PLoS ONE: DNA-methylering Kombinationer i tilstødende Normal Colon Tissue Forudsige Cancer Gentagelse: Beviser fra et klinisk Kohorte

Abstrakte

Akkumulerende beviser har foreslået kravet om yderligere lagdeling af patienter i samme tumor scenen efter molekylære faktorer. Vi vurderer kombinationen af ​​kræft scenen og DNA-methylering status som indikator for risikoen for tilbagefald og mortalitet blandt patienter med colorectal cancer (CRC). En kohorteundersøgelse af 215 patienter med CRC (gennemsnitsalder 64,32 år 50,5% af mændene) fra Tri-service General Hospital i Taiwan undersøgte sammenhængen mellem kræft scene og risikoen for CRC tilbagefald og dødelighed. En Cox proportional hazard model blev brugt til at analysere patientens methylering status og kliniske oplysninger ved undersøgelsens start, og deres foreninger med CRC tilbagefald og dødelighed under opfølgning. patienter fremskredent stadium med

p16

,

hMLH1

, og

MGMT

methylering var forbundet med højere risiko for CRC tilbagefald sammenlignet med de lokale patienter scenen med unmethylation status i tumorvæv , med justerede hazard ratio (HRS) (95% konfidensinterval [CI]) på 9,64 (2,92 til 31,81), 8,29 (3.40-20.22) og 11,83 (3,49-40,12), hhv. Ved analyse af normale væv, vi observerede lignende risiko for CRC tilbagefald med justerede HRs (95% CI) af 10,85 (4,06-28,96), 9,04 (3,79-21,54), og 12,61 (4,90-32,44), hhv. For kombinerede analyser, at risikoen for tilbagefald hos patienter i fremskredent stadium med DNA methylering i både normale og tumorvæv, sammenlignet med den lokale scene med unmethylation, blev forøget med justerede HR (95% CI) af 9,37 (3,36 til 26,09). I de avancerede stadie patienter blev methylering status og væv undertype forbundet med øget risiko for 5-års kumulativ CRC recidiv (

s

0,001). Denne undersøgelse viser, at klyngedannelse DNA methylering status i henhold til kræft scenen og væv undertype er afgørende for vurderingen af ​​risikoen for recidiv i CRC patienterne og også indikeret en underliggende mekanisme

Henvisning:. Kuan JC, Wu CC, Sun CA , Chu CM, Lin FG, Hsu CH, et al. (2015) DNA-methylering Kombinationer i tilstødende Normal Colon Tissue Forudsige Cancer Gentagelse: Beviser fra et klinisk Kohorte. PLoS ONE 10 (3): e0123396. doi: 10,1371 /journal.pone.0123396

Academic Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPAN

Modtaget: 7. oktober, 2014 Accepteret: 18 februar 2015; Udgivet: Marts 27, 2015

Copyright: © 2015 Kuan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data har været deponeret til Dryaden: doi:. 10,5061 /dryad.pg126

Finansiering: Denne undersøgelse blev støttet af forskningsbevillinger fra National Science Council, Kina (NSC 98-2314-B016-001, NSC 99-2314 -B016-020, NSC 100-2314-B016-025, og NSC 101-2314-B-016-029). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en af ​​de mest almindelige kræftformer, med over 140000 nye tilfælde og 50,830 dødsfald skønnes at have fundet sted i USA i 2013 [1]. Selv om forekomst og dødelighed af CRC er faldet betydeligt i de senere år på grund af væsentlige forbedringer i screening og behandlingsstrategier, prognosen for CRC patienter efter kirurgisk resektion forbliver fattige [2].

De nuværende retningslinjer for vurdering af prognosen for CRC patienter understrege klassificeringen af ​​de enkelte tumor-node-metastase elementer [3]. Imidlertid har akkumulerende beviser foreslået kravet om yderligere stratifikation af patienterne i den samme tumor fase ifølge molekylære faktorer [4]. Desuden kunne de molekylære faktorer, som omfatter biomarkører for flere kræftformer, har potentiel klinisk værdi til at forudsige cancerudvikling og progression, og forudsige prognosen for kræftpatienter [5,6].

