PLoS ONE: Henryin, en ent-kaurane diterpenoid, Hæmmer Wnt signalering gennem Interferens med β-Catenin /TCF4 Interaktion i kolorektal cancer Cells

Abstrakt

Aberrant Wnt /β-catenin signalering er blevet stærkt associeret med tumorgenese af human colorektal cancer. Inhibitorer af denne vej kan derefter tilbyde terapeutiske strategier samt kemoforebyggelse for denne malign sygdom. Henryin er en ent-kaurane diterpenoid isoleret fra

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

, en plante længe været brugt i folkemedicinen til at forhindre inflammation og gastrointestinal sygdom. I den foreliggende undersøgelse, rapporterer vi, at henryin selektivt hæmmer spredning af humane kolorektal cancer celler med et GI

50 værdi i nano-molære rækkevidde. Microarray analyse og reporter assays viste, at henryin arbejdede som en hidtil ukendt antagonist for Wnt signalvejen. Henryin reducerede ekspression af cyclin D1 og C-myc, og induceret G1 /S fase standsning i HCT116-celler. Samtidig havde henryin ikke påvirke cytosolen-nukleare fordeling af opløselig β-catenin, men forringet associering af β-catenin /TCF4 transkriptionel kompleks sandsynligt gennem direkte at blokere bindingen af ​​β-catenin til TCF4. Vi har også derefter analyseret den struktur-aktivitetsforhold blandt de ent-kaurane typen diterpenoider. Vores data tyder på, at henryin, som en ny inhibitor af Wnt signalering, kunne være en potentiel kandidat til yderligere prækliniske evaluering for tyktarmskræft behandling, og som sådan berettiger yderligere udforskning

Henvisning:. Li X, Pu J, Jiang S, Su J, Kong L, Mao B, et al. (2013) Henryin, en ent-kaurane diterpenoid, Hæmmer Wnt signalering gennem Interferens med β-Catenin /TCF4 Interaktion i Colorectal Cancer Cells. PLoS ONE 8 (7): e68525. doi: 10,1371 /journal.pone.0068525

Redaktør: Chunming Liu, University of Kentucky, USA

Modtaget: Marts 4, 2013; Accepteret: 30. maj 2013; Udgivet: 2 juli 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af både 100 talenter Program (YL) og West Light Foundation (JP) af det kinesiske Academy of Sciences, Major State Basic Research Development Program Kina (nr 2009CB522300), Natural Science Foundation of China (nr 81173076, 81172939), og de rekrutterede Top Talent of Sciences og Teknologi i Yunnan-provinsen (2009C1120), Kina. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er en almindelig ondartet, at der trods fremskridt i narkotikabehandling og forbedret diagnosticering, er fortsat en stor udfordring for den medicinske etablering verden. Selvom den nøjagtige sygdommens patogenese ikke er klart forstået, er kronisk inflammation tarmsygdom betragtes en risikofaktor, der bidrager til udvikling og metastase for tarmkræft [1]. Talrige undersøgelser har imidlertid antydet, at afvigende aktivering af den kanoniske Wnt /β-catenin signalvej spille en vigtig rolle i tumorigenese. I mangel af Wnt-ligander, er β-catenin phosphoryleres af et kompleks herunder adenomatøs polyposis coli (APC) /Dsh /Axin /GSK3p, som derefter ubiquitineret og nedbrudt gennem proteasomforløb. Når vejen er aktiveret ved binding af Wnt-ligander til dets membran receptorkompleks, bliver β-catenin ødelæggelse komplekse dissocierer og β-catenin stabiliseret og kommer ind i kernen for at aktivere målgenekspression i tandem med TCF transkriptionsfaktorer [2,3 ].

i tyktarmskræft celler, den Wnt /β-catenin vej ofte afvigende aktiveret [4-6]. Ifølge nylige rapporter fra Cancer Genome Atlas netværk, overføres Wnt pathway konstitutivt aktiveret i over 90% af human colorektal cancer ved både genetiske og epigenetiske ændringer af en række gener, der er involveret i Wnt signalvejen, såsom β-catenin , APC og Axin2 [7]. Aktivering af Wnt /β-catenin signalering efterfølgende øger ekspression af Wnt target gener, såsom cyclin D1 [8], C-myc [9] og Survivin [10], som alle er involveret i celleproliferation, apoptose og cellecyklus deregulering i udviklingen og progressionen af ​​maligne kolorektal cancer fænotyper [11-13].

