PLoS ONE: Ny pyrazolopyrimidinhypnotikum Inhibitors af protein kinase D som Potente anticancermidler for prostatakræft Cells

Abstrakt

Fremkomsten af ​​protein kinase D (PKD) som en potentiel terapeutisk mål for en række sygdomme, herunder kræft har udløst søg potente, selektive, og celle-permeable småmolekylære inhibitorer. I denne undersøgelse beskriver vi identificering,

in vitro

karakterisering, struktur-aktivitetsanalyse, og biologisk evaluering af en ny PKD inhiberende stillads eksemplificeret ved 1-naphthyl PP1 (1-NA-PP1). 1-NA-PP1 og IKK-16 blev identificeret som pan-PKD inhibitorer i en mindre målrettet kinase inhibitor bibliotek assay. Begge screening hits hæmmede PKD isoformer ved ca. 100 nm og var ATP-kompetitive hæmmere. Analyse af flere relaterede kinaser indikerede, at 1-NA-PP1 var stærkt selektiv for PKD sammenlignet med IKK-16. SAR-analyse viste, at 1-NA-PP1 var betydeligt mere potent og viste distinkte substituentgrupper virkninger på det pyrazolopyrimidin kerne. 1-NA-PP1 var celle-aktiv, og potent blokeret prostatakræft celledeling ved at inducere G2 /M anholdelse. Det er også kraftigt blokeret migration og invasion af prostata kræftceller, viser lovende anticancer aktiviteter på flere fronter. Overekspression af pKD1 eller PKD3 næsten fuldstændig vendt vækststandsning og inhiberingen af ​​tumorcelleinvasion forårsaget af 1-NA-PP1, hvilket indikerer, at dens antiproliferative og anti-invasive aktiviteter blev medieret gennem inhibering af PKD. Interessant nok kunne en 12-fold stigning i følsomheden over for 1-NA-PP1 opnås ved manipulere en gatekeeper mutation i det aktive sted i pKD1, hvilket antyder, at 1-NA-PP1 kunne parres med analog-sensitive pKD1

M659G til dissekere PKD-specifikke funktioner og signalveje i forskellige biologiske systemer

Henvisning:. Tandon M, Johnson J, Li Z, Xu S, Wipf P, Wang QJ (2013) New pyrazolopyrimidinhypnotikum hæmmere af protein kinase D som potente anticancermidler for prostatakræft celler. PLoS ONE 8 (9): e75601. doi: 10,1371 /journal.pone.0075601

Redaktør: Makoto Kanzaki, Tohoku Universitet, Japan

Modtaget: Januar 30, 2013; Accepteret: August 18, 2013; Udgivet: 23 september, 2013 |

Copyright: © 2013 Tandon et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Institutes of Health (R01CA129127-01, R01CA142580-01, og P50-GM067082). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Det medforfatter Qiming Jane Wang er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Efter opdagelsen af ​​Gleevec, blev det åbenlyse, at meget potent og specifik lille molekyle inhibitorer af kinaser udviser bemærkelsesværdig klinisk effektivitet og reduceret toksicitet [1]. Proteinkinaser er vigtige regulatorer af signaltransduktionsveje og derfor attraktive terapeutiske mål for mange sygdomme. Serin /threoninproteinkinase D (PKD) familie udgør et særskilt gruppe af calcium /calmodulin-afhængige proteinkinaser (CaMK) [2], [3]. De tre kendte isoformer af PKD (pKD1, PKD2 og PKD3) spiller en vigtig rolle i flere grundlæggende cellulære processer, herunder celleproliferation, overlevelse, migration, genregulering, protein menneskehandel, og immunrespons [4], [5]. Især har pKD1 været impliceret i mange aspekter af tumorudvikling, såsom tumorvækst, metastase, og angiogenese [4]. Afvigende PKD aktivitet og ekspression er blevet rapporteret i forskellige tumorcellelinjer og tumorvæv fra bugspytkirtlen [5], hud [6], [7] og prostata [8], [9]. PKD medierer store signalveje, der er afgørende for udvikling af kræft, herunder VEGF og MEK /ERK signalveje [4], understøtter en aktiv rolle PKD i tumor-associerede biologiske processer i forskellige typer kræft [5], [7], [ ,,,0],9] – [12].

PKD er en vigtig signalering komponent af diacylglycerol (DAG) signalering netværk. Det er et primært mål for DAG og en nedstrøms effektor af protein kinase C (PKC). Der er flere konserverede strukturelle motiver i PKD, såsom en C1-domæne, der binder DAG og modulerer PKD lokalisering, og en PH-domæne, som udøver en autoinhibitory funktion på kinasedomænet. I intakte celler, er PKD direkte phosphoryleret af DAG-responsive PKC’er på de to konserverede serinrester i aktiveringssløjfen af ​​det katalytiske domæne, som fører til dens aktivering. PKD ofte udviser vedvarende aktivitet ved aktivering som hovedsageligt opretholdes gennem autophosphorylering [5].

I de sidste mange år, er der sket betydelige fremskridt i udviklingen af ​​potente og specifikke lille molekyle PKD-hæmmere. CID755673 og analoger [13], [14], 2,6-naphthyridin- og bipyridyl inhibitorer og deres analoger [15] – [17], 3,5-diarylazoles [18], CRT0066101 [19], og CRT5 [20] viste, målrettet hæmning af PKD

in vitro

i intakte celler. Især blev CRT0066101 fundet at kraftigt blokere væksten af ​​pancreas-tumorxenotransplantater

in vivo

i mus [19]. På trods af disse betydelige fremskridt, ingen PKD-undertype specifik inhibitor er til rådighed, og PKD-hæmmere har endnu ikke videre til klinikken. I del, kan fraværet af kliniske kandidater tilskrives den begrænsede selektivitet,

in vivo

stabilitet og generelle toksicitet problemer med de nuværende kendte inhibitorer. Derfor er det bydende nødvendigt at fortsætte søgningen efter nye PKD hæmmende chemotypes der demonstrerer attraktivt mål selektivitet, forbedrede farmakokinetiske profiler, og større

in vivo

effektivitet.

Vi har tidligere identificeret både ATP-konkurrence og -noncompetitive PKD inhibitorer, som er forskellige i struktur til andre rapporterede inhibitorer [13], [14], [21] – [23]. Disse hits blev identificeret i en HTS-kampagne ved hjælp af store, upartiske småmolekylebiblioteker. Efterfølgende blev medicinalkemiske strategier anvendes til at optimere aktiviteten, selektiviteten og fysisk-kemiske egenskaber af en hovedstruktur, CID755673, hvilket resulterer i en serie af analoger, der viste forøget mål inhibering

in vitro

i celler, og forbedret metabolisk profiler [13], [14], [21] – [24]. Heri beskriver vi identificering og evaluering af en roman PKD hæmmende kemotype baseret på 1-naphthyl PP1 (1-NA-PP1), et pyrazolopyrimidinhypnotikum, der oprindeligt blev udviklet til analog-følsomme mutantkinase af src [25]. Denne inhibitor blev identificeret i en lille, målrettet bibliotek af forskellige kinase-inhibitorer. 1-NA-PP1 udviste fremragende selektivitet over PKD med ringe eller ingen inhibitorisk aktivitet for to beslægtede kinaser, CaMK eller PKC. Det hæmmede kraftigt den formering, migrering og invasion af prostatacancerceller. En efterfølgende SAR analyse viste vigtige strukturelle determinanter for dette føre sammensatte og placerer en-NA-PP1 som en ny og særskilt PKD inhibitor kemotype med potentiale til at give udvikling kandidater til

in vitro

in vivo

applikationer.

Resultater

Identifikation af nye PKD hæmmende stilladser fra en målrettet kinase inhibitor bibliotek

Firs kemisk forskellige kinase hæmmere blev udvalgt fra en Tocris Biosciences lille molekyle samling.

in vitro

pKD1 inhiberende aktivitet af disse forbindelser blev vurderet baseret på deres evne til at inhibere det rekombinante pKD1 protein ved 1 uM koncentration i en radiometrisk PKD kinaseassay. Den procentvise pKD1 inhibering blev beregnet som den procentvise inhibering af det samlede pKD1 kinase aktivitet i fravær af inhibitorer (DMSO). Seksten forbindelser blev identificeret som primære hits (≥50% inhibering af total pKD1 kinaseaktivitet) i radiometrisk pKD1 assay (Tabel 1). Blandt disse hits, 1-NA-PP1, en mutant src-kinase inhibitor og IKK-16, et IKB kinase inhibitor, undertrykt 77% og 67% af pKD1 aktivitet ved 1 uM, og blev udvalgt til yderligere karakterisering baseret på deres potens og tydelige strukturelle træk.

1-NA-PP1 og IKK-16 er nye pan-PKD hæmmere

in vitro

IC

50 af 1-NA-PP1 og IKK-16 blev bestemt i et 10-punkts koncentration kurve ved hjælp af en radiometrisk PKD kinase assay [13]. Rekombinant human pKD1, 2 eller 3 proteiner blev inkuberet i en blanding indeholdende et peptidsubstrat afledt af en PKD substrat, HDAC-5, og 10 forskellige koncentrationer af de to forbindelser. Som vist i fig. 1A, 1-NA-PP1 og IKK 16 inhiberede alle tre isoformer af PKD med næsten ens styrke. 1-NA-PP1 inhiberede pKD1, 2 og 3 med en IC

50 af 154,6 ± 21,8 nM (n = 3), 133,4 +/- 3,6 nM (n = 3), 109,4 +/- 6,8 nM (n = 3), hvorimod IKK-16 inhiberede ligeledes den PKD-isoformer med en IC

50 af 153,9 +/- 7,7 nM (n = 2) for pKD1, 115,0 +/- 7,1 nM (n = 2) for PKD2 og 99,7 +/- 3,0 nM (n = 2) for PKD3. Disse resultater indikerer, at både 1-NA-PP1 og IKK 16 er potente pan-PKD inhibitorer.

Inhibering af rekombinant human pKD1, 2 og 3, undersøgt i nærværelse af 10 forskellige koncentrationer af 1-NA-PP1 (A) og IKK-16 (B) af en

in vitro

radiometrisk PKD kinaseassay. IC

50-værdier blev beregnet som middelværdi ± SEM af mindst tre uafhængige forsøg med tredobbelte bestemmelser ved hver koncentration af lægemiddel i hvert forsøg. Dataene blev afbildet som en funktion af lægemiddelkoncentrationen og en repræsentant graf er vist.

1-NA-PP1 er en ATP-kompetitiv inhibitor med høj selektivitet for PKD løbet nært beslægtede kinaser

for at få en bedre forståelse af virkemåde for 1-NA-PP1 og IKK-16, vi undersøgt virkningerne af stigende koncentrationer af ATP på pKD1 hæmning. Lineweaver-Burk plots blev frembragt ved at plotte den reciprokke værdi af reaktionshastigheder (1 /v) mod den reciprokke værdi af ATP-koncentrationer (1 /[ATP]) på forskellige forbindelseskoncentrationer. Punkterne blev monteret ved lineær regression. Som vist fig. 2A-B, alle linjer konvergeret på Y-aksen, hvilket indikerer, at både 1-NA-PP1 og IKK-16 var ATP-kompetitive inhibitorer.

pKD1 kinase aktivitet blev målt som en funktion af stigende koncentrationer af ATP i nærvær af varierende koncentrationer af 1-NA-PP1 (A) og IKK-16 (B). Lineweaver-Burke afbildninger af data er vist. Data præsenteret var repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Næste, vi bestemt specificitet 1-NA-PP1 og IKK-16 for PKD ved at undersøge deres aktivitet i flere funktionelt eller strukturelt beslægtede kinaser, herunder PKCa , PKCδ og CAMKIIα. Ingen signifikante inhibitoriske aktiviteter for PKC-isoformer blev påvist ved 0,1, 1 og 10 uM koncentrationer på 1-NA-PP1, i modsætning til IKK-16, som viste en koncentrationsafhængig hæmning for både PKCa og PKCδ og 50% inhibering ved 10 uM koncentration (fig. 3A-B). Den potente PKC-hæmmer GF109203X blev testet som en positiv kontrol, og det potent og koncentration-afhængigt hæmmet PKCa og PKCδ. PKD tilhører en undergruppe af CaMK familie og kinaser i begge familier deler høj sekvenshomologi. Det fik os til at vurdere hæmning af CAMKIIα af disse forbindelser. Som illustreret i fig. 3C, 1-NA-PP1 viste lidt aktivitet på CAMKIIα op til 10 uM, mens IKK-16 forårsagede koncentrationsafhængig hæmning af enzymet og næsten fuldstændigt ophævede dets aktivitet ved 10 uM. Taget sammen indikerer disse data, at 1-NA-PP1 er en meget specifik inhibitor for PKD forhold til andre nært beslægtede kinaser, herunder PKC’er og CAMKs, mens IKK-16 er sandsynligvis en promiskuøs kinaseinhibitor.

Inhibering af PKCa (A) eller PKCδ (B) blev bestemt ved 10 nM, 100 nM, 1 uM, og 10 uM. Som kontroller, PKC inhibitor GF109203X hæmmede kraftigt PKCa og PKCδ aktivitet. Data er middelværdien ± SEM af to uafhængige forsøg. C. Inhibering af CAMKIIα blev målt ved radiometriske CaMK kinase assay. Eksperimentet blev gentaget to gange, og en repræsentativ graf er vist. Statistisk signifikans blev bestemt ved anvendelse af uparret t-test. ns, ikke statistisk signifikant; *,

s

0,05; **,

s

0,01; ***,

s

0,001

Yderligere indsigt i specificiteten af ​​1-NA-PP1 kunne opnås ved at evaluere kinome scannede data på en-naphthylmethyl PP1 (. 1-NM-PP1), hvor 1-NM-PP1, sammen med 178 kendte kinaseinhibitorer, blev profileret mod et panel af 300 rekombinante humane proteinkinaser ved en enkelt koncentration [26]. Like 1-NA-PP1, 1-NM-PP1 er også en C3-derivatiseret PP1 analog, der afviger fra 1-NA-PP1 af kun én methylgruppe forbinder pyrazolforbindelser og naphthyl ringe. Vores data viser, at en-NM-PP1 hæmmede pKD1 med en IC

50 af 138,7 ± 33,2 nM (n = 3) (fig. 3D), hvilket svarer til, at 1-NA-PP1 (154,6 nM). Deres inhiberende aktiviteter for størstedelen af ​​vildtype og muterede Src-familiekinaser også er sammenlignelige [27], hvilket indikerer, at de to inhibitorer er ikke kun samme struktur men også i biologisk aktivitet. Specificitetsbestemmelserne data for 1-NM-PP1 blev ekstraheret ved en afskæring på 50% resterende kinaseaktivitet under anvendelse af Kinase Inhibitor Resource (KIR) online værktøj (https://kir.fccc.edu/) som beskrevet (tabel S1) [26]. De data bekræftede inhiberingen af ​​PKD isoform af denne forbindelse. Selv blev identificeret yderligere mål 1-NM-PP1, denne inhibitor udstillet en relativ høj Gini score på 0,67 (en selektivitet score for kinaser og kinase hæmmere), hvilket indikerer højere selektivitet. I mellemtiden blev der ikke PKC-isoformer signifikant inhiberet af denne inhibitor ( 90% resterende kinase aktivitet for alle PKC isoformer). Baseret på dette og ovenstående resultater, vælger vi udelukkende at fokusere på en-NA-PP1 i vores efterfølgende undersøgelser.

Syntese og SAR-analyse af 1-NA-PP1-analoger

Målet med vores syntetiske studier var at ændre substituenterne i 1-NA-PP1 pyrazolo [3,4-

d

] pyrimidin kernestruktur og bestemme den biologiske reaktion på disse ændringer, samt til potentielt identificere mere PKD subtype selektive analoger. Vi overvejede 4 typer variationer, som vist i fig. 4, og forberedt alt 18 derivater, herunder resyntetiseres forælder, 1-NA-PP1.

A. 4-Zone model for en-NA-PP1 analog syntese. B. Syntese af en

H

pyrazolo [3,4-

d

] pyrimidiner 1.

Kun to variationer blev udforsket i zone 1,

t

butyl og methyl- (tabel 2). Ved en uM koncentration, 1-NA-PP1 hæmmede pKD1 aktivitet med 80%, mens dens R

1 = methyl analog kun 1f førte til en reduktion på 32% af aktiviteten. Alle andre analoger med en methylsubstituent i zone 1 og forskellige substitutioner i zonerne 2-4 klaret sig endnu værre og påvistes 10% hæmmende aktiviteter på 1 pM koncentrationer. Kravet om voluminøse grupper i R

1 i pyrazolopyrimidin er tidligere blevet anerkendt og synes at være et generelt træk for kinase inhibering med dette stillads [11]. Men selv når opretholde

t

butylgruppe i zone 1, variationer, såsom indførelse af en methylgruppe i zone 3 (1a), og udskiftninger af naphthyl substituenten med andre arylringe (1b-e ) poleres den pKD1 aktivitet. Følgelig vores begrænsede SAR fremhævet 1-NA-PP1 som den mest potente kongener med meget begrænset tolerance for strukturelle modifikationer af substituenter ved pyrazolopyrimidin kerne. Selv elektrofile derivater med en klor-gruppe i zone 4 og potentialet for irreversibel enzym alkylering (1j, 1k, 1m, 1p, 1r) ikke viser en stigning i styrke. En tilsvarende stejl nedgang i v-Src-tyrosinkinase inhiberende aktivitet af pyrazolopyrimidin-derivater er blevet bemærket tidligere, og er sandsynligvis relateret til en specifik hydrogenbinding i zone 2 og 3 i ATP-binding lomme, som ikke bør forstyrret [25]. Derfor fortsatte vi vores undersøgelse af inhibitor profil pyrazolopyrimidiner på PKD med den mest potente stof, 1-NA-PP1.

1-NA-PP1 er celle-aktiv og forårsager target hæmning i prostata kræftceller

i denne undersøgelse har vi undersøgt, om en-NA-PP1 var celle gennemtrængelig og i stand til target hæmning i intakte celler. Virkningen af ​​1-NA-PP1 den 12.-myristat-13-acetat (PMA) -inducerede endogen pKD1 aktivering i LNCaP-prostatacancerceller blev undersøgt som tidligere beskrevet [9], [23], [28]. PMA aktiverer PKD gennem PKC-afhængige trans-phosphorylering af Ser744 /748 (S

744/748) i aktivering loop efterfulgt af autophosphorylering af pKD1 på Ser916 (S

916) i C-terminalen [29], [30]. PKD1 aktivitet korrelerer godt med niveauet af phospho-S

916 (p- S

916) [30]. Vi har derfor brugt p-S

916 for at overvåge PKD aktivitet og p-S

744/748 af pKD1 at bestemme, om forbindelsen forstyrret PKC-induceret trans-phosphorylering ved eventuelt at inhibere PKC. Som vist i fig. 5, behandling af LNCaP-celler med 10 nM PMA i 20 minutter inducerede både p-S

916-pKD1 og p-S

744/748-pKD1 signaler. Forbehandling med stigende koncentration af 1-NA-PP1 koncentrationsafhængigt inhiberede autophosphorylering ved p-Ser

916-pKD1 med en IC

50 22,5 ± 1,5 pM (n = 2). I modsætning hertil PKC-afhængig trans-phosphorylering ved Ser

744/748 var upåvirket af 1-NA-PP1. Således 1-NA-PP1 specifikt ophævet pKD1 aktivitet uden at blokere PKC-medieret trans-phosphorylering.

A. LNCaP-celler blev forbehandlet med forskellige doser af inhibitorer i 45 minutter, efterfulgt af PMA-stimulering ved 10 nM i 20 minutter. Cellelysater blev underkastet immunoblotting for p-S

916-pKD1 og p-S

744/748-pKD1. Tubulin blev udslettet som lastning kontrol. Eksperimentet blev gentaget tre gange, og de repræsentative blots er vist. B. Bestemmelse af IC

50. Western blots blev kvantificeret under anvendelse af densitometrianalyse. Dataene blev afbildet og IC

50 værdier blev afledt koncentration-respons-kurver ved anvendelse af GraphPad. En af de tre koncentration-respons-kurver blev vist.

1-NA-PP1 potent blokerer prostatacancer celleproliferation ved at inducere G2 /M arrest

PKD har vist sig som et lovende terapeutisk målrette mod kræft. Her, blev virkningerne af målrettet hæmning af PKD ved 1-NA-PP1 på prostatacancer celleproliferation, overlevelse, og cellecyklusprogression undersøgt. Celleproliferation blev bestemt ved behandling af cellerne ved 30 uM koncentrationen af ​​midlet, og derefter celleantal blev talt i seks på hinanden følgende dage i nærvær og fravær af inhibitor. Væksten og cytotoksiske virkninger af 1-NA-PP1 blev evalueret ved celle nummer tæller og MTT-assay. Som vist i fig. 6A, 1-NA-PP1 ved 30 uM forårsagede drastisk vækststandsning af PC3-prostatacancerceller startende på dag 2 og varede til slutningen af ​​forsøget (dag 6). 1-NA-PP1 også koncentrationsafhængigt induceret celledød med en IC

50 af 23,3 ± 5,7 pM (n = 3) (fig. 6B). At give indsigt i virkningen af ​​1-NA-PP1 på celleproliferation, undersøgte vi konsekvensen af ​​1-NA-PP1 behandling på cellecyklusfordeling anvendelse af flowcytometri. Cellecyklusanalyse blev udført efter behandling PC3-celler med 30 uM af 1-NA-PP1 i 72 timer. Som vist i fig. 6C, 1-NA-PP1 signifikant forøgede andelen af ​​celler i G2 /M-fasen af ​​cellens cyklus, svarende til et skift fra 5,8% celler i G2 /M i kontrollen til 28,6% i 1-NA-PP1-behandlede celler, og hvilket antyder, at vækstinhibering forårsaget af 1-NA-PP1 skyldes dens evne til at inducere G2 /M arrest.