CRC er anerkendt som en konsekvens for ophobning af genetiske (genmutationer) og epigenetiske ændringer (afvigende DNA-methylering), der omdanner colon epitelceller i colon adenocarcinomceller [7]. Epigenetisk modifikation, der involverer DNA og histon modifikationer, spiller en kritisk rolle i carcinogenese veje i flere kræftformer. Tidligere undersøgelser har vist, at den hyppigste afvigende epigenetisk modifikation i cancer, DNA-methylering, mindsker effektiviteten af ​​RNA-transkription af tumorsuppressorgener [8,9]. Nylig undersøgelse har konkluderet, at flere gen promoter methyleringer resulterer i transkriptionel lyddæmpning, og kunne udnyttes som biomarkører for tidlig påvisning af CRC [10]. Tumorprogression i CRC er forårsaget af tab af funktion i celle-cyklus regulering og DNA uoverensstemmende reparation (MMR), som er relateret til DNA-methylering af transkriptionsstartsitet [11]. Tidligere undersøgelser har identificeret de DNA-methylering-relaterede gener associeret med carcinogenese veje under anvendelse gendæmpning [12,13]. Men disse undersøgelser ikke analysere DNA methylering status og kliniske fase for opfølgning af patienter med CRC.

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere kombinationen af ​​kræft scenen og status DNA-methylering som en indikator for risikoen for tilbagefald og mortalitet blandt patienter med CRC. Vi undersøgte også sammenhængen mellem risikofaktorer for og prognose af CRC, efter stratificering efter kolon væv undertyper.

Materialer og Metoder

Patient karakteristika

Ifølge det skriftlige operationelle procedurer, god klinisk praksis (GCP), og de gældende lovkrav, blev denne ansøgning godkendt af Tri-service General Hospital Institutional Review Board (IRB) (TSGHIRB godkendelsesnummer: 098-05-292). Bestyrelsen blev organiseret under, og opererer pr Internationale Konference om Harmonisering (ICH) /WHO GCP og gældende love og regler. Alle patienter underskrevet informeret samtykke brev og var klinisk diagnosticeret med CRC skulle være i stand til at tolerere kirurgisk resektion. Patient karakteristika (køn, alder ved operation, scene, gentagelse, og dødelighed) blev opnået fra deres medicinske historie. Par af prøver blev indsamlet fra de 215 CRC patienter (430 prøver) som opfyldte inklusionskriterierne. Prøveopsamling blev udført ved kirurgiske klinikker, i hvilke tumorvæv og normalt væv blev reseceret samtidig. De tilstødende normale vævsprøver blev indsamlet fra et snit 10 cm væk fra carcinom sites. Alle prøver blev øjeblikkeligt opbevaret i flydende nitrogen. Proceduren for resektion blev gennemgået af Institut for kolorektal kirurgi, Tri-service General Hospital.

DNA isolation og natriumbisulfit behandling

Genomisk DNA blev ekstraheret fra vævsprøver ved hjælp af en MagCore Automated Nucleic Acid Extractor (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan) og en Genomisk DNA Tissue Kit ifølge producentens protokol. Det resulterende DNA var natriumbisulfit-modificeret under anvendelse af en EZ DNA-methylering Kit (Zymo Research, Orange, USA). En methyleret DNA kontrol for methyleringsspecifik polymerasekædereaktion (MS-PCR) assays blev genereret under anvendelse SSSI methylase (Zymo Research, Orange, USA).

Methylering-specifik PCR assay

Selected 3 tumorsuppressorgener (

p16

,

hMLH1

, og

MGMT

) er relateret til risikoen for CRC, som er involveret i de veje, der er forbundet med kræft stadier og prognose, herunder MFR og cellecyklussen [14]. Betingelser for DAN bisulfit-behandling og methylering-specifik PCR assay blev leveret i S1 Metoder, og kvalitetskontrol af analysen blev give i S1 Fig.

Statistisk analyse

Patient baseline karakteristika, herunder sex , alder ved operation (kontinuerlig), fase (i, II, III og IV), gentagelse, dødelighed status, og status genpromotorregion methylering i kandidatgener (

p16

,

hMLH1

og

MGMT

), blev sammenlignet. For at vurdere de mulige interaktioner mellem DNA methylering og klinisk fase, og risikoen for CRC tilbagefald og dødelighed blev patienterne af forskellige cancer stadier evalueret separat og også opdelt i 2 undergrupper (lokale og avancerede). Tumorvæv blev sammenlignet med tilstødende normale væv. Flere faktorer kan have bidraget til forskellene mellem vores resultater og de andre studier. Forstyrrende faktorer justering er detaljeret beskrevet i S1 Methods. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS software (IBM SPSS Statistics 21, Asia Analytics Taiwan Ltd., Taipei, Taiwan). Alle statistiske test blev 2-sidet med et α-niveau på 0,05.