til dato fremskridt i behandlingen og diagnosticering af kolorektal cancer er stadig begrænsede i deres effektivitet, hvilket fik os til at overveje alternative muligheder i at flytte forward. I folkemedicinen, nogle

Isodon

arter, udbredte planter, anvendes som te drink at forebygge betændelse, gastrointestinale bakterielle infektioner og endda tumorer. Vi antager, at kemiske stoffer, der findes i nogle

Isodon

arter sandsynligvis besat kemoforebyggende egenskaber samt kemoterapeutiske effekt mod kræft. I vores tidligere arbejde, var mange kemiske bestanddele isoleret og karakteriseret fra

Isodon

arter, men studiet af deres bioaktive profil er meget begrænset og mekanismer der mangler [14-16].

Vores nuværende undersøgelsen fokuserer på screening af forbindelser, der giver anti-tumor effekt, især på humane kolorektal cancer celler. Vi fandt, at henryin, en ent-kaurane diterpenoid, isoleret fra

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

, udstillet selektive væksthæmmende virkninger på humane kolorektale cancerceller ved at hæmme Wnt signalering. Vores data viser, at henryin interfererer med β-catenin /TCF komplekst samspil og inducerer G1 /S fasen anholdelse i kolorektale cancerceller. Følgelig henryin, som hidtil ukendt inhibitor af Wnt /β-catenin pathway, kunne gøre en lovende lægemiddelkandidat til både forebyggelse af colorektal cancer samt en hidtil ukendt terapeutisk.

Materialer og metoder Salg

reagenser

RPMI 1640-medium, blev Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), føtalt bovint serum (FBS), antibiotika opløsning, og trypsin-EDTA indkøbt fra HyClone (Logan, UT, USA). Den komplette blanding af proteaseinhibitor blev indkøbt fra Roche Applied Science (Indianapolis, IN, USA). Muse monoklonalt anti-CyclinD1 og anti-β-catenin antistoffer blev indkøbt fra BD Biosciences (San Jose, CA, USA). Kanin monoklonalt anti-TCF4 og polyklonalt anti-phospho-β-catenin antistof blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Kanin monoklonalt anti-p21 blev indkøbt fra Epitomics, Inc (Burlingame, CA, USA). Muse monoklonalt anti-lamin A /C, anti-β-actin, anti-c-myc antistoffer og andre reagenser, medmindre andet er angivet, blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Oprensede humane rekombinante proteiner β-catenin blev købt fra kinesisk biologisk inc. Rensede humane rekombinante proteiner TCF4 blev købt fra OriGene. Dual-luciferasereportergen assaysystem blev indkøbt fra Promega (Madison, WI, USA). Lipofectamine 2000 blev købt fra Invitrogen (Camarillo, CA, USA). Den QuantiTect SYBR, Green PCR Kit blev opnået fra Qiagen (Tyskland).

Forbindelser

Henryin og dets analoger blev udvundet fra

Isodon

rubescens

var .

lushanensis

, som tidligere beskrevet [14-16]. Forbindelserne blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO).

Cellelinjer

Colon cancercellelinier (SW480, HT-29 og HCT116), human lungecancer-cellelinie A549, humane normale lunge epitel cellelinie (Beas-2B) og HEK293T blev indkøbt fra ATCC. Den normale colon epitel cellelinje (CCD-841-con) [17] er venligst begavet af Dr. Lin, Li af Institut for Biokemi og Cellebiologi, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Celler blev dyrket i overensstemmelse med producentens anbefalinger. Alle medium blev suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika-antimykotika (100 enheder /ml penicillin G natrium, 100 mg /ml streptomycin) (Gibco, Invitrogen, USA).

MTS-assay og GI

50 bestemmelse

Celler blev podet i 96-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

3cells /brønd og inkuberet i 12 timer i en CO

2 incubator. Celler blev behandlet med dosis i området fra 0,008 til 4 um af henryin og dets analoger, med cisplatin som en positiv kontrol i 48 timer. Derefter blev 20 pi CellTiter 96® Aqueous One Solution-reagens (Promega, Madison, USA) tilsat, og cellerne blev yderligere inkuberet ved 37

° C i 1-2 timer. Cellelevedygtighed blev derefter målt ved aflæsning af absorbansen ved en bølgelængde på 490 nm. Følgende formel blev anvendt til bestemmelse cellevækst forholdstallene: 100 * (A490 (prøve, T) – A490 (prøve, T0)) /(A490 (kontrol, T) – A490 (kontrol, T0)). GI

50 værdier-de koncentrationer, der forårsager 50% cellevækstinhibering-bestemtes ved ikke-lineær regressionsanalyse ved anvendelse TableCurve software.

Microarray og dataanalyse

SW480-celler blev inkuberet med 4 um af henryin eller dimethylsulfoxid (DMSO) som kontrol i 12 timer. Cellerne blev lyseret med TRIzol (Invitrogen, USA) og totale RNA’er blev isoleret med QIAGEN RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Tyskland), før revers transkription, mærkning og hybridisering til Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray (4 × 44K) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Den microarray-analysen blev gennemført af Shanghai Bio Corporation. Efter GO annotation og pathway analyse blev gener med mere end 2 fold ændring i ekspressionsniveauet udvalgt til yderligere analyse.

Cell transfektion og luciferase reporter assays

I reportergenassays, celler blev podet i 96-brønds plader og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 inkubator i 12 timer. SW480 og HCT116-celler blev co-transficeret med 100 ng af plasmider i alt, herunder 80ng af en velkarakteriseret Wnt /β-catenin pathway responsiv ildflueluciferase reporterplasmidet SuperTOPflash (ST-Luc) og 20 ng af pRL-SV40 (Promega) kontrol reporter plasmid under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Hver brønd i HEK293T celler blev transficeret med 200 ng af plasmider i alt, herunder 80ng af ST-Luc og 20 ng af pRL-SV40 og 10 ng af β-catenin eller 64ng af wnt1 og tom vektor plasmider som angivet. Nogle 3h efter transfektion blev celler inkuberet med forskellige koncentrationer af forbindelser i 24 timer. Cellerne blev lyseret med 50 pi Promega lysepuffer i hver brønd og luciferaseaktivitet blev målt og normaliseret ved pRL-SV40 reporter-aktivitet. Alle eksperimenter blev udført uafhængigt tredobbelt. Resultater er rapporteret som gennemsnit og standardafvigelser (SD).

Reverse transkription og kvantitativ real-time PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra dyrkede celler med TRIzol og revers transkription blev udført ved anvendelse af SuperScript III Reverse Transcription Kit (Invitrogen) med oligo (dT) priming i henhold til producentens anvisninger. Gentranskripter blev kvantificeret ved real-time PCR under anvendelse SYBR Green I og β-actin blev anvendt som kontrol. De primtal anvendte var:

Menneskelig CyclinD1 forward primer: 5′-AAGTGCGAGGAGGAGGTCTT-3 ‘og den omvendte primer: 5′-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGA-3’

Humant C-myc fremad primer:. 5 ‘-CTTCTCTCCGTCCTCGGATTCT-3’ og revers primer: ».

Humant β-actin forward primer: 5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3 ‘5’-GAAGGTGATCCAGACTCTGACCTT-3 og den reverse primer: 5′-GATAGCACAGCCTGGATAGCAAC-3 ‘.

RT-PCR-forsøg blev udført i tre eksemplarer og PCR effektivitet med givne primere var mellem 95 og 100%. Smeltekurver blev også udført til overvågning af primer-specifikke amplifikationer.