A.1-NA-PP1 blokeret PC3 celleproliferation. PC3-celler blev udpladet i tre eksemplarer på plader med 24 brønde. Celler lodes binde natten over. En celletælling på dag 1 blev fremstillet, og derefter enten en vehikel (DMSO) eller 1-NA-PP1 ved 10 uM blev tilsat. Celler blev talt dagligt i i alt 5 dage. Friske medier og inhibitor blev tilsat hver 2 dage. Midlerne til tredobbelte bestemmelser blev afbildet over tid. Eksperimentet blev gentaget to gange, og resultaterne fra et repræsentativt forsøg er vist. B. 1-NA-PP1 induceret celledød i PC3-celler. PC3-celler blev podet i plader med 96 brønde (3000 celler /brønd) og blev derefter inkuberet i medier indeholdende 0,3-100 uM inhibitorer i 72 timer. MTT-opløsning blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer. Optisk densitet blev aflæst ved 570 nm for at bestemme cellernes levedygtighed. IC

50 blev bestemt som gennemsnittet af to uafhængige forsøg for hver forbindelse. C. 1-NA-PP1 forårsagede G2 /M fase cellecyklusstop. PC3-celler blev behandlet med enten vehikel (DMSO), eller 10 uM 1-NA-PP1 i 48 timer. Cellecyklusfordeling blev bestemt ved flowcytometri efter propidiumiodid mærkning af fikserede celler. Statistisk signifikans blev bestemt ved uparret t-test og er angivet. **,

s

0,01; ***,

s

. 0,001

1-NA-PP1-indued vækststandsning er medieret gennem målrettet hæmning af PKD

For at sikre succes af en målrettet terapi, er det vigtigt at påvise mål-specificitet fra et biologisk synspunkt. Vores tidligere data viste, at de biologiske virkninger induceret af PKD inhibitorer phenocopied dem, der skyldes Knockdown PKD isoformer, hvilket indikerer, at virkningerne af inhibitorerne var medieret gennem målrettet hæmning af PKD [9], [23]. I denne undersøgelse fandt vi en mere direkte tilgang til at afgøre, om en målrettet hæmning af PKD udgør de biologiske virkninger af 1-NA-PP1. Specifikt fokus på anti-proliferative effekt af 1-NA-PP1, søgte vi at bestemme, om overekspression af pKD1 og PKD3 vha adenovira kunne redde den anti-proliferative virkninger af 1-NA-PP1. Som vist i fig. 7A-B, PC3-celler blev inficeret med null adenovirus (Adv-null) og adenovirus bærer pKD1 og PKD3 gener (Adv-pKD1 og Adv-PKD3) ved 50 og 100 MOI. De inficerede celler blev underkastet 1-NA-PP1 behandling ved 10 og 30 uM. Infektion med Adv-pKD1 og Adv-PKD3 vendt anti-proliferative virkninger af en-NA-PP1. De højere niveauer af ekspression af pKD1 eller PKD3, jo større redning effekter og 100 MOI en næsten komplet tilbageførsel af blev observeret 1-NA-PP1-induceret hæmning af celleproliferation for Adv-pKD1. Disse data viser, at anti-proliferative virkninger af 1-NA-PP1 blev medieret gennem inhibering af PKD. Det tyder også på, at funktioner PKD isoformer sandsynligvis overflødige da både pKD1 og PKD3 kan redde virkningerne af en-NA-PP1.

Overekspression af pKD1 og PKD3 i prostatacancerceller reddet anti-proliferative virkninger af 1-NA-PP1. PC3 (0,5 mio) -celler blev podet i en 60 mm skål og inficeret den næste dag med 50 og 100 MOI kan adenovirus transporterer pKD1 (Adv-pKD1) (A) og (Adv-PKD3) PKD3 (B). Tom adenovirus (Adv-null) blev anvendt som kontrol. Efter 24 timer, 3000 celler /brønd blev udpladet i 96-brønds plader og behandlet med og uden 10 og 30 uM 1-NA-PP1 i 72 timer. MTT-opløsning blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer. Optisk densitet blev aflæst ved 570 nm for at bestemme cellernes levedygtighed. Den overekspression af pKD1 og PKD3 blev bekræftet ved Western blot analyse (billeder nedenfor graferne). Statistisk signifikans mellem DMSO og inhibitor behandling for hver adenovirus samt mellem kontrol- og PKD adenovira ved hver inhibitorkoncentration blev bestemt ved uparret t-test i GraphPad Prism V. ns, ikke statistisk signifikant; *, P 0,05; **, P 0,01; ***, P 0,001

1-NA-PP1 potent hæmmer prostata tumor migration celle og invasion

PKD har vist sig at spille en vigtig rolle i reguleringen af ​​celle motilitet , adhæsion og invasion [4]. I denne undersøgelse blev virkningerne af 1-NA-PP1 på tumorcellemigration og invasion vurderet af to uafhængige assays, et sårhelende assay (celle migration) og en Matrigel invasion assay (celleinvasion). Som illustreret i fig. 8A, 1-NA-PP1 30 uM kraftigt blokeret PC3 celle migration. Toogtyve timer efter sårdannelse, 88,6% af det sårede område i 1-NA-PP1-behandlede monolag forblev åben, mens den for kontrollen havde helt lukket. Tilsvarende 1-NA-PP1 også signifikant blokeret tumorcelleinvasion. Behandling af celler med 30 uM 1-NA-PP1 i 20 timer resulterede i 60% inhibering af celleinvasion forhold til kontrol (figur 8B.). Tilsammen 1-NA-PP1 er en potent inhibitor af prostatacancer cellemigration og invasion.

A.1-NA- PP1 blokeret prostatakræft cellemigrering. PC3-celler blev dyrket til konfluens i plader med 6 brønde. Monolag blev såret og filmede straks (0 h). Celler blev derefter behandlet i vækstmedier indeholdende et vehikel (DMSO) eller 30 uM 1-NA-PP1 i 22 timer og sårlukning blev målt. Procentdel sårheling blev beregnet som procent af helet sår område sammenlignet med den oprindelige sår. B. 1-NA-PP1 inhiberede prostatacancer celleinvasion. DU145 celler blev inkuberet med 30 pM 1-NA-PP1 i Matrigel skær. Efter 20 timer blev noninvasive celler fjernet og invasive celler blev fikseret i 100% methanol, farvet i 0,4% hematoxylin-opløsning og fotograferet. Antallet af celler, som invaderede Matrigel matrix blev bestemt ved celletælling i 6 felter i forhold til antallet af celler, som migrerede gennem styring indsatsen. Procent invasion blev beregnet som procent af cellerne invaderet gennem Matrigel indsætter vs. totale celler migreret gennem kontrol- skær. C. overudtrykt pKD1 og PKD3 vendes de inhiberende virkninger af 1-NA-PP1 på tumorcelleinvasion. DU145-celler blev inficeret med null, pKD1, og PKD3 adenovira (Adv-null, Adv-pKD1, og Adv-PKD3) ved 100 MOI. Efter 24 timer blev cellerne genudpladet i kontrol og Matrigel indsætter og en Matrigel invasion assay blev udført som beskrevet ovenfor. Den overekspression af pKD1 og PKD3 blev bekræftet ved Western blot analyse (billeder nedenfor graferne). Alle de ovennævnte eksperimenter blev gentaget mindst tre gange, og data fra et repræsentativt forsøg er vist.

For at bestemme om PKD medierer virkningerne af 1-NA-PP1 om migration og invasion, blev udført redningsforsøg at undersøge, om overudtrykt pKD1 og PKD3 kunne dæmpe de inhiberende virkninger af en-NA-PP1. PC3 celler blev inficeret med null adenovirus (Adv-null) og adenovirus bærer pKD1 og PKD3 gener (Adv-pKD1 og Adv-PKD3). Den invasive egenskab af de inficerede celler blev målt ved Matrigel invasion assay. Som vist i fig. 8C, overekspression af pKD1 eller PKD3 helt vendt hæmning af 1-NA-PP1 på celle invasion, på trods af deres manglende hæmmende effekt på invasion celler, når udtrykkes alene. Disse data indebærer, at målrettet inhibition af PKD medierer den anti-invasive virkninger af 1-NA-PP1. I modsætning hertil eftersom overekspression af pKD1 og PKD3 blokerede migrationen af ​​PC3-celler, var vi ikke i stand til at måle væsentlige ændringer i cellemigrering under tilstedeværelse eller fravær af 1-NA-PP1 hjælp sårheling assay (data ikke vist). Alternativt undersøgte vi migreringen af ​​DU145 celler ved hjælp migrationen kamre. Vores data viser, at overekspression af pKD1 eller PKD3 hæmmede celle migration og påvirkede ikke den hæmmende effekt på 1-NA-PP1 på celle migration (fig. S1).