Resultater

Den gennemsnitlige alder (± SD) af undersøgelsens patienter var 64,32 (± 14.48) år, og mænd udgjorde 50,5 % af undersøgelsen prøven. Samlet set var den gennemsnitlige varighed (± SD) af opfølgning var 24,94 (± 17.90) måneder. I løbet af de 5.363 person-måneders opfølgning, vi identificeret 85 tilfælde af CRC tilbagefald og 43 dødsfald, med en incidens massefylde på 15,85 og 8,02 pr 1000 personår måneder. Sammenhængen mellem kliniske fase og risikoen for CRC tilbagefald og dødelighed er give i S1 Resultater.

Tabel 1 viser de grundlæggende karakteristika ved de patienter i henhold til deres status DNA-methylering. Ved analyse normale væv, observerede vi, at patienter med status højere methylering af tumorsuppressorgener væsentligt var forbundet med en højere andel af CRC tilbagefald end patienter med lavere status for methylering var (55,3% versus 37,7%,

s

= 0,012). Denne forening var borderline signifikant i tumorvæv (84,7% vs. 73,1%,

s

= 0,065). Vi undersøgte yderligere sammenhængen mellem kræft scene og risiko for CRC tilbagefald, stratificering efter status målgenet methylering i vævet undertyper efter justeret for køn, alder ved operation, og adjuverende kemoterapi (tabel 2). Ved analyse af tumorvæv, vi observeret, at de avancerede stadie patienter med

p16

,

hMLH1

, og

MGMT

methylering var forbundet med højere risiko for CRC recidiv sammenlignet med den lokale patienter scenen med unmethylation status, med justerede HRs (95% CI) af 9,64 (2,92-31,81), 8,29 (3,40-20,22), og 11,83 (3,49-40,12), hhv. Ved analyse af normale væv, vi observerede lignende risiko for CRC tilbagefald i de avancerede patienter stadie med

p16

,

hMLH1

, og

MGMT

methylering sammenlignet med de lokale patienter fase med unmethylation status, med justerede HRs (95% CI) af 10,85 (4,06-28,96), 9,04 (3,79-21,54), og 12,61 (4,90-32,44), hhv. Desuden er en Kaplan-Meier analyse med log-rank test viste betydningen af ​​sammenhængen mellem kræft scene og DNA-methylering status i tilstødende normale væv, og den 5-årige kumulative gentagelse af CRC (

s

0,001 ;. figur 1); en Cox regressionsmodel bekræftede konsekvent risiko efter justeret potentielle forstyrrende faktorer, såsom køn, alder, tumor placering, adjuverende kemoterapi, og klinisk fase (

s

0,001)

Den kumulative. gentagelse satser var signifikant forskellig i de 4 undergrupper i de 5-års opfølgning efter justeret for køn, alder ved kirurgi, tumor placering, adjuverende kemoterapi, og klinisk fase. Vejviser

Som vist i tabel 3, vi efterfølgende analyseret DNA methylering status og CRC tilbagefald i undersøgelsen patienter, stratificering efter kræft etape (lokal og avanceret) og væv undertype (normal og tumor). Vi observerede, at risikoen for CRC tilbagefald var signifikant associeret med methylering status hos patienter i de forskellige kræft etaper, og i de 2 væv undertyper, efter justering for køn og alder ved kirurgi (

s

0,001) . Patienterne lokale stadie blev ikke væsentligt, associeret med øget risiko for CRC tilbagefald, uanset status for methylering og væv subtype. I de avancerede stadie patienter blev methylering status og væv undertype forbundet med øget risiko for CRC tilbagefald.

Diskussion

Vores resultater viste, at DNA-methylering af visse gener og kliniske fase var forbundet med risiko for CRC tilbagefald i vores undersøgelse patienter. Vi observerede, at DNA methylering status i de 3 målgener og kræft fase var signifikant associeret med CRC tilbagefald i tumor og normale væv. Når vi grupperet genet methylering statusser efter kræft scenen og væv undertype, observerede vi yderligere stigninger i risikoen for CRC tilbagefald. Disse resultater antydede, at den kliniske kræft scene og DNA methylering status potentielt kan evalueres som indikatorer for risikoen for CRC tilbagefald.

