PLoS ONE: galectin Expression Profilering Identificerer galectin-1 og galectin-9Δ5 som prognostiske faktorer i fase I /II Ikke-småcellet lungekræft

Abstrakt

Ca. 30-40% af patienterne med tidligt stadie ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) vil præsentere med tilbagevendende sygdom inden for to år resektion. Her har vi udført omfattende galectin udtryk profilering i en retrospektiv undersøgelse med frosne og paraffin indlejret tumorvæv fra 87 fase I /II NSCLC patienter. Vores data viser, at galectin mRNA-ekspression i NSCLC er begrænset til galectin-1, -3, -4, -7, -8 og -9. Næste til at iscenesætte, univariable Cox regressionsanalyse identificerede galectin-1, galectin-9FL og galectin-9Δ5 som mulige prognostiske markører. Kaplan-Meier overlevelsesrater skøn afslørede, at den samlede overlevelse var signifikant kortere hos patienter, som udtrykker galectin-1 ovenfor median niveauer, dvs., 23,0 (2,9-43,1) vs. 59,9 (47.7-72.1) måneder (p = 0,020) såvel som hos patienter at udtrykke galectin-9Δ5 eller galectin-9FL under medianen, hhv. 59,9 (41,9-75,9) vs. 32,8 (8,7-56,9) måneder (p = 0,014) eller 23,2 (-0.4-46.8) vs. 58,9 (42,9-74,9) måneder (p = 0,042). Alle tre galectins var også prognostisk for sygdomsfri overlevelse. Multivariable Cox regressionsanalyse viste, at til OS, den mest betydningsfulde prognostiske model omfattede fase, alder, gal-1 og gal-9Δ5 mens modellen for DFS inkluderet fase, alder og gal-9Δ5. Konklusionen er, at nuværende undersøgelse bekræfter den prognostiske værdi af galectin-1 og identificerer galectin-9Δ5 som nye potentielle prognostiske markører i tidligt stadium NSCLC. Disse resultater kan bidrage til at identificere tidlige stadie NSCLC patienter, der kan drage størst fordel af adjuverende kemoterapi

Henvisning:. Schulkens IA, Heusschen R, van den Boogaart V, van Suylen RJ, Dingemans A-MC, Griffioen AW, et al. (2014) galectin Expression Profilering Identificerer galectin-1 og galectin-9Δ5 som prognostiske faktorer i fase I /II Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (9): e107988. doi: 10,1371 /journal.pone.0107988

Redaktør: Pierre Busson, Gustave Roussy, Frankrig

Modtaget: April 7, 2014 Accepteret: August 21, 2014; Udgivet: 26 September, 2014

Copyright: © 2014 Schulkens et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte datafiler

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den hollandske Cancer Society (www.kwfkankerbestrijding.nl:UM2008-4101, VU2009-4358) til AWG og VLT. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), klinisk-patologisk iscenesættelse i henhold til TNM klassifikationen er stadig den vigtigste separator at klassificere patienter med en tydelig resultat. Desværre, af patienter diagnosticeret med tidlig fase sygdom næsten 30% til 40% vil præsentere tumor tilbagefald inden for to år efter kirurgisk resektion [1]. Da det er påvist, at adjuverende kemoterapi kan forbedre overlevelsen for patienter med opereret stadie II-IIIa NSCLC, identifikation af patienter tidligt stadium med dårlig overlevelse er klinisk relevant [1].

Galectins er et protein familie, som medlemmerne er defineret ved tilstedeværelsen af ​​et konserveret carbohydratgenkendelsesdomæne [2]. Indtil videre har femten galectins blevet identificeret, elleve af som afspejles i forskellige humane celler og væv [3], [4]. De udøver mange forskellige funktioner, med regulering og finjustering af immunsystemet er den bedst undersøgte. Følgelig deregulering af galectin ekspression ofte associeres med et uhensigtsmæssigt immunrespons, som bidrager til forskellige patologier, herunder cancer [5], [6]. Desuden er der fundet galectins at mediere tumorcellemetastase [7] – [9] og til at inducere og vedligeholde tumorangiogenese [10] – [15], hvilket yderligere bidrager til cancer progression. Alt dette har resulteret i anerkendelsen af ​​galectins som diagnostiske og prognostiske markører i forskellige typer kræft, herunder lungekræft. For eksempel steg galectin-3-ekspression er blevet beskrevet som en indikator for dårlig prognose i NSCLC-patienter [16], [17]. blev rapporteret Lignende observationer for galectin-1-ekspression [16] – [18]. Desuden er galectin-1-ekspression forhøjet i lungekræft væv sammenlignet med et normalt lungevæv [19]. For nylig blev der fundet forhøjede niveauer af galectin-1 ekspression til at fremme lungekræft progression og kemoresistens [20], mens øget galectin-4-ekspression viste sig at forudsige lymfeknudemetastase i adenokarcinom i lungen [21]. Alle disse resultater viser den prognostiske potentiale galectins i lungekræft. Men om galectin ekspression også kan anvendes til at skelne mellem tidlige stadium NSCLC patienter med god eller dårlig prognose er ikke blevet fastslået. Derfor er formålet med denne undersøgelse var at bestemme, om måling af galectin mRNA-ekspression kunne tjene som en indikator for klinisk resultat hos patienter med stadium I /II NSCLC ved hjælp af en multivariable model.

