PLoS ONE: Aktiveret cMET og IGF1R-Driven PI3K Signaling forudser Poor Overlevelse i tarmkræft Uafhængig af KRAS-mutationsstatus Status

Abstrakt

Baggrund

Onkogen mutationsanalyse giver prædiktiv vejledning til terapi såsom anti -EGFR antistoffer, men det lykkes kun for en delmængde af kolorektal cancer (CRC) patienter.

Metode

en omfattende molekylær profilering af 120 CRC patienter, herunder 116 primær, 15 levermetastaser, og 1 peritoneal seeding vævsprøver blev udført for at identificere forholdet mellem v-Ki-ras2 Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (

KRAS

) WT og mutant CRC tumorer og kliniske resultater. Dette omfattede bestemmelse af protein aktiveringsmønstre af human epidermal receptor 1 (HER1), HER2, HER3, c-MET, insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF1R), phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K), Src homologi 2 domæne indeholdende ( SHC), protein kinase B (AKT), og ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) kinaser bruger multiplex kollaborativ enzym forbedret reaktiv (CEER) immunoassay.

Resultater

KRAS

WT og muterede CRCs var ikke forskellige i forhold til ekspressionen af ​​de forskellige signaleringsmolekyler. Dårlig prognose med hensyn til tidlig tilbagefald ( 2 år) og kortere sygdomsfri overlevelse (DFS) korreleret med øget aktivering af PI3K signalering i forhold til den HER kinase pathway signalering, men ikke med det

KRAS

mutationsstatus .

KRAS

WT CRC’er blev identificeret som en blandet prognose befolkning afhængig af deres niveau af PI3K signalering.

KRAS

WT CRC’er med høj HER1 /c-MET-indekset forholdet viste en bedre DFS post-kirurgi. c-MET og IGF1R aktiviteter i forhold til HENDES akse aktivitet var betydeligt højere i begyndelsen af ​​tilbagefald CRC’er, hvilket tyder på en rolle for disse alternative receptor (RTK’er) i kørsel høj PI3K signalering.

Konklusioner

de præsenterede data underklassificeres CRC’er baseret på deres aktiverede signalveje og identificere en rolle for c-MET og IGF1R drevet PI3K signalering i CRC’er, der er overlegen i forhold til KRAS mutationsmønstre test alene. Resultaterne fra dette studie kan udnyttes til at identificere aggressive CRC’er, forklare svigt af nuværende godkendte lægemidler i specifikke CRC delmængder, og, vigtigst af alt, generere hypoteser for pathway-styrede terapeutiske strategier, der kan testes klinisk.

Henvisning : Lee J, Jain A, Kim P, Lee T, Kuller A, Princen F, et al. (2014) Aktiveret cMET og IGF1R-Driven PI3K Signaling forudser Poor Overlevelse i tarmkræft Uafhængige af KRAS mutationsstatus. PLoS ONE 9 (8): e103551. doi: 10,1371 /journal.pone.0103551

Redaktør: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, Japan

Modtaget dateret 25. april 2014 Accepteret: 30 Juni 2014; Udgivet: 4 August, 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist støttet af Samsung Biomedical Research Institute tilskud # SS1-B3-011-1. Denne forskning blev suppoorted af en bevilling af Korea Health teknologi R D Project via Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finansieret af Ministeriet for Sundhed Velfærd, Republikken Korea. (Grant nummer: HI13C1951). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Mens AJ, PK, TL, FP og SS er ansat af Prometheus Laboratories, dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

monoklonale antistoffer såsom cetuximab og panitumumab der er rettet mod epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), en human epidermal receptor (HER) familiemedlem, har vist sig at være effektiv med hensyn til responsrate og progressionsfri overlevelse i kombination med standard cytotoksisk kemoterapi i metastatisk kolorektal kræft (CRC’er) [1] – [4]. EGFR targeting antistoffer binder til det ekstracellulære domæne af EGFR, hvilket fører til inhibering af dens downstream signalveje, herunder RAS-RAF-mitogenaktiveret proteinkinase 1 (MAPK1) akse, der er hovedsageligt involveret i celleproliferation, og v- akt murine tymom viral onkogen homolog 1 (Akt1) vej, som er hovedsageligt involveret i celle overlevelse og tumor invasion [5]. Akt1 er reguleret af den opstrøms phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signalvejen.