Cytosol og nucleus fraktionering og western blotting-analyse

SW480-celler blev behandlet med henryin i 6-brønds plader. Fraktionerede kerner og cytosol lysater blev opnået under anvendelse af nuklear ekstraktionspuffer og hypotonisk lysepuffer hhv. Alle proteinekstraktion puffere blev suppleret med Complete protease inhibitor cocktail og phosphatase inhibitor cocktail (Roche). Proteinkoncentrationen af ​​hver rå lysat blev bestemt under anvendelse af Enhanced BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Kina). De normaliserede mængder af de lysatprøver blev påsat SDS-PAGE og overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Bedford, MA, USA). Immunoblotting blev udført under anvendelse af antistoffer detekterer phospho-β-catenin (Ser33 /37 /Thr41), β-catenin, Axin2, CyclinD1, C-myc, Survivin, P21, TCF4, med Lamin A /C og β-actin anvendt som indlæsning kontroller . HRP konjugeret anti-muse-IgG og anti-kanin IgG blev anvendt som sekundære antistoffer. SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific) blev anvendt til at detektere kemiluminescens, og blots blev afbildet under anvendelse af Luminescent Image Analyzer LAS-4000mini System (GE, USA).

Co-immunpræcipitationsanalyse

SW480-celler blev dyrket i plader med 6 brønde, behandlet med henryin og dets analoger enmenol og minheryin C i 12 timer, lyseret i protein lysis buffer (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA og proteinaseinhibitorer) og centrifugeret ved 14000 x g i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev inkuberet med et specifikt primært antistof natten over ved 4 ° C og derefter inkuberet med A /G PLUS agarose (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) i mindst 2 timer. Perlerne blev derefter vasket fem gange og resuspenderet i 50 pi SDS loading buffer. Western blot-analyse blev udført på prøverne.

In vitro

bindingsassay

For at analysere effekten af ​​forbindelser ved inhibering af β-catenin /TCF4 binding, oprensede rekombinante proteiner p catenin (0.8μg) og TCF4 (0,5 ug) blev inkuberet med henryin og dets analoger enmenol og minheryin C ved angivne koncentrationer ved 4 ° C i 2 timer, henholdsvis. β-catenin /TCF4 komplekser blev trukket ned anvendelse af protein A /G PLUS agaroseperler mættet med β-catenin antistof. Detektion blev derefter udført ved hjælp TCF4 antistof i western blotting analyse.

Cell cyklus analyse

HCT116 celler (5 x 10

5cells /brønd i 12-brønds plader) blev inkuberet med henryin for 0h, 12h og 24h henholdsvis. Alle adhærente celler blev opsamlet og vasket to gange med PBS. Celler blev fikseret med 70% ethanol natten over. Fikserede celler blev vasket med PBS, og derefter farvet med en 50 ug /ml propidiumiodid (PI) indeholdende 50ug /ml RNase A i 30 minutter ved stuetemperatur. Fluorescensintensitet blev analyseret ved FACSCalibur1 flowcytometer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Procentdelene af cellerne fordelt i forskellige faser af cellecyklussen blev bestemt ved anvendelse ModFIT LT 2.0.

Statistik

Data er præsenteret som gennemsnit ± SD for de angivne antal uafhængigt udførte eksperimenter. Ikke-lineær regressionsanalyse til beregning af GI

50 eller IC

50 værdier blev udført af TableCurve. Statistisk signifikans blev analyseret ved Students

t

-test eller envejs ANOVA i SigmaStat 3.1. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når P 0.05.

Resultater

Henryin hæmmer selektivt væksten af ​​kolorektal cancer celler og inducerer G1 fase anholdelsen af ​​cellecyklus

vækst hæmning effekter af henryin på humane kræftceller var primært evalueret med MTS-analyser. Som vist i figur 1B, henryin udviste stærkere vækstinhiberende virkninger på colon cancerceller (SW480, HT-29 og HCT116) end andre former for kræft (lungekræft A549) eller normale celler (humant normalt colon epitelcellelinje CCD -841-con og normal lunge epitelcellelinie Beas-2B). Som en kontrol, cisplatin havde lignende inhibitoriske virkninger mellem alle de forskellige cellelinier undersøgt (figur 1C). Analyse af GI

50 værdier af henryin og cisplatin på de forskellige cellelinjer støttede også den observation, at henryin haft en selektiv hæmmende virkning på tyktarmskræft celler (Figur 1D). De væksthæmmende effekter af henryin på SW480-celler viste en tid-dosisafhængig måde (data ikke vist). Celle cyklus analyse viste, at cellerne blev standset ved G1 fasen i HCT116-celler behandlet med henryin i en tidsafhængig måde (Figur 1E). Disse resultater sammen tyder på, at henryin udstillet selektiv væksthæmning på kolorektal cancer celler.