Materialer og Metoder

Etisk erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af den lokale intern revision board (Maastricht Patologi Tissue Collection, https://www.pathologymumc.nl/research/external-projects/maastricht-pathology-tissue-collection- MPTC) og følger anbefalingerne vejlede læger i biomedicinsk forskning med menneskelige forsøgspersoner, som er fastlagt i Helsinki-erklæringen. I overensstemmelse med om etik, gjorde brug af anonymiseret væv fra vævet banken ikke kræver særlig skriftlig tilladelse.

Patienter

Den nuværende undersøgelse omfattede tumor prøver af patienter med stadium I /II NSCLC, som gennemgik en anatomisk helbredende resektion på det akademiske sygehus Maastricht mellem 1994 og 2004 [22]. Eksklusionskriterier var 1) Forrige anden malignitet, 2) Udvikling af en uafhængig malignitet under en opfølgning på mindst 4 år, eller 3) Neo-adjuverende behandling.

Specimen egenskaber

resekteres materiale blev opbevaret ved -80 ° C som en del af Maastricht Patologi Tissue Collection. Kun væv fra patienter med stadium I /II-sygdom og med en tumor område 50% (gennemsnit 65,9%, 95% CI: 59,9-71,9), som vurderet i hæmatoxylin /eosin farvede snit af en erfaren patolog (R-JVs), blev anset for berettiget til yderligere undersøgelser.

Studie design

Vi retrospektivt analyseret tumorvæv fra scenen i /II NSCLC patienter, som gennemgik helbredende resektion kirurgi mellem 1994 og 2004 på det akademiske sygehus Maastricht. I alt blev 87 patienter inkluderet. Patienterne modtog ingen forudgående behandling og ikke har en historie af eller udvikle ubeslægtede maligniteter op til 4 år efter operationen. Opfølgningen var mindst 5 år, hvor patienterne blev undersøgt rutinemæssigt hver 3. måned de første 2 år og derefter hver 6. måned. Kliniske endepunkter omfattede samlet overlevelse (OS) og sygdomsfri overlevelse (DFS). Samlet overlevelse var tiden i måneder fra operationsdagen indtil den dag, død uanset årsag. Sygdom overlevelse var tiden i måneder fra operationsdagen indtil dagen tumor tilbagefald, enten locoregional eller fjernt. Kandidat variabler, der blev anset for at indgå i modeller omfattede mRNA ekspressionsniveauerne af hver galectin (i 2∧-deltaCt), alder (i år), fase (I eller II), køn, histologi (pladecellekræft eller andet), rygning status ( tidligere eller andet). Antallet af patienter inkluderet blev bestemt af tilgængeligheden af ​​tumorprøver. Inden for denne stikprøve størrelse, cirka 50 indtrådt forhold, som gjorde det muligt for inklusion af 5 variabler for multivariabel analyse for at undgå risikoen for over-montering

Cell kulturer

Følgende cellelinjer blev anvendt:. A549 humane alveolære carcinom (ATCC CCL-185), H460 humane storcellet carcinom (ATCC HTB-177), H1650 human bronchoalveolær carcinom (ATCC CRL-5883), H1975 human ikke-småcellet lungekræft (ATCC CRL-5908), H3255 human ikke-småcellet lungekræft (ATCC CRL-2882, udgået). Alle cellelinier blev dyrket i RPMI (Invitrogen) suppleret med 10% føtalt kalveserum, penicillin (50 U /ml) og streptomycin (50 mikrogram /ml). Celler blev holdt ved 37 ° C og 5% CO

2 i en fugtig inkubator.