Mutationer i v-Ki-ras2 Kirsten rotte sarkom viral onkogen homolog (

KRAS

), hyppigst påvist i kodoner 12, 13 og 61, forekommer hos omkring 40% af CRC patienter [6], [7].

KRAS

mutationer er dukket op som den vigtigste negative prædiktiv faktor for behandling respons hos patienter cetuximab [8], [9]. Disse undersøgelser har antydet, at

KRAS

vildtype (WT) CRC tumorer vil være lydhøre over for cetuximab; dog op til 65% af patienter med

KRAS

WT tumorer er stadig resistente over for anti-EGFR monoklonale antistoffer [10]. Modstandsdygtighed over for anti-EGFR-antistoffer i en undergruppe af

KRAS

WT CRCs kan forklares ved tilstedeværelsen af ​​en mutation i

BRAF

onkogen [8], som er nedstrøms for

KRAS

. Årsagen til cetuximab manglende respons i de resterende

KRAS

WT CRC’er fortsat uklart. Selv

KRAS

mutationer er typisk forbundet med ikke-modtagelighed for anti-EGFR-antistoffer, de seneste data viser, at

KRAS

G13D mutationer kan være en positiv indikator for cetuximab respons [8]. Mutationer i

PIK3CA

gen [10], som er en vigtig regulator af PI3K-signalering, er også til stede i nogle CRC tumorer, der kan co-forekomme med

KRAS

eller

BRAF

mutationer [8], [11], hvilket tyder på deres mulige indflydelse på lydhørhed over for målrettede lægemidler, såsom anti-EGFR-antistoffer, men en klar demonstration af en sådan sammenhæng mangler [12], [13].

fra undersøgelser skitseret ovenfor, og i betragtning af at en stor andel af CRC patienter med

KRAS

WT tumorer ikke reagerer på cetuximab eller panitumumab, er det klart, at en simpel mutationsanalyse er utilstrækkelig til at forudsige lydhørhed over for sådanne lægemidler. Eftersom nylige undersøgelser antydet, at de terapeutiske reaktioner på PI3K inhibitorer blev ikke begrænset til kolorektale cellelinjer med aktiverende mutationer eller hos patienter med mutationer [14] – [16], er det bydende nødvendigt at profilere tumorer for deres fremherskende samt potentiale alternative signalvej bilister i tillæg til den onkogene mutationsanalyse. Derfor var det et mål at profilere CRC væv til at undersøge sammenhængen mellem mutationsstatus og forskellige receptortyrosinkinase (RTK) protein udtryk som HER1, HER2, HER3, c-MET, og insulin-lignende vækstfaktor 1 receptor (IGF1R). Desuden downstream kinaser PI3K, Src homologi 2 domæne indeholdende (Shc), proteinkinase B (AKT), og ekstracellulære signal-regulerede kinase (ERK) blev bestemt under anvendelse af multipleksede immunomicroarray baseret Collaborative Enzyme Enhanced Reactive (CEER) immunoassay [17] – [19] i 120 CRC patienter fra fase i til IV, der omfattede 116 primær, 15 levermetastaser, og 1 peritoneale såning vævsprøver. Sideløbende somatiske mutationsanalyse scorede for mutationer i

KRAS

BRAF

onkogener. CRC tumorer med lignende onkogene mutationer viste heterogenitet i deres signalvej profiler.

Patienter og metoder

Patient Kohorte og vævsprøve Procurement

Undersøgelsen blev godkendt af den institutionelle gennemgang bord (IRB) på Samsung Medical center. Alle kliniske undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne i Helsinki-erklæringen. Den skriftlige informerede samtykke blev givet afkald af IRB grundet retrospektiv analyse og anonyme data. Friske frosne væv (n = 120), der er indsamlet fra kirurgisk resektion tumorer (73 tyktarm, 47 rektum), 15 fra metastatiske levertumorer og en fra peritoneal seeding knude, var til rådighed for den endelige analyse. Alle friske frosne væv blev indsamlet inden 30 minutter ved det kirurgiske område af en kirurg, blev straks lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Tumorprøver blev bekræftet for tilstedeværelsen af ​​tumor 70% areal af en patolog. Til analysen blev små stykker af frosne væv (10-um snit x 3) fremstilles ved anvendelse af forud afkølet barberblade og blev derefter lyseret i 100 pi lysisbuffer. De resulterende lysater blev opbevaret ved -80 ° C indtil efterfølgende analyse.

Collaborative Enzyme Enhanced Reaktiv-immunassay (CEER)

CEER anvender et antistof microarray-baseret platform, der kan måle ekspressionen og aktivering niveauer af signaltransduktionsveje proteiner i tumorvæv og surrogat væv. Det valgte mål er først fanget af en målspecifik indfangende antistof efterfulgt af co-lokalisering af to yderligere detektor antistoffer mod det samme mål, i sidste instans med specifikt mål detektion og kvantificering. Detaljerede metoder til denne teknologi er tidligere blevet beskrevet [17] – [19] og kan findes i File S2. Repræsentative eksperimenter er vist i Fig.S1 i File S1.

Mutation analyse

Genomisk DNA blev ekstraheret fra CRC væv under anvendelse af Qiagen Tissue Kit. Prøver blev screenet for mutationer i

KRAS

,

BRAF

, og

PIK3CA

gener: G12A /C /D /S /V, G13C /D, og ​​Q61H i

KRAS

V600E i

BRAF

. Den mutations assay var baseret på TaqMan realtid polymerasekædereaktion (PCR) teknologi i kombination med allelspecifikke primere (ASP), blokker og probe under anvendelse af en modifikation af real-time allelspecifik PCR påvisningsmetode [20]. Kort fortalt blev ASPs anvendes til specifikt at detektere den mutante allel. En blokerende oligonucleotid (blokker) komplementær til vildtype-sekvensen blev anvendt til at undertrykke enhver ikke-specifik amplifikation af vildtype-allelen. PCR-blandingen anvendes til alle assays var GTXpress Master Mix fra Life Technologies. Alle assays blev kørt på 384-brønds plader ABI 7900HT Real Time PCR instrument (Life Technologies).

Den procentdel af allelvariant stede i ukendte prøver blev beregnet under anvendelse af en standardkurve. Standardkurven blev genereret for hver mutation fra DNA ekstraheret fra en cellelinie positiv for at mutation ved anvendelse af en serie af DNA-fortyndinger (100, 10, 1, 0,1 og 0,01 ng). En liste over de positive cellelinier, der anvendes til frembringelse af standardkurver er vist i tabellen nedenfor. DNA fra de respektive cellelinier blev ekstraheret under anvendelse af Qiagen DNeasy Blood Tissue Kit.

Brug af standardkurven, blev mængden af ​​den respektive mutation i den ukendte DNA-prøve beregnes ud fra Ct-værdi, som herefter kunne anvendes til at beregne den procentvise allelvariant baseret på den antagelse, at standarden celle linje er 100% positive for den specifikke mutation. Den allele varians af cellelinierne blev bestemt under anvendelse af primere specifikke for vildtype-allelen. Følgende er bestemt cellelinje for genmutationer: SW1116 (KRASG12A), NCI-H23 (KRASG12C), LS174T (KRASG12D), PSN1 (KRASG12R), A549 (KRASG12S), SW403 (G12V), H1734 (KRASG13C), T84 (KRASG13D ), H460 (KRASQ61H), og HT29 (BRAFV600E).

Statistisk analyse

Mann-Whitney

t

-tests, Kaplan-Meier overlevelsesanalyse, og Pearson korrelationsanalyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism-version 5 til Mac OS X (GraphPad Software, La Jolla Californien USA, www.graphpad.com). DFS blev bestemt under anvendelse af Kaplan-Meier-metoden, og overlevelseskurverne blev sammenlignet under anvendelse af log-forholdet metode. Overlevelse blev målt fra tidspunktet for kirurgi. Alle tests var to-sidet, og P-værdier mindre end 0,05 blev betragtet som signifikante. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 20 software til Windows (SPSS Inc., Chicago, IL).

Resultater

Patient Kendetegn

De karakteristiske træk ved de 120 CRC patienterne leveres i tabel 1. Halvfjerds-tre patienter præsenteret med et kolon primær, mens 47 patienter havde endetarmen primære. Ca. 70% af patienterne undergik adjuverende kemo- eller strålebehandling, afhængigt af den primære tumor placering. Ti colon-levermetastaser par og en colon-peritoneal såning parret blev inkluderet i analysen. Alle væv, herunder parrede prøver, blev anskaffet på tidspunktet for kirurgi og straks snap-fastfrosset på det kirurgiske område til fremtidig molekylær analyse.

Differential signalvej aktiveringer forudsagde dårlig overlevelse bedre end KRAS-mutationer

KRAS

mutationer, med

KRAS

G12D og G13D mutationer er den mest hyppige, blev observeret i 39% (45/115) af prøverne i vores CRC patient kohorte. Især 28/115 patienter foretaget de

KRAS

G12 mutationer og 17/115 patienter foretaget de

KRAS

G13D mutationer. Mutationer i

BRAF

, som er nedstrøms for

KRAS

, blev fundet i 4% (5/115) af patienterne. Selvom

KRAS

G12-muterede CRC’er er generelt forbundet med dårlig prognose, en betydelig procentdel af

KRAS

WT CRC’er viste lav DFS og nogle

KRAS

G12 muterede CRC’er viste høj DFS uanset deres tumor stadium (fig. 1A). Tumorer i hver

KRAS

mutations subtype påvist en lignende median ekspression af phosphoryleret ERK (pERK), som er nedstrøms for

KRAS

(fig. S1). En tilsvarende procentdel af CRC tumorer udtrykte pERK over medianen (51,8% i

KRAS

WT, 48,5% i G12 muteret, og 44,4% i G13D muterede tumorer).

(A) Plot af sygdomsfri overlevelse (DFS) versus tumor etape i

KRAS

WT og G12mut primære CRCs. Hver prik repræsenterer en individuel patient og de brune og blå prikker indikerer patienter, der gjorde eller ikke fik adjuverende kemoterapi, hhv. (B) Sammenlignende DFS kurver af CRC prøver opdelt i henhold til deres gentagelse gange post-kirurgi. DFS for tidlige relaps patienter (tilbagefald ≤2 år) er vist med rødt og DFS for sent relaps patienter (tilbagefald 2 år) er vist i blåt. P-værdier er vist. Nedenstående tabel grafen viser procentdelen af ​​patienter med en specifik

KRAS

genotype i hver gruppe. (C) Pearson korrelation analyse af tidlige vs. sene tilbagefald CRC’er fremsættelse af pPI3K, pPI3K /pHER1, pPI3K /pHER2, og pPI3K /pHER3 i hele CRC kohorte. Signifikante sammenhænge er markeret med gult. Plottet i kassen viser forskellen i pPI3K /pHER3 nøgletal i begyndelsen tilbagefald vs. sene tilbagefald CRC’er.

Som forventet overlevelseskurverne for de to kohorter var signifikant forskellige (fig. 1B) , med de respektive median overlevelse på 19,8 måneder for tidlig tilbagefald (2 år fra kirurgi) og udefineret for sen tilbagefald (hazard ratio = 117,5). Som vist i fig. 1C, højere udtryk for aktiveret PI3K korreleret med tidlig tilbagefald og specifikt, højere udtryk for pPI3K /pher nøgletal var signifikant associeret med en tidlig tilbagefald. PI3K er et vigtigt nedstrøms signalering effektor af HER kinase akse med direkte bindingssteder på HER3. Den afskåret værdi for pPIK3 /HER3-forholdet blev bestemt som vist i Fig.S2 i File S1. Endvidere pPI3K /pHER3 ekspression var betydeligt højere i CRC tumorer, der fik tilbagefald inden for 2 år (fig. 1C). Derfor blev forbedret PI3K signalering observeret i CRC’er med et kortere DFS eller dårligere prognose.

Høj PI3K signalering er forbundet med tidlig recidiv i CRC

For at få yderligere indsigt i den høje vs. lav pPI3K signalering CRC kohorter, vi fokuseret på CRC sub-kohorter opdelt i henhold til pPI3K /pHER3 forholdet (fig. 2A). Patient karakteristika i høj vs. lav pPI3K signalering CRC kohorter var velafbalanceret med hensyn til deres tumor stadie, kemoterapi behandlinger, og mutationsstatus af onkogener

KRAS

BRAF

(Fig. 2B ). DFS af

KRAS

WT CRC’er med højere pPI3K /pHER3 udtryk var betydeligt værre end i

KRAS

WT CRC’er med lavere pPI3K /pHER3 udtryk (figur 2C.); dog

KRAS

G12mut tumorer viste dårlig DFS uanset deres niveau af pPI3K udtryk. Interessant, DFS sammenligninger af

KRAS

WT, G13Dmut, og G12mut CRC’er inden den lave pPI3K gruppen viste betydelige forskelle, med

KRAS

WT og

KRAS

G13D tumorer, der har en bedre overlevelse end

KRAS

G12mut tumorer (fig. 2D). På trods af de dramatiske forskelle i overlevelse observeret i de høje og lave pPI3K /pHER3 grupper afhængig af deres

KRAS

WT eller G12 muteret genotype, de to grupper var meget ens med hensyn til deres udtryk forskelle i de relevante markører. Med andre ord blev pPI3K /pHER1, pPI3K /pHER2, og pPI3K /pHER3 udtryk til betydeligt højere niveauer i den høje pPI3K /pHER3 gruppe i både

KRAS

WT og G12 muteret CRC’er (fig. S3 i File S1 ). Bemærk, at pPI3K udtryk ikke var væsentligt højere, men det var den pPI3K udtryk i forhold til den aktiverede HER akse, der var højere i grupperne viser dårlig overlevelse.

De respektive p-værdier er angivet. (A) Box afbildninger af Mann-Whitney

t

-test viser forskellen i ekspressionen af ​​pPI3K, pPI3K /pHER1, pPI3K /pHER2, og pPI3K /pHER3 mellem høje pPI3K /pHER3 gruppe og lav pPI3K /pHER3 grupper. De respektive p-værdier er vist. (B) Tabel notering karakteristika primære CRC’er i høj PI3K (høj pPI3K /pHER3) versus lav PI3K (lav pPI3K /pHER3) signalering kohorter. Kendetegn omfatter segregations baseret på tumor fase, status af kemoterapi behandling, og mutationsstatus af

KRAS

og

BRAF

. Tilsammen 67/115 prøver indeholdt i den høje PI3K kohorten og 48/115 prøver er omfattet af den lave PI3K kohorte. Tallene angiver den procentdel af prøver inden for hver kohorte baseret på hver angivne egenskab. (C) DFS ifølge pPI3K /pHER3 nøgletal i

KRAS

WT og

KRAS

G12mut CRCs. (D) Kaplan-Meier overlevelseskurverne for høj PI3K (pPI3K /pHER3) og lave PI3K kohorter sammenligner DFS af

KRAS

WT, G13Dmut, og G12mut prøver. (E) høj PI3K (høj pPI3K /pHER3) og lav PI3K (lav pPI3K /pHER3) grupper i parrede primære og metastatiske CRC prøver.

Disse data beviser for, at en høj pPI3K signalering, der kan eventuelt være drevet af andre end eller ud over den HER akse opstrøms signaler, er forbundet med aggressive CRCs med tidlig gentagelse. Desuden er disse data tydeligt vist heterogenitet inden for

KRAS

WT befolkning baseret på niveauet af pPI3K udtryk i disse tumorer. På den anden side,

KRAS

G12-muteret CRC’er typisk demonstreret dårlig overlevelse uanset niveauet af pPI3K signalering.

PI3K-drevne aggressive CRC’er, herunder metastatiske CRC’er, viser højere c-MET og IGF1R signalering end HER akse signalering

Da højere pPI3K /pher nøgletal korreleret med tidlige tilbagefald CRC’er, vi hypotese, at der også bør være en væsentlig forskel i pher /pMET og pher /pIGF1R nøgletal hvis pMET og pIGF1R er ansvarlige for høj pPI3K signalering. Dernæst undersøgte vi disse signalering netværk i 10 par matchede primære-metastatisk synkrone prøver til rådighed i vores undersøgelse kohorte. De primære-metastatisk CRC par blev adskilt i to grupper baseret på pPI3K /pHER3 udtryk forholdet mellem primære CRC prøve i hvert par. Der var en signifikant stigning i pPI3K /pHER3 forholdet for de matchede metastatiske prøver i det lave pPI3K /pHER3 forholdet gruppe (fig. 2E), mens den forblev uændret mellem primære og metastatiske prøver i høj pPI3K /pHER3 forholdet gruppe.

aggressivitet KRAS G12mut CRC’er er korreleret med høj c-MET udtryk i forhold til HER akse medlemmer

Vi har forsøgt derefter at identificere markører, der kan udtrykkes forskelligt mellem

KRAS

WT og G12mut CRC’er i den lave pPI3K gruppen. Baseret på vores indledende bemærkning af høj ekspression af total c-MET og IGF1R i

KRAS

G12mut tumorer i forhold til

KRAS

WT tumorer (fig. 3A, fig. S4 i File S1), vi undersøgt, om en differentieret c-MET- eller IGF1R-afhængig udtryk kan adskille

KRAS

WT og G12mut undergrupper inden den lave pPI3K /pHER3 forholdet gruppe. Relativ HER1 /c-MET og HER3 /c-MET-forhold var betydeligt højere i

KRAS

WT CRC’er end i

KRAS

G12mut tumorer (fig. 3B) i den lave pPI3K /pHER3 gruppe , men ikke i den høje pPI3K /pHER3 gruppe, som var i overensstemmelse med DFS forskelle (fig. 3A). Vi undersøgte, om passende forhold mellem HER1 /c-MET (fig. S5 i File S1) eller HER3 /c-MET kan også adskille DFS forskelle observeret mellem

KRAS

WT og G12mut CRC’er inden den lave pPI3K /pHER3 forhold gruppe. Analyse af

KRAS

genotyper af prøverne i de to sub-kohorter viste, at de fleste af de

KRAS

WT og G13D prøver var til stede i den høje HER1 /c-MET sub-kohorten (dvs. HER1 c-MET), mens størstedelen af ​​

KRAS

G12mut prøver var til stede i den lave HER1 /c-MET sub-kohorte (dvs. HER1 c-MET) (fig . 3C). En lignende HER1 /c-MET cut-off-forhold ikke adskille den høje pPI3K /pHER3 gruppe baseret på

KRAS

genotyper (fig. 3D). Parallel analyse med HER3 /c-MET-indekset resulterede i lignende, men mindre robust data, der ikke adskille KRAS WT og G12mut CRC’er så tydeligt som HER1 /c-MET-indeks (

data ikke vist

). Disse data viste, at den aggressive

KRAS

G12mut tumorer er molekylært særskilt, fordi de for det meste er præget af en høj c-MET udtryk, der svarer til eller er højere end HER1 og HER3 udtryk.

( A) pMET /Tc-MET-forholdet blev sammenlignet mellem høj PI3K (høj pPI3K /pHER3) og lav PI3K (høj pPI3K /pHER3) grupper ved hjælp af Mann-Whitney

t

-test. Sammenligningen er vist i alle CRCs,

KRAS

WT, G13D muteret, og G12 muteret CRCs. Signifikante forskelle med p-værdier er angivet med blåt. (B) Sammenlignende udtryk mellem høj og lav PI3K grupper for følgende markører: pHER1 /pMET, pHER2 /pMET, pHER3 /pMET, pHER1 /pIGF1R, pHER2 /pIGF1R, og pHER3 /pIGF1R. Signifikante forskelle med p-værdier er angivet med blåt.

Diskussion

Denne undersøgelse var baseret på den hypotese, at status af aktiveret signalveje i

KRAS

WT og mutant CRC’er kan give yderligere oplysninger, der kan være nyttige for at forstå de terapeutiske resultater i disse tumorer [17] – [19]. Analysen præsenteres i denne undersøgelse giver belæg for, at CRC kan være sub-klassificeret baseret på dens signalvej molekylære profiler uanset

KRAS

mutationsstatus, som sammenfattet i fig. 4. Ud over at give molekylære indsigt i CRC prognose, kan en sådan sti-baserede profilering have vigtige konsekvenser for stratificering CRC patientpopulation passende terapeutiske strategier.

Skematisk opsummerer sub-klassificering af CRC’er baseret på deres signalvej profiler og

KRAS

mutationsstatus. De mulige terapeutiske muligheder for hver underklasse baseret på deres pathway profiler er angivet.

Prognose for CRC primære tumorer efter kirurgi er blevet korreleret med deres

KRAS

mutationsstatus [21 ]. Selv om denne generelle tendens også blev observeret i vores CRC prøve kohorte, med

KRAS

WT tumorer demonstrerer bedre DFS post-kirurgi end

KRAS

G12 mutant tumorer, var det ikke alvorligt på grund af heterogenitet i de signalveje inden for hver

KRAS

mutations undertype, især i fase II og III CRC tumorer uanset om de patienter fik kemoterapi. Dette antyder, at

KRAS

mutationer giver kun en del af den fordel, der er nødvendige for tumorcelleoverlevelse med yderligere overlevelsessignaler formentlig stammer fra multiple signalveje. CRC’er med høj PI3K aktivitet tilbagefald inden for 2 år uanset deres

KRAS

mutationsstatus og havde dårlig prognose. Selv

KRAS

WT CRC’er med høj PI3K signalering var så aggressiv som

KRAS

G12mut CRC’er med skelnes DFS post-kirurgi. I modsætning hertil

KRAS

WT CRC’er med lav PI3K signalering aktivitet viste en bedre prognose og kunne være adskilt fra den aggressive

KRAS

G12mut CRC’er med en passende HER1 /c-MET indeks cut-off-forhold , fordi c-MET ekspressionsniveauerne var højere i

KRAS

G12mut CRCs. I vores undersøgelse kohorte, disse

KRAS

WT CRC’er udgjorde ~44% af den samlede

KRAS

WT befolkning og afslørede heterogenitet. Heterogenitet i

KRAS

WT CRC befolkninger har tidligere været bemærket i talrige andre undersøgelser, fordi ikke alle

KRAS

WT CRC’er er lydhøre over for anti-EGFR-antistoffer. En mulig årsag er blevet beskrevet som tilstedeværelsen af ​​

BRAF

mutationer. Antallet af

BRAF

-mutated prøver i vores kohorte var for lille til at drage rimelige konklusioner; dog 3/5 af

BRAF

-mutated CRCs i nærvær af WT

KRAS

viste en høj PI3K signalering. Vores undersøgelse giver en mulig mekanisme for heterogenitet i

KRAS

WT CRC’er og vi spekulere, at 44% af

KRAS

WT CRC’er med lav PI3K signalering og høj HER1 udtryk kan være de lydhøre over for anti -Hendes terapier, såsom anti-EGFR-antistoffer. Ca. 47% af CRC prøver med

KRAS

G13D mutationer blev for nylig foreslået at have forskellige terapi-baserede outcome egenskaber [8] og blev sporet med vores

KRAS

WT prøver i form af at have lav PI3K signalering og en høj HER1 ekspression. Relevansen af ​​PI3K signalering og PI3K /mTOR-hæmmere har tidligere været foreslået i

KRAS

mutant [22] og

BRAF

mutant [23] CRCs. Resultaterne fra vores undersøgelse er i overensstemmelse med disse rapporter og yderligere udvide betydningen af ​​PI3K signalering i CRC’er uanset deres mutationsstatus.

Relativt høje c-MET og IGF1R aktiviteter i forhold til HER kinase medlemmer aktiviteter i aggressiv CRCs foreslog at disse alternative RTK kan være førere af den høje PI3K signalering.

KRAS

G12-muterede CRC’er blev noteret for at udtrykke højere c-MET receptor niveauer end de HER medlemmer, der korrelerede med deres dårlig prognose. Mest overbevisende beviser til støtte for c-MET- og IGF1R drevet PI3K aktivitet i aggressive CRC’er kom fra de primære-metastatisk prøve par, hvor disse markører viste en klar stigning i metastatiske modstykke sammenlignet med matchede delprøve, selvom den mutationsstatus af parret forblev uændret. Det er vigtigt at bemærke, at udtrykket forskelle for enlige markører ikke præsentere meningsfulde forskelle, men det var den relative udtryk for pher signalering til pMET og pIGF1R der afslørede betydeligt differentierede mønstre mellem CRC’er, der var mere aggressiv og recidiverende tidligere versus dem, der var forbundet med bedre prognose. I øjeblikket er der ingen håndgribelige muligheder for at identificere aggressive CRC’er og definere terapeutiske muligheder for at behandle dem. Mutations test er den eneste tilgængelige strategi, som ikke identificerer den aggressive

KRAS

WT CRCs. Vores undersøgelse dokumenterer for aktiverede signalvej profil som er overlegen i forhold til onkogen mutationsmønstre tests alene, fordi disse resultater kan anvendes til at identificere aggressive CRCs og muligvis lede terapeutiske strategier. Den kliniske konsekvens af kombinatorisk protein profilering og mutationsmønstre test i form af narkotika følsomhed øjeblikket testet både i prækliniske og prospektive kliniske studier.

Vores undersøgelse også afsløret en betydelig variation i phosphoryleret proteom profilering mellem matchede primære og metastatiske CRCs . Dette var i modsætning til genotypebestemmelse, hvorefter der er fuld overensstemmelse mellem primære og metastatiske tumorvæv. Dette er i overensstemmelse med resultaterne fra et af de største sammenligning undersøgelser mellem primær og matchede levermetastaser i 305 CRC patienter (konkordans sats, 96,4%; 95% konfidensinterval, 93,6-98,2%) [24]. Desuden en nylig genomisk analyse på 84 patienter med primære CRC og levermetastaser viste en høj konkordans på 90% mellem primære og levermetastaser fem gener (dvs.

KRAS

,

NTM

,

BRAF

,

PIK3CA

,

TP53

) [25]. En af de mest plausible hypoteser for sådanne høj konkordans rate i mutationsstatus er, at

KRAS

mutationer er de tidlige drivende begivenheder i CRC progression fra adenom [26]. Hvis disse forskelle i sti profilering korrelerer med behandling reaktioner på specifikke RTK-hæmmere, kan vi nødt til at biopsi metastatiske sites foruden primære tumorer for at opnå en mere præcis forudsigelse af behandlingsrespons. Men vores stikprøvestørrelse var meget lille med kun ti par primær og metastase. Derfor er der behov for mere omfattende parret analyse strengt løse denne uoverensstemmelse i proteomisk profilering.

Som konklusion, vores undersøgelse viser, at der er betydelig heterogenitet i aktiveret protein signalveje trods en lignende mutationsstatus i CRC. Derfor dichotomizing CRC simpelthen som

KRAS

mutant versus

KRAS

WT kan være en undervurdering af den molekylære heterogenitet inden for hver undergruppe af CRC. Desuden er en mere omfattende signalvej profilering, foruden onkogene mutationsmønstre tests, bør udføres for at få et klarere molekylær identitet tumorer.

Støtte Information

File S1.

Støtte figurer. Figur S1. Profilering af signalvej markører i tarmkræft hjælp CEER. (A) Ranking af pERK udtryk fra høj til lav i

KRAS

vildtype, G12 muteret og G13D muteret CRC’er vises i et vandfald plot. pERK udtryk over medianen er repræsenteret på den positive y-aksen. Pakt udtryk i hver prøve er også vist. Tabellen nedenfor viser median pERK CU værdier i hver mutations undergruppe af CRC tumorer samt den procentdel af tumorer, der udtrykker pERK over medianen. (B) CEER immuno-array-billeder for angivne signal transduktion proteiner i 8 colorektale prøver. Som repræsenteret med en farve bar under immuno-array, en hvid eller en rød repræsenterer et højt niveau udtryk eller phosphorylering mens en grøn eller en blå repræsenterer et udtryk lavt niveau eller fosforylering af de respektive markører. Tumor scenen og

KRAS

mutations status for hver prøve er angivet. Figur S2. Effekt af pPI3K /pHER3 indekset på sygdomsfri overlevelse i CRCs. Sammenlignende DFS kurver af CRC prøver adskilt ved at reducere pPI3K /pHER3 nøgletal. DFS for prøver over de respektive cut-off er vist med rødt og DFS for prøver under de respektive cut-off er vist med blåt. Respektive p-værdier er vist. Figur S3. Karakteristik af matchede primære-metastatisk CRC prøve par. Tabel notering primære tumor karakteristika for de 10 matchede primære-metastatisk CRC par opdelt i henhold til deres pPI3K /pHER3 udtryk nøgletal. 6 par matchede prøver indgår i værre DFS gruppe, hvor pPI3K /pHER3 udtryk var 2/10. Kendetegn omfatter antal prøver i hver tumor fase, om patienten har modtaget kemoterapi og antal prøver baseret på mutationsstatus af

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

. Figur S4.