(A) Strukturerne af henryin og ent-kaurane vises. (B) vækstinhibering af henryin på forskellige cellelinier, herunder colorectal cancer cellelinier (SW480, HCT116 og HT29), normal colon epitelcellelinie CCD-Con-841, lungecancer-cellelinie A549, og normal lunge epitelcellelinie Beas- 2B, bestemt ved MTS assays med cisplatin anvendt som en kontrol (C). Celler blev behandlet med henryin op til 72h i forskellige koncentrationer. Absorbansen blev målt ved 490 nm. Alle prøver blev udført tredobbelt, og dataene er præsenteret som gennemsnit ± SD. (D) Den mediane vækstinhibering fusion (GI

50, 72h) værdier af henryin og cisplatin til forskellige cellelinier. (E) Repræsentative histogrammer forestiller celle-cyklus fordeling som analyseret ved flowcytometri i HCT116-celler behandlet med 4 um af henryin for 0h, 12h og 24 timer henholdsvis. Tællinger af G1-fase celler steget markant i de behandlede celler i en tidsafhængig måde.

Henryin forstyrrer Wnt signalering i CRC celler

For at undersøge de underliggende mekanismer, hvorigennem henryin hæmmer væksten af ​​kolorektal cancer celler, vi foretaget en microarray analyse og ændringer af genekspression blev analyseret i henryin behandlet SW480 celler. Generne blev filtreret ved at sætte kriteriet om fold ændring 2 (op-reguleret) eller 0,5 (nedreguleret) som differentielt udtrykte gener. Både GO annotation og pathway-analyse viste, at henryin kraftigt påvirker Wnt signalvejen samt andre ændrede veje, der er forbundet med kolorektal cancer biologiske processer i både Kegg og BioCarta databaser (Figur 2A-B).

( A) (B) Microarray assay og dataanalyse af differentiel genekspression under henryin behandling. SW480-celler blev behandlet i 12 timer med 4 um af henryin med 0,5% DMSO anvendt som en kontrol i assayet. GO annotation og sti analyse var ansat fra BioCarta og Kegg databaser, hhv. Generne med fold ændring på mindst 2 (op-regulerede) eller 0,5 (nedreguleret) blev taget som differentielt udtrykte gener. Dataanalyse og statistik blev genereret, når de hits 5 i hver signalvejen. Repræsentative pathways opnået efter microarray data analyse er vist. (C) Henryin inhiberer Wnt reporter ekspression i en dosis-afhængig måde i wnt1 transficeret HEK293T celler, og i colorektale cancerceller, SW480 og HCT116. Tre timer efter transfektion af Wnt1 og /eller ST-Luc, DMSO eller henryin med angivne dosering blev tilsat til cellerne i yderligere 24 timer og luciferaseaktivitet blev derefter målt. (D) Henryin (4 um) fortrinsvis inhiberer den Wnt-signalering (ST-Luc) over NF-KB-signalvejen (NF-KB-Luc) i HEK293T celler. Wnt signalering blev stimuleret ved transfektion af wnt1 og NF-KB-signalering blev stimuleret med 25 ng /ml TNFa. Hver søjle er middelværdien ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. * P 0,05, ** P 0,01, i forhold til vehikelkontrol. NS, ikke signifikant.

Efter microarray analyse, kontrolleres vi effekten af ​​henryin på Wnt /β-catenin signalering ved hjælp af TOPflash reporter analysen. I wnt1 transficeret HEK293T celler, henryin hæmmede Wnt signalering reporter ekspression i en dosisafhængig måde efter 24 timers behandling (figur 2C). Wnt signalering konstitutivt aktiveret i SW480 og HCT116 celler på grund af APC trunkering og β-catenin mutation hhv. I begge cellelinier blev Wnt signalering også inhiberet af henryin dosisafhængigt (figur 2C). Samtidig viste henryin ingen klar effekt på aktiviteten af ​​NF-KB-signalering lydhør luciferase reporter (NF-KB-Luc) (figur 2D). Disse data tyder på, at henryin specifikt hæmmer Wnt /β-catenin signalering.