RNA-isolering og cDNA-syntese

Totalt RNA blev isoleret fra 10 x 10 um tyk frosne vævssnit eller fra dyrkede celler under anvendelse af RNeasy kittet (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. I tilfælde af tumorvæv blev yderligere snit før og efter serien af ​​10 for H /E-farvning og evaluering af den procentdel af tumor område. Genomisk DNA-kontaminering blev fjernet ved på søjle DNAse behandling. Koncentrationen og renheden af ​​RNA blev analyseret ved hjælp af NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies). Efterfølgende blev cDNA-syntese udført med iScript cDNA Synthesis Kit (Biorad) ved hjælp af 0,5 til 1,0 mikrogram total RNA.

Real-time qPCR

qPCR blev udført på en iQ5 Multicolour Real-Time PCR Detection System (BioRad) eller CFX96 (BioRad) ved anvendelse af iQ SYBR Green PCR Master mix (BioRad) ved anvendelse af 400 nmol /l af de passende primere som er blevet beskrevet før [23]. For at skelne mellem de forskellige galectin-9 splejsning varianter følgende primere blev anvendt: gal-9FL frem GCAGACAAAAACCTCCCG, gal-9FL omvendt CCCAGAGCACAGGTTGATG, gal-9Δ5 frem ATCAGCTTCCAGCCTCCC, gal-9Δ5 omvendt CCCAGAGCACAGGTTGATG, gal-9Δ5 /6 frem CTACATCAGCTTCCAGACCCA, gal- 9Δ5 /6 omvendt CCCAGAGCACAGGTTGATG. qPCR for disse splejsningsvarianter blev udført under anvendelse Sensimix (Quantace) ved Tm = 61 ° C. Alle primere blev syntetiseret af Eurogentec.

Western blot-

Western blot blev udført ifølge standardprotokoller. Kort fortalt, 5 til 10 10 um tykke crysections blev suspenderet i 60 pi Laemlli prøvebuffer (Biorad) suppleret med 01:20 β-mercapto-ethanol. Prøver blev kogt i 5 minutter og straks separeret ved gelelektroforese på en 15% polyacrylamidgel og overført til PVDF-membraner (Millipore). Membraner blev blokeret med Oddyssey blokeringsbuffer (LI-COR Biosciences) i 1 time og inkuberet natten over ved 4 ° C med enten kanin-anti-galectin-1-antistof (Peprotech) eller gede-anti-galectin-9-antistof (R Peprotech) og gede-anti-galectin-9 (1:500; R & D Systems) antistoffer ifølge hvilken specificitet blev bestemt før [23]. Farvning blev visualiseret under anvendelse af StreptABComplex /HRP kit (Dako). Snittene blev modfarvet med hematoxylin (Merck), dehydreret, og monteret i Depex (BDH Prolabo). Blinded scoring af galectin-1 og galectin-9 blev udført på tre forskellige rum i tumoren, dvs. tumorcellerne, tumor stroma og de tumor endotelceller. For scoring af galectin-1 og galectin-9 hyppigheden af ​​farvning blev bestemt ved anvendelse af følgende skala: 0 = ingen eller næsten ingen celler positive, 1 = lille brøkdel af celler positive, 2 = ca. halvdelen af ​​cellerne positive, 3 = mere derefter halvdelen af ​​cellerne positive, 4 = alle eller de fleste celler positive. Alle farvninger blev scoret af mindst to uafhængige personer.

Statistisk analyse

Bivariable Pearson korrelationskoefficienter blev beregnet til at studere forholdet mellem galectin mRNA ekspression niveauer (2

-ΔCt), klinisk parametre, og /eller immunohistokemisk farvning scores. For at identificere de vigtigste prædiktorer for patienternes resultat blev anvendt en fremgangsmåde i to trin. Først blev univariable associationer mellem OS eller DFS med kliniske parametre eller hvert galectin undersøgt ved hjælp af Cox regressionsanalyse. Dernæst blev multivariable Cox regressionsanalyse med fremad udvælgelse udført på de væsentligste galectin prædiktorer identificeret i univariable analyse, dvs. gal-1 (kategoriske), gal-9FL (kategoriske), gal-9Δ5 (kategoriske), sammen med alderen (kontinuerlig ) og fase (kategoriske), med enten OS eller DFS som resultatet. Analysen omfattede Kaplan-Meier Overlevelsesestimaterne med log rank test blev udført for at bestemme median OS eller DFS. Median mRNA ekspressionsniveauer blev anvendt som afskæringsværdi at opdele patienterne i en høj ekspression gruppe (over median) og lav ekspression gruppe (under median). Konfidensintervaller for median overlevelse blev beregnet efter Bonnet et al. [24]. Alle statistiske beregninger blev udført i SPSS20.0.0.

Resultater

Angivelse af galectin mRNