunit var i stand til at drive lever tumor-initierende celler i apoptose [19].

I denne undersøgelse, vi har sat til at undersøge mekanismer unikke for de stemness-associerede funktioner i gliom celler og konkludere, at stamceller-lignende celler er mere følsomme over for Ca

2+ forstyrrelser i forhold til mere modne celletyper.

Materialer og metoder

Cell kultur Salg

GliNS1, G179NS og G166NS GIC linjer blev dyrket i kultur som beskrevet tidligere [6], [11]. Kort fortalt blev cellerne først dyrket som sfærer i den første uge før overførsel til laminin-overtrukne skåle, hvor de blev dyrket som adhærente monolag i serumfrit human Neurocult NS-A basale medier (StemCell Technologies) suppleret med Glutamax, Hepes, N2 , B27 (Invitrogen), EGF (10 ng /ml) og bFGF (10 ng /ml) (R GE Healthcare), inden de afsløret ved kemiluminescens (Clarity Western ECL Substrat, Bio-Rad; SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, USA)). Bandet intensiteter blev kvantificeret ved hjælp ImageJ (NIH, USA).

Resultater

Transkriptomet profilering identificerer stemness-relaterede Ca

2+ genekspression i GICs

For at bestemme forholdet mellem de menneskelige GIC linjer og menneskelige føtale neurale stamceller (NSC), vi re-analyseret microarray data fra en tidligere undersøgelse af Pollard

et al

[11]. Mens den første principale komponent adskilt normal hjerne fra NSC og GICs (se [11]), den anden vigtigste komponent klassificeret GICs i forhold til deres lighed med NSC, potentielt afspejler aspekter af stemness (fig. 1A). Den stemness-associerede gen SOX2, NSC markør BLBP (hjerne lipid-bindende protein, der kodes af FABP7 genet) samt den neuronale markør TUBB3 (tubulin beta III), hvilket kan afspejle stor sandsynlighed for udvikling samtidig neuronal differentiering, blev udtrykt i højeste i NSC, og ekspressionsniveauerne faldt i rækkefølgen af ​​GliNS1 gruppen G179NS G166NS (fig. 1B). Mens GliNS1 linje blev transkriptionelt relateret til NSC’er (NSC-proksimale), den G166NS linje, udgjorde den distale ende af rækkefølgen i forhold til NSC’er (NSC-distal), udtrykker markører delt med mikroglia og reaktive astrocytter og associeret med inflammation, f.eks IL-6, CXCL2 (MIP-2), og CCL20 (fig. 1B).

(a) GIC linjer rangordnede i forhold til NSC linjer (anden komponent i en principal komponent analyse af microarray baseret mRNA-ekspression data fra Pollard et al [11], hvor den første komponent segregerer NSC’er og GICs fra normalt hjernevæv). GliNS1 er afledt af G144ED linje i Pollard et al undersøgelse. (B) Re-analyse af transkriptom profiler i Pollard et al sammenligne GICs til NSC’er indikerer en NSC-proksimal klynge af stamceller-lignende GICs med høj lighed med NSC, deling f.eks SOX2 og BLBP ekspression. NSC-distale GIC linjer i modsætning udtrykte mikroglia markører, såsom CXCL2, CXCL5 og CCL20. (C) De novo-RNA-sekventering analyse og parvise sammenligninger af NSC’er og tre individuelle GIC linjer (GliNS1, G179NS og G166NS) viste, at NSC’er udtrykte et større antal gener med 10 gange højere genekspression sammenlignet med alle GIC linjer. (D) parvise sammenligninger af NSC til GIC linjerne GliNS1, G179NS og G166NS, individuelt. Gene berigelse og Gene ontologi analyse af sekventering baseret transkriptom profiler, identificeret en berigelse af Ca

2+ signalering gener i NSC, som steg med rangorden distalt for NSC i parvise sammenligninger. (E) parvise sammenligninger af NSC-proksimale (GliNS1) og NSC-distale (G166NS) GICs. Gene berigelse og Gene ontologi analyse foreslog en switch i Ca

2+ permeable kanaler til Ca

2+ bindende gener i NSC-distale GIC line (øverste bokse). I vulkan plot, gen navne i grønne betegner ionkanal /pumpe /transportør relaterede gener, mens gen-navne i lilla betegne Ca

2+ bindende proteiner gener. Vulkanen plot af sammenligningen af ​​NSC-proksimal og NSC-distale GICs afslørede et større antal ionkanaler udtrykt i NSC-proksimale GIC (GliNS1).

En af de novo dyb RNA sekventering af tre af GIC linjer, der anvendes i Pollard

et al

undersøgelse (GliNS1, G179NS og G166NS) og en NSC linje (hf5205NS) viste, at flere gener blev udtrykt i NSC’er end GIC linjer (figur 1C;. S1), potentielt afspejler deres plasticitet og evne til at differentiere. Parvis NSC-GIC gen berigelse og funktionel annotation (gen ontologi) analyse uventet viste, at Ca

2+ ion binding var den mest væsentligt ændret kategori i alle tre cellelinjer – en forskel, der steg i flere NSC-distale GIC linjer (fig . 1D).

Differentiel udtryk for Ca

2+ provokers og buffere vedrører stemness

Cytosoliske Ca

2+ signalering er afbalanceret forskellige aktører, såsom Ca

2+ permeable ionkanaler, der øger intracellulære Ca

2+ (f.eks spænding gated Ca

2+ kanaler og glutamatreceptorer, her betegnet Ca

2+ provokers) på den ene side, og Ca

2 + bindemidler, der reducerer fri intracellulær Ca

2+ på den anden (her betegnet Ca

2 + buffere) [26]. Direkte parvise sammenligninger mellem forskellige GIC linjer viste, at NSC-proksimale GIC linje (GliNS1) udtrykte et større antal ionkanal-gener, der omfatter Ca

2 + provokers sammenlignet med NSC-distale GIC linje (G166NS). Disse spændte fra Ca

2+ permeable ionkanaler (f.eks glutamatreceptorer: GRIA1, GRIA2, GRIK3 og regulatoriske subunits GRIN2B og GRIN2D), spænding-gated Ca

2+ ionkanaler (CACNA1C /-E /H) og Ca

2 + -aktiverede kalium kanaler (f.eks KCNN3) (fig. 1E). I modsætning hertil NSC-distale GIC linje (G166NS) udtrykte højere niveauer af sensorer af intracellulær Ca

2+ buffere (f.eks S100 familiens gener og CALB1).

For yderligere at afgrænse forskelle i Ca

2+ genekspression mellem testede GIC linjer og NSC’er, ekspression af Ca

2+ provokers og buffere blev analyseret mere detaljeret i alle tre GIC linjer (S1 fig.). Som foreslået i de tidligere parvise sammenligninger, udtryk for glutamatreceptorer faldt i NSC-distale GIC linjer (Fig. 2A). AMPA-receptoren GRIA1 (Ca

2+ gennemtrængelig ionotrope glutamat receptor), som viste det højeste udtryk blandt glutamatreceptorer, rangeret de GIC linjer identisk med den GliNS1 G179NS G166NS set i PCA-analyse (fig. 1A) baseret på sammenligning med NSC genekspression. I modsætning hertil udtryk for Ca

2+ buffere /effektorer steget med en omvendt rangorden af ​​GliNS1 G179NS G166NS (Fig 2B.). Dette blev især slående for S100A6 gen, der var mest rigeligt udtrykt i G166NS. Svarende til mRNA’et data, western blot-analyse af GRIA1 afslørede en 70% og mere end 95% lavere ekspression i G179NS og G166NS henholdsvis sammenlignet med NSC-proksimale GliNS1 linie (fig. 2B og 2E). Western blot analyse af S100A6 viste en 45% og 90% lavere ekspression i G179NS og GliNS1, når det blev sammenlignet med NSC-distale G166NS linie (fig. 2C, 2D og 2E).

Analyse af ekspression af Ca

2+ provokers såsom en af ​​den permeable glutamat receptor-underenheder GRIA1 (A) eller Ca

2+ buffer S100A6 (B) sorteret de 3 GIC kredsløb (GliNS1 og G166NS, n = 5 hver. G179NS , n = 2.) ifølge Ca

2+ lægemiddelfølsomhed, med glutamat kanaler såsom GRIA1, forudsige højere følsomhed og buffer ekspression forudsige lavere følsomhed (*** p 0,001;-parret to-halet t-test) . (C) Western blot-analyse viste GRIA1 og S100A6 proteinekspression, med β-actin som ladningskontrol. (D) Protein ekspressionsniveauer af GRIA1 blev udtrykt som procentvise gange ændring sammenlignet mod til GliNS1 (n = 3) og (E) S100A6 protein ekspressionsniveauer blev udtrykt som procentvise gange ændring sammenlignet mod G166NS (n = 3) (** * p 0,001; ** p 0,01, * p. 0,05 En-vejs ANOVA)

GIC Ca

2+ narkotika følsomhed korrelerer med transkriptom nærhed til NSC

Derudover Ca

2+ provokers og buffere, plasmamembranen lokaliseret Ca

2 + transportører, såsom natrium-calcium vekslere (NCX), der tilhører SLC8 familien og SERCA (Sarco /endoplasmatisk reticulum Ca

2+ ATPase) pumpe lokaliseret i det endoplasmatiske reticulum (ER) membran, aktivt fjerne cytosolisk Ca

2+ at opretholde homøostase [27] – [30]. At udforske potentielle funktionelle konsekvenser af en differentieret udtryk for Ca

2+ ionkanaler og Ca

2+ bindende gener, næste udførte vi en lægemiddel-medieret udfordring Ca

2+ homeostase og signalering, i GIC linjer. Celler blev eksponeret for enten til målet uafhængige kation (Ca

2+) A23187 eller SERCA pumpe inhibitoren thapsigargin (Fig. 3), som øger cytosolisk Ca

2 + niveauer ved to forskellige mekanismer: A23187 ved at tillade Ca

2+ at krydse normalt uigennemtrængelige cellemembranen, og thapsigargin ved at blokere import af Ca

2+ ind på skadestuen. De GIC linjer viste forskelle i følsomhed for både A23187 og thapsigargin (fig. 3A og 3B, henholdsvis), bemærkelsesværdigt med en rangorden mellem linjerne er identiske med den for NSC rødder transkriptom rangorden, med NSC-proksimale GliNS1 være mere følsom end G179NS, mens NSC-distale G166NS var mindst følsomme over for begge lægemidler. Funktionsanalyser viser således, at NSC-proksimale GICs med en højere ekspression af Ca

2+ provokers, er mere følsomme overfor forstyrrelser i cytosolisk Ca

2+ regulering end GICs med NSC-distal fænotype, som udtrykker højere niveauer af Ca

2+ buffere.

(A) Dosis respons analyse (0,01-40 uM) af Ca

2+ A23187 og (B) SERCA Ca

2+ pumpe inhibitor thapsigargin viste, at Ca

2+ narkotika følsomhed rangordnede med transkriptom lighed med NSC, med højeste følsomhed i NSC-proksimale GICs. NSC proximal GIC var mere følsomme over for (C) 40 uM A23187 og (D) 0,156 uM thapsigargin behandlinger sammenlignet med NSC distale strækninger (* p 0,05;-parret to-halet t-test). NSC-proksimale GICs n = 3 og NSC-distale GICs n = 4.

Reduceret Ca

2+ narkotika følsomhed på GIC differentiering

Som følsomhed over for Ca

2+ narkotika var forbundet med en NSC-lignende udtryk profil spørgsmålet, om differentiering af GICs ville påvirke Ca

2+ følsomhed blev undersøgt. Til dette formål blev tre GIC linjer underkastet en differentiering protokol ved at anvende føtalt bovint serum (FBS). Validering af differentiering blev gjort ved transkriptom analyse af GIC linjer og deres differentierede afkom under anvendelse af RNA-sekventering (S1 tabel). Principal komponent analyse af det globale datasæt viste, at ændringer i transkriptom var tydelig og adskilt betydeligt mellem udifferentierede GICs og differentierede GICs (diffGICs) (fig. 4A). Interessant GRIA1 udtryk, der korrelerede med Ca

2+ narkotika følsomhed, faldt i alle GIC linjer under differentiering (fig. 4B), der foreslog, at differentiering status kan påvirke Ca

2+ følsomhed. Funktionel Ca

2+ følsomhed blev derfor analyseret under anvendelse A23187 (10 uM, 48 timer) i differentierede GICs og sammenlignet med udifferentierede GICs afslører en tydeligt reduceret effekt på cellelevedygtighed i alle GIC linjer upon differentiering og med den stærkeste effekt i stoffet følsomme NSC-proksimale GIC linje (GliNS1) (fig. 4C). Disse resultater understøtter yderligere data, som Ca

2+ følsomhed er forbundet med umodne NSC-lignende GICs.

(A) RNA-sekventering transkriptom kortlægning efterfulgt af principal komponent analyse verificerede adskillelse mellem udifferentierede og differentierede GICs (GliNS1 , G179NS og G166NS). Højre panel viser immunfluorescerende farvninger af differentieringsmarkører GFAP (rød) og TUJ1 (grøn) ved FBS behandling. (B) Sammenligning af GRIA1 ekspressionsniveauer i udifferentierede og differentierede GICs (n = 6) viste en reduktion i gange ændring i GRIA1 ekspression ved serum-induceret differentiering i alle GIC linier. (*** P 0,001;-parret to-halet t-test). (C) Cellelevedygtighed analyse af relative følsomhed til Ca

2+ A23187 efter differentiering viste forøget levedygtighed efter differentiering af NSC-proksimale GIC line GliNS1 (* p 0,05;-parret to-halet t-test).

Genekspression korrelerer med Ca

2+ narkotika følsomhed

at udforske potentielle yderligere gener korrelerer med Ca

2+ følsomhed, transkriptom data fra ni nye GIC linjer (afledt i et uafhængigt laboratorium) blev sammenlignet med Ca

2+ følsomhed data fra eksponering for thapsigargin (72 timer eksponering) (fig. 5A og S2 Table). 7 ud af de 9 rækker er blevet vist at rekapitulere den forælder tumor (S3 tabel). Analyse af korrelation (Pearson) mellem NSC-markører og følsomhed til thapsigargin (1 uM) viste en signifikant sammenhæng for nestin (NES) (fig. 5B, outlier markeret med rødt blev udelukket fra analysen) og hjerne lipid-bindig protein (BLBP /FABP7) (fig. 5C) mRNA-ekspression, medens ingen korrelation blev fundet for SOX2 (data ikke vist). Western blot-analyse yderligere bekræftet, at calcium narkotika sensitive linjer (U3017-MG og U3084-MG) udtrykkes mere BLBP protein end mindre følsomme linjer (U3013-MG og U3035-MG) (fig. 5D). Korrelationen analyse bekræftede også en korrelation mellem følsomheden over for thapsigargin og GRIA1 ekspression (fig. 5E), som blev bekræftet ved analyse af protein-niveauer ved Western blot, som GRIA1 proteinekspression kun blev detekteret i de følsomme GICs (fig. 5F). Yderligere gen berigelse og gen ontologi analyser underforstået gener involveret i cellecyklusregulering, oxygen, RNA og makromolekyle metabolisme, og ikke uventet Ca

2 + medieret signalering som korrelering med Ca

2+ lægemiddelfølsomhed (fig. 6A) .

(A) Ni nye GIC linjer blev udsat for thapsigargin dosis-respons analyse (0,1-100 uM), som viser forskellige svar på moderate narkotika doser. (B, C) Plot af korrelation mellem cellelevedygtighed efter Ca

2+ eksponering lægemiddel (thapsigargin, 1 uM) og (B) NES og (C) FABP7 /BLBP mRNA-ekspression. U3047-MG blev betragtet som en outlier i NES grafen (markeret med rødt) og udelukkede formular analysen. (D) Western blot-analyse, der viser BLBP (FABP7) proteinekspression i udvalgte thapsigargin følsomme (U3017-MG og U3084-MG) og mindre følsomme (U3013-MG og U3035-MG) cellelinjer, med β-actin som ladningskontrol. (E) Plot af korrelation mellem cellelevedygtighed efter Ca

2+ eksponering lægemiddel (thapsigargin, 1 uM) og GRIA1 mRNA-ekspression. (F) Western blot-analyse viser GRIA1 proteinekspression i udvalgte thapsigargin følsomme (U3017-MG og U3084-MG) og mindre følsomme (U3013-MG og U3035-MG) cellelinier. β-actin blev anvendt som indlæsning kontrol.

(A) En korrelationsanalyse af genom-mRNA-ekspression (microarray analyse) og følsomhed over for thapsigargin (1 uM) i 9 yderligere GIC linjer, hentet 785 gener korrelerer med Ca

2+ lægemiddelfølsomhed. Gene berigelse og ontologi analyser identificeret inddragelse af gener, der påvirker spredning, ilt og RNA metabolisme, katabolisme og Ca

2 + medieret signalering. (B) 385 gener positivt korrelerer med høj følsomhed blev filtreret først efter gener udtrykte også højere i NSC-proksimale GIC line GliNS1 og derefter også nedreguleret i denne linje efter differentiering, som viste sig at reducere Ca

2+ lægemiddelfølsomhed , hente et sæt af ni gener, herunder AMPA-receptoren kodning GRIA1.

for at identificere gener i dette datasæt, der også er forbundet med en NSC-proksimal stemness signatur i GICs, sættet blev yderligere filtreret for gener, som også (1) havde en højere ekspression i GliNS1 sammenlignet med G166NS og (2) blev nedreguleret efter differentiering (fig. 6B). Dette hentet en kort liste over ni gener, hvoraf to koder for ionkanaler, der kan øge cytosole Ca

2+ (Ca

2 + provokers), dvs. GRIA1 og aktiv ensretter K

+ kanal KCNJ4 , som kan deltage i at opretholde en depolariseret membran potentiale kræves for at aktivere spænding-gated Ca

2 + kanaler og Ca

2 + permeable glutamatreceptorer. Sammenfattende viser overensstemmelsen mellem funktionelle Ca

2+ narkotika følsomhed og genekspression tyder deltagelse mod følsomhed over for narkotika-fremkaldt Ca

2+ overbelastning, af et netværk af gener involveret i at opretholde Ca

2+ homøostase og membranpotentialet.

Drug reactome analyse identificerer Ca

2 + induceret genekspression i den globale transkriptom

for at identificere intracellulære reaktioner på Ca

2+ ligger til grund for forskellen niveau af Ca

2+ følsomhed i GICs blev NSC-proksimale GliNS1 og NSC-distale G166NS udsat for A23187 i 7 timer, efterfulgt af transkriptom analyse ved RNA-sekventering ( “lægemiddel reactome mapping”) (S4 tabel). I de mest Ca

2+ stof følsom GIC linje GliNS1, gener med væsentligt ændret udtryk (Benjamini justerede p-værdi 0,05) blev analyseret ved gen-berigelse og gen-ontologi, som viste, at cellecyklus relaterede gener blev ændret (fig . 7B og S2 fig.), hvilket tyder cellecyklusstop før celledød. Ikke uventet, gener involveret i ER stress respons blev også beriget, som var gener i RNA metaboliske processer. Interessant RNA metaboliske proces involverede gener blev også korrelerer med thapsigargin følsomhed i det foregående eksperiment (fig. 6A).

Transkriptionel reaktion på øget cytosolisk Ca

2+ (A23187), blev undersøgt ved RNA-sekventering efter 7 timers drug eksponering i NSC-proksimale GIC linje GliiNS1 og NSC-distale linje G166NS. Volcano plots af signifikant (p 0,05) ændrede genekspression i GliNS1 (A) og G166NS (C) med fælles inducerede gener markeret med rød og grøn (Ca

2+ aktiveret transkriptionsfaktor NFATC2). Bemærk forskellene i x-aksen angiver højere al global induktion af genekspression i GliNS1. (B) Gene berigelse og gen ontologi analyse af gener med en betydelig ændring i ekspression (p 0,05) i GliNS1, identificerede gener involveret i cellecyklusprogression samt ER /Golgi forbundet funktioner og cellulære stressreaktion. (D) Gene berigelse analyse af gener nedreguleret mindst 3 gange i GliNS1 og opreguleres mindst 1,5 gange i G166NS.

gener med ændret ekspression efter eksponering lægemiddel blev afbildet over middelværdien ekspression værdi (før