For at karakterisere struktur-aktivitetsforhold af henryin, undersøgte vi aktiviteterne i yderligere henryin analoger (figur 3A) og undersøgte deres virkninger på Wnt signalering med ST-Luc reporter assay. To af forbindelserne, phyllostachysin F og oridonin, som besidder en keton ved C-15 og 14β-OH, ligner henryin, udviste også særskilte hæmmende på ST-Luc-aktivitet. I mellemtiden henryin analoger enmenol, minheryin og eriocalyxin B, som mangler ketongruppen ved C-15 eller 14β-OH, viste ingen virkning på Wnt reporter aktivitet (figur 3B-C). Efterfølgende vi yderligere undersøgt vækst hæmning virkninger af enmenol, minheryin og eriocalyxin B. Enmenol og minheryin C, i overensstemmelse med deres ikke-hæmmende aktiviteter på Wnt signalering, udviste ingen vækst-hæmmende effekt på de kolorektale cancerceller (figur 3D). Især viste eriocalyxin B stærke cytotoksicitet mod kolorektal cancer celler, lunge- kræftceller og selv de normale cellelinier (figur 3D). Denne brede spektrum cytotoksicitet af eriocalyxin B kunne være på grund af sin inhiberende aktivitet på NF-KB-vejen, som rapporteret NF-KB inhibitor [18]. Disse data antyder, at ketongruppen ved C-15 og 14β-OH er ansvarlige for henryin hæmmende virkning på Wnt signalering.

(A) Strukturer af henryin og dets analoger. (B) Virkninger af henryin analoger på Topflash aktivitet i HEK293T celler. Celler blev transficeret med Wnt1 og ST-Luc i 3 timer og derefter inkuberet med henryin og dets analoger af forskellige doser i 24 timer og bagefter luciferaseaktiviteter blev målt. (C) Den mediane vækstinhibering (GI

50 timer, 72 timer) og ST-Luc inhibering (IC

50, 24) værdier af henryin og dets analoger i SW480 celler er vist. (D) Virkninger af henryin analoger på væksten af ​​forskellige cellelinjer (48hours). De viste data er middelværdien ± SD fra tre uafhængige forsøg.

Henryin inhiberer endogene Wnt målgenekspression

Vi kontrollerede ekspressionen af ​​endogene Wnt målgener i vores microarray data og fandt, at ekspressionen af ​​Wnt målgener, herunder Axin2, cyklin D1, SP5, DKK1, NOS1, PPARS og FGF20, var signifikant nedreguleret efter behandling med henryin (figur 4A). For at bekræfte de inhiberende virkninger af henryin på ekspressionen af ​​Wnt signalering målgener behandlede vi wnt1 transficeret HEK293T og SW480-celler med henryin i 12 timer og overvåget ekspressionen af ​​c-myc og cyclin D1 ved RT-PCR. Resultaterne viste, at henryin reduceret deres ekspression i en dosisafhængig måde (figur 4B-C). Vi ansat også western blot analyser at opdage protein udtryk for cyclin D1, Survivin, Axin2 og C-myc i HEK293T, SW480 celler og HCT116 celler behandlet med henryin. I overensstemmelse med de ovenstående resultater, proteinniveauet af Axin2, cyklin D1, C-myc og Survivin blev reduceret med henryin sidste 24 timer af behandlingen (figur 4D-F).