Tidligere undersøgelser på samme måde observeret en sammenhæng mellem korte tilbagefald overlevelse og DNA methylering i CRC patienter [15 -17]. Zitt et al sammenlignet forskellige screeningstest for CRC, og rapporterede, at DNA-methylering giver en klinisk anvendelig indikator for tidlig påvisning af sygdomsprogression hos patienter med CRC, som potentielt kunne forbedre patientens overlevelse og livskvalitet [15]. Kim et al rapporterede, at DNA-methylering af flere promotorer kunne give en biomarkør til tidlig påvisning af CRC, og at DNA methyleringsmønstre kunne også anvendes som indikatorer for metastatisk eller aggressiv CRC [16]. De data fra en klinisk opfølgning undersøgelse viste, at methylering af specifikke gener er forbundet med dårlig overlevelse i avancerede CRC patienter [17]. Et stort opfølgende undersøgelse på 61 494 asiatiske og kaukasiske patienter med CRC viste, at satserne for overlevelse var signifikant højere hos patienter af filippinske og kinesiske etnicitet end i andre patienter [18]. Ikke desto mindre er vores resultater fra en kinesisk befolkning var uændret i forhold til de beskrevne undersøgelser og studiet havde lignende resultater med The Cancer Genome Atlas [19].

Afvigelser i methylering af makromolekyler, især DNA, samt forstyrrelse i DNA-syntese og reparation, anses for at spille vigtige roller i carcinogenese [20]. DNA-methylering er den mest ekstensivt undersøgte epigenetiske forandring [21], og kan give en ny generation af cancere. Epigenetiske modifikationer, især methylering af DNA i udvalgte genpromotorer, er almindelige molekylære niveau ændringer i humane tumorer [16]. I denne undersøgelse har vi observeret, at methylering af visse gener blev forbundet med en markant øget risiko for CRC tilbagefald. Brock et al identificeret methylering af

p16

CDH13

i tumorform og mediastinale lymfeknuder, estimering odds ratio (OR) for CRC tilbagefald som 8,00 (95% CI, 2,50-25,51) og 4,32 (95% CI, 1,61 til 185,02), hhv. Da de evaluerede samlet methylering i tumorform og mediastinale lymfeknuder, OR for CRC tilbagefald var 15,5 (1,61 til 185,02) [22]. Vores resultater på samme måde demonstreret øget risiko for CRC tilbagefald når stratificering DNA methylering status i henhold til den kliniske kræft scenen og væv undertype.

Generne evalueret i denne undersøgelse,

p16

,

hMLH1

og

MGMT

, er involveret i celle-cyklus regulering og DNA MMR. Aberrant promotor methylering af tumorsuppressorgener kan føre til nedreguleret transkriptionel ekspression og proteinekspression i epitelceller [23]. MFR og celle-cyklus kontrol både spiller afgørende roller i sletning af mononukleotid gentagelser, og tab af reparation system er en af ​​de vigtigste mekanismer, der er involveret i ophobning af funktionel-change onkogene virkninger, herunder CRC udvikling [24]. DNA methylering ændringer udgør den histologiske heterogenitet og klinisk-patologisk mangfoldighed af humane cancere. Overekspression af DNA methyltransferase 1 er ikke et sekundært resultat af øget celleproliferative aktivitet, men er signifikant korreleret med akkumuleret DNA hypermethylering i CpG-øer af tumor-relaterede gener [25]. Sammenhængen mellem DNA-methylering og cancer etape kan være afhængig af interleukin 6, en kronisk betændelse markør, der forbedrer hypermethyleringen af ​​tumorsuppressorgen

p53

familier, men reducerer methylering af den epidermale vækstfaktor receptor [26]. Kronisk betændelse anses for at være forårsaget af betændelse-medieret cytosin skader, og produkterne af sådanne skader kan give en mekanistisk sammenhæng mellem betændelse og kræft [27], og fremme afvigende methylering i humane kræftformer. Inflammatorisk reaktion mediatorer, såsom cytokiner, frie radikaler og vækstfaktorer, inducerer epigenetiske ændringer i tumorsuppressorgener. Observationer af sådanne ændringer har yderligere styrket sammenhængen mellem betændelse og kræft [28].

Derfor er risikoen for dårlig prognose stigninger i de avancerede kliniske stadier af kræft, når patienter først diagnosticeret, selv efter kirurgisk resektion. Vores resultater var i overensstemmelse med de tilhørende undersøgelser forbinder lymfe og fjernmetastaser med dårlig prognose [29,30]. De fremskredne stadier af CRC er forbundet med højere risiko for dårlig prognose sammenlignet med lokal scene CRC. Desuden en klinisk undersøgelse af lungekræft viste, at når strategier er på plads for at fremskynde behandlingen af ​​personer, der mistænkes for at have kræft, at sygdommen typisk skifter retning et tidligere tidspunkt og resektion satser stigning [31]. Tidligere undersøgelser har identificeret, at afvigende promotor hypermethylering af cancerrelaterede gener kan være potentielt anvendelige som epigenetiske markører til forudsigelse resultatet af kræftbehandling [32,33]. I den anden undersøgelse fra 22 ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) patienter med Esteller et al., 68% af de patienter, der viser hypermethylering i tumor DNA også påvist i serum DNA tværs etaper, som fandt sted med al etape fra I til IIIA [ ,,,0],33]. To undersøgelser viste, at aberrerende DNA-methylering er forbundet med cancer prognose, selv i forskellige kliniske faser. En anden undersøgelse viste genpromotor methylering er forbundet med tidlig fornyet trin I NSCLC [22]. Derudover andelene af methylering var hovedsagelig lavere i normale væv end i tumorvæv i tabel 1, men risikoen for tilbagefald var ens i disse to typer af væv. Resultaterne viser, at når først DNA-methylering blev påvist i avancerede patienter, ville risikoen for recidiv øges kraftigt. Tidligere undersøgelse har vist den mekanisme af denne øgede risiko fra ændringerne i molekylære niveau. Sato et al. har rapporteret DNA-methylering af ikke-cancerøse væv fra patienter med lunge-adenocarcinomer var på præcancerøse stadier med afvigende methylering af DNA over flere gener [34]. DNA methylering ændringer på forstadier stadier styrkes i normale væv under progression til udviklede lunge adenocarcinom. Der er bestod med vores resultater, at de molekylære ændringer ikke vil blive fundet af patologisk undersøgelse, men de DNA methylering ændringer er forekommet i tilstødende normale væv fra læsionerne. Derfor DNA methylering ændringer i normale væv fører til en dårlig prognose end i cancervæv. status Gene methylering i en uafhængig validering kohorte blev gennemført med betydeligt højere odds ratio for fornyet blandt case patienter, typisk steget med forskellige steder i denatureret afsløring, såsom tumor, regionale knudepunkter, mediastinum noder og tumor og mediastinale noder. Yderligere undersøgelser af patientens kliniske oplysninger, såsom blod biokemiske data eller medicin historie, med lagdeling til at identificere højrisikogrupper af CRC tilbagefald, er påkrævet.

De styrker og begrænsninger af vores undersøgelse warrant diskussion. I denne undersøgelse evaluerede vi opfølgende data om DNA methylering og kræft scene som indikatorer for risiko for CRC tilbagefald efter væv undertype. Vi udførte vores evalueringer ved hjælp af molekylære biomarkører og kliniske oplysninger. Vores resultater kunne give læger med en klinisk reference for prognosen for CRC patienter efter kirurgi. Det er dog tænkeligt, at længere tid af opfølgning kan have større forskelle i denne undersøgelse. Ikke desto mindre viste tidligere undersøgelser den korte median opfølgning efter kirurgisk behandling blandt CRC patienter under 2 år opfølgende perioder, som præsenteres signifikante forskelle i forekomsten af ​​tilbagefald [35,36]. For det andet har vi ikke vurdere inflammatoriske reaktioner eller betændelse-relaterede biomarkører i CRC patienter. Kanai et al. identificeret, at kronisk betændelse kan påvirke prognosen for CRC patienter [25]. Vi kunne ikke vurdere denne forening. Selv semikvantitativ MSP blev anvendt i denne undersøgelse, kvantitative MPS såsom, bør udføres pyro-sekventering til yderligere undersøgelse. Desuden har genekspression ikke vurdere i denne undersøgelse på grund af de frosne væv gemt i tumoren bank, det totale RNA-niveau i prøven var utilstrækkelig til eksperiment af genekspression. Replication blev ikke udført i denne undersøgelse.

Som konklusion, denne undersøgelse viser, at clustering DNA methylering status i henhold til kræft scenen og væv undertype er afgørende for vurderingen af ​​risikoen for recidiv i CRC patienter. Undersøgelsens resultater tydede også en underliggende mekanisme til øget risiko for tilbagefald i CRC patienter, især i nontumorous væv.

Støtte oplysninger

S1 Metoder. Methyleringsspecifik PCR tilstand.