En gatekeeper mutant af pKD1 er 12 gange mere følsomme over for inhibering af 1-NA-PP1 i intakte celler

1-NA-PP1 er en af ​​de C3-modificerede analoger af Src-familien kinase inhibitor PP1. Det blev udviklet og anvendt som en meget selektiv kinaseinhibitor med enkelt ciffer nanomolære IC

50s til analog-sensitive (as) kinaser, der er konstrueret til at bære en enkelt aminosyresubstitution ved gatekeeper rest i kinase aktive sted [25] , [27]. Men mikromolær 1-NA-PP1 ikke inhibere eller kun svagt blokerer vildtypekinaser, hvilket tillader inhibitoren /as-kinase par, der skal anvendes i dissekere de specifikke funktioner og signaler mekanismer kinaser. Dette kemiske genetiske fremgangsmåde er blevet anvendt med succes til en række proteinkinaser [27], [31] – [36]. Således har vi spekuleret på, at styrken og selektiviteten af ​​1-NA-PP1 for PKD kunne forbedres yderligere ved at indføre gatekeeper aminosyre mutationer. Tilpasning af det aktive sted-sekvensen af ​​PKD isoformer førte til identifikation af gatekeeper aminosyre, methionin 659 (M659), i pKD1 (fig. 9A). Vi efterfølgende genereret to rum-skaber analog-følsomme pKD1 mutanter af en Flag-tagget pKD1 (Flag-pKD1), nemlig Flag-pKD1

M659G og Flag-pKD1

M659A. Efter overekspression i intakte celler (fig. 9B), blev den inhibitoriske aktivitet af 1-NA-PP1 vurderet ved forbehandling med inhibitoren efterfulgt af PMA-stimulering og efterfølgende immunoblotting for pS

916-pKD1 som før (fig. 5). PKD1 og tubulin blev blottet som kontroller. Som vist i fig. 9C, Flag-pKD1

M659G udviste signifikant forøget følsomhed over for 1-NA-PP1 sammenlignet med kontrollen vildtype. Baseret på densitometrianalyse, IC

50 for vildtype Flag-pKD1 var 26,50 ± 2,23 uM, medens IC

50 for analog-sensitive Flag-pKD1

M659G var 2,13 ± 0,61 uM, afspejler en 12 gange stigning i følsomhed over for 1-NA-PP1. I modsætning hertil var der ingen signifikant forskel i inhiberingen af ​​Flag-pKD1

M659A med 1-NA-PP1 sammenlignet med vildtype-Flag-pKD1 (data ikke vist), hvilket indikerer, at M659A mutationen var ikke i stand til at sensibilisere pKD1 til inhibering af 1-NA-PP1. Tilsammen indikerer vore data, at den inhibitoriske aktivitet af 1-NA-PP1 for pKD1 kan styrkes yderligere ved indføring gatekeeper mutation, hvilket indebærer, at 1-NA-PP1 kunne parres med analog-sensitive pKD1

M659G at bestemme PKD-specifikke funktioner og signalveje i intakte celler.

A.Alignment af de primære sekvenser, som indeholder gatekeeper aminosyre i PKD. Pilen viser konsensus gatekeeper aminosyre “Methionin” (M) i et skraveret rektangel. B. Ekspression af vildtype og mutant PKDs. HEK293 celler blev transficeret med vildtype og to gatekeeper mutanter af Flag-pKD1 (Flag-pKD1

M659G og Flag-pKD1

M659A). To dage efter transfektion blev cellerne lyseret og underkastet Western blotting for pKD1 og tubulin (ladningskontrol). C. 1-NA-PP1 koncentration-afhængigt hæmmede PMA-induceret aktivering af Flag-pKD1 og Flag-pKD1

M659G. HEK293-celler transficeret med Flag-pKD1 og Flag-pKD1

M659G blev serum-udsultet i 24 timer og forbehandlet med 1-NA-PP1 ved stigende koncentrationer i serum-frit medium i 45 minutter, efterfulgt af stimulering med PMA på 10 nM i 20 min. Cellerne blev høstet og udsat for immunblotting for p-S

916-pKD1, pKD1, og tubulin. Forsøget blev gentaget tre gange og repræsentative billeder fra en forsøg er vist.

Diskussion

PKDs spiller en vigtig rolle i mange fundamentale biologiske processer og udgør en spirende terapeutisk mål for mange patologiske tilstande og sygdomme. Men den nøjagtige biologiske funktion af PKD er ikke veldefineret. Meget selektive og celle-gennemtrængelig PKD lille molekyle inhibitorer er ikke kun potentielle lægemiddelkandidater, men også stærke redskaber til en systemisk evaluering af PKD-specifikke funktioner og signalveje i komplekse biologiske systemer.