(A) Henryin nedregulerer ekspressionen af Wnt målgener i microarray assay. (B-C) Henryin inhiberer cyclin D1 og C-myc ekspression i wnt1 transficerede HEK293T celler og SW480 celler. Cellerne blev behandlet med angivne doseringer af henryin for 12 timer. Niveauerne af cyclin D1 og c-myc mRNA blev bestemt ved real-time PCR og normaliseret for p-actin. (D) Virkningerne af henryin på ekspressionen af ​​Axin2, CyclinD1 og survivin proteiner i wnt1 transficeret HEK293T celler. Cellerne blev transficeret med wnt1 3 timer før henryin behandling. (E) Virkningerne af henryin på ekspressionen af ​​Axin2, CyclinD1 og survivin proteiner i SW480 celler. (F) Virkningerne af henryin på ekspressionen af ​​CyclinD1, Survivin, C-myc og P21 proteiner i HCT116 celler. Cellerne blev behandlet med henryin til 6, blev 12, 24T og celleekstrakter analyseret med Western-blotting af de angivne proteiner. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. * P 0,05, ** P. 0,01, i forhold til kontrol køretøj

Henryin forstyrrer sammenslutningen af ​​β-catenin /TCF kompleks

Et kendetegn for aktivering af Wnt signalering er stabiliserings- og nukleare akkumulering af β-catenin i kolorektale cancerceller. Vi kontrollerede effekten af ​​henryin på niveauet og distribution af β-catenin i SW480 celler. SW480-celler blev behandlet i 24 timer med henryin ved forskellige koncentrationer og samlede β-catenin og phosphorylerede form af β-catenin blev undersøgt (figur 5A). I mellemtiden blev det nukleare og cytoplasmatiske β-catenin også undersøgt under anvendelse western blot analyse. Resultaterne viste, at henryin behandling hverken påvirker niveauet af total og phosphorylerede form af β-catenin, eller fordelingen af ​​β-catenin i de nukleare og cytoplasmiske rum (figur 5B), hvilket antyder, at henryin målretter Wnt-vejen nedstrøms for β-catenin . I overensstemmelse med ovenstående resultat blev aktiviteten af ​​ST-Luc i HEK293T celler med β-catenin overudtrykkes signifikant reduceret med henryin, samt den stabiliserede form af β-catenin grundet S37A-mutationen (figur 5C). LiCI er en inhibitor af GSK-3β, som blokerer phosphorylering og efterfølgende nedbrydning af β-catenin, hvilket resulterer i stabiliseringen af ​​β-catenin [19]. Overraskende, henryin antagoniserede LiCI-induceret aktivering af den kanoniske Wnt signalering samt (figur 5C). Taget sammen antyder disse data at henryin ikke påvirker stabiliseringen af ​​β-catenin eller dets nukleare translokation, men snarere rettet mod Wnt signalering nedstrøms for den.

(A) Henryin påvirker ikke mængden af ​​total β catenin og pho-β-catenin i SW480-celler. (B) Henryin påvirker ikke fordelingen af ​​β-catenin i cytosol og nucleus fraktioner i SW480 celler. SW480-celler blev behandlet med de angivne doseringer af henryin i 24 timer. Celleekstrakterne eller fraktioner blev fremstillet og analyseret ved western blotting. Lamin A /C og β-actin blev anvendt som indlæsning kontrol af kerner og cytoplasma proteiner hhv. (C) Henryin antagoniserer Wnt signalering stimuleret med LiCl eller β-catenin. HEK293T celler blev transient transficeret med ST-Luc og β-catenin eller konstitutivt aktive β-catenin (S37A) plasmider, henholdsvis eller behandlet med LiCI (20 mM). Omkring 3 timer efter transfektion eller behandling blev henryin tilsat, og cellerne blev inkuberet i yderligere 24 timer. Hver søjle er middelværdien ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. (D) Henryin, men ikke enmenol og minheryin C, reduceret TCF4 der er forbundet med β-catenin i SW480-celler på en dosisafhængig måde. Celler blev behandlet med de angivne doseringer af henryin og dets analoger enmenol og minheryin C i 12 timer og immun-præcipitation blev udført ved β-catenin antistof med muse-IgG som en kontrol, og derefter TCF4 blev detekteret ved western blotting. (E) Henryin direkte forstyrrer interaktionen af ​​β-catenin med TCF4 i in vitro binding assay. Human rekombinant β-catenin (0.8μg) og TCF4 (0,5 ug) blev blandet, inkuberet med forskellige koncentrationer af henryin og dets analoger enmenol og minheryin C, og blandingen blev underkastet co-immunpræcipitering med β-catenin antistof og western blotting-analyse med TCF4 antistof, med muse-IgG anvendt som kontrol. (F) Kvantificering af Western blots vist i D og E. Den software ImageJ blev anvendt til at analysere intensiteten af ​​båndene. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra tre forsøg. Hen, henryin, En, enmenol, Min, minheryin C.