Bisulfit behandlede DNA blev underkastet en MS-PCR under anvendelse primerpar udformet til specifikt at amplificere målgenerne. Reaktionsopløsningen (15 pi) indeholdt HotStart Taq Premix (7,5 pi) (RBC Bioscience, Taipei, Taiwan), bisulfit-behandlede DNA (0,6 pi), og 0,6-pi alikvoter af forward og reverse primere. Primersekvenserne for

p16

,

hMLH1

, og

MGMT

er blevet beskrevet tidligere. [14] Polymerase kædereaktion (PCR) cykling betingelser for methylerede og umethylerede primere involverede denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 35 cykler ved 95 ° C i 30 sekunder, annealing ved 62 ° C, 60 ° C, og 53 ° C i 35 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder, og en endelig ekstension ved 72 ° C i 4 minutter. PCR-produkterne blev blandet med en DNA-farvestof (bioman, Taipei, Taiwan), underkastes horisontal gelelektroforese på en 2% agarosegel i 25 minutter, og farvet med ethidiumbromid i 10 minutter. Resultaterne blev analyseret under ultraviolet (UV) gennemlysning som blev vist i S1 Fig. Statistiske metoder. I denne undersøgelse blev patienter klassificeret i henhold til methylering af 3 målgener. De primære effektmål var CRC tilbagefald og dødelighed. De personår års opfølgning blev brugt til at beregne CRC tilbagefald og dødelighed, der starter på datoen for kirurgisk resektion og fortsatte frem til datoen for diagnosen CRC tilbagefald, dødsdato, eller 31. december 2012. A Kaplan Meier analyse og en Cox proportional hazard model blev brugt til at analysere patientens methylering status og kliniske oplysninger ved undersøgelsens start, og deres sammenslutninger med CRC tilbagefald eller dødelighed under opfølgning, efter justering for potentielle forstyrrende kovariater. De justerede hazard ratio (HRS) og intervaller 95% sikkerhedsgrænser (CIS) blev beregnet til at evaluere methylering status som indikator for risiko for CRC tilbagefald. De potentielle forstyrrende variabler i modellen var køn, alder ved kirurgi (behandlet som en kontinuerlig variabel), tumor placering, og adjuverende kemoterapi. De justerede HRs blev derefter beregnet for hver kategori. Foreningerne mellem DNA methylering status og risiko for CRC tilbagefald og dødelighed blev yderligere vurderet ved hjælp af analyser stratificeret efter baseline klinisk cancer stadie (I-IV). For at teste en lineær trend på tværs af kliniske kræft stadier og methylering statusser i undertyper af væv, blev forekomsten af ​​CRC tilbagefald i hver kategori bruges som en kontinuerlig variabel i en multivariable model

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123396 .s001

(DOCX)

S1 fig. Agarose gel var repræsenteret

P16

gen promoter methylerede eller umethyleret status CRC patienter

T:. Tumorvæv; N: normal væv; MR: markør for henvisning af PCR-produkt størrelse; U: unmethylation; M: methylering. For kvaliteten af ​​methylering-specifik PCR, blev eksperimentelle kontroller præsenteret af WBC fra raske mennesker, og to humane colorektale adenocarcinom cellelinier (HT29 og DLD1). Vand var for negativ kontrol for dette eksperiment

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123396.s002

(TIF)

S1 Resultater. Vores resultater af sammenhængen mellem de forskellige kræft stadier og CRC tilbagefald og dødelighed blev observeret en signifikant trinvis stigning i CRC tilbagefald og dødelighed blandt scenen I-IV patienter (

s

0,001).

fase III og IV patienter var forbundet med signifikant højere risiko for CRC tilbagefald i forhold til trin i patienter, med justerede HRs (95% CI) af 19,37 (2,59 til 145,05) og 56,36 (7,42 til 428,09), hhv. De IV patienter stadie var forbundet med betydeligt højere risiko for dødelighed i forhold til trin I patienter, med en justeret HR (95% CI) af 5,76 (1,99 til 16,61). Vi omfattede trin I og II patienter i den lokale scene undergruppe, og scenen III og IV patienter i fremskredent stadium undergruppe. Patienterne i fremskredent stadium undergruppe var forbundet med højere risiko for CRC tilbagefald og mortalitet sammenlignet med patienterne i den lokale fase undergruppe, med justerede HRs (95% CI) af 6,73 (3,56 til 12,71) og 1,75 (0,94-3,28), henholdsvis

doi:. 10,1371 /journal.pone.0123396.s003

(DOCX)