I kernen, β-catenin skal binde transkriptionsfaktorer af TCF familien til at regulere target genekspression. Vi kontrolleret, om henryin forringer β-catenin /TCF interaktion. SW480 celler behandlet med henryin var immune-udfældet ved β-catenin antistof eller muse-IgG som en kontrol, og TCF4 blev påvist ved western-blotting og blottene blev analyseret med ImageJ for intensiteter af båndene. Resultaterne viste, at henryin stærkt inhiberede bindingen af ​​TCF4 til p-catenin på en dosis-afhængig måde i SW480-celler, men ikke dets analoger enmenol og minheryin C (figur 5D, 5F), hvilket er i overensstemmelse med de inhiberende aktiviteter på Wnt signalering og kræft cellevækst af forbindelserne.

for at afgøre, om henryin direkte kan forstyrre interaktionen af ​​β-catenin med TCF4, in vitro bindingsassays blev udført med puri fi ed rekombinant β-catenin og TCF4 proteiner. Resultatet viste, at henryin stærkt inhiberede bindingen af ​​TCF4 til p-catenin i de in vitro bindingsassays, hvorimod dets analoger enmenol og minheryin C udviste ingen nogen virkning som forventet (fig 5E, 5F).

Diskussion

Målretning Wnt signalering kan repræsentere en lovende strategi for at udrydde ondartet sygdom med abnorm aktivering af denne vej. Følgelig kortlægge nye inhibitorer af Wnt /β-catenin-signalvejen er af stor betydning og betydning. Denne inhibering kan opnås ved at forstyrre vekselvirkningen mellem β-catenin /TCF [20] eller CREB protein (CBP) [21]. Stabilisering Axin2 [22,23] og aktivering af CK1α også blev taget som effektive mekanismer til at hæmme Wnt signalering for målrettede lægemidler mod tyktarmskræft [24]. I tidligere forskning, er adskillige forbindelser vist sig at besidde evnen til at afbryde β-catenin /TCF association direkte, såsom PKF115-854 og CGP049090 og lignende.

I de senere år har der været betydelig interesse i søgningen efter Wnt /β-catenin signalering antagonister af naturlige produkter [25]. Faktisk har mange strukturtyper af naturprodukter blevet identificeret som inhiberer Wnt /β-catenin signalering, herunder Murrayafoline A [26], Tetrandrine alkaloid [27], curcumin [28], EGCG [29,30], fl avonoids [31, 32], Magnolia [33] og andre [34,35]. For nylig, resveratrol blev rapporteret som værende i stand til at hæmme Wnt signalering nedstrøms for β-catenin, hvilket bidrager til undertrykkelse af tyktarmskræft tumorigenese [36].

Henryin, en ent-kaurane diterpenoid, isoleret fra

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

fortrinsvis fremkaldt kolorektal kræftceller ihjel mens normale colon CCD-Con-841 og normal lunge epitel Beas-2B celler mindre påvirket (figur 1B, D). Vi identificerede signalvejene ramt af henryin i colon cancerceller ved mikroarray-assay, blandt hvilke Wnt signalvejen viste sig at være den stærkt omdannede en. Overensstemmelse med microarray data, både wnt1 transficeret HEK293T celler og colorektale cancerceller, henryin inhiberede Wnt-responsive reporter aktiviteten på en dosis-afhængig måde (figur 2C). Henryin faldt ekspressionen af ​​endogene Wnt målgener (figur 4A-F) og forstyrrede associering af β-catenin /TCF transkriptionskomplekset sandsynligt ved direkte at blokere bindingen o f β-catenin til TCF 4 (figur 5D, 5E, 5F). Tilsammen foreslog disse data, at den anti-spredning aktivitet henryin i kolorektal cancer celler var forbundet med dets hæmning af Wnt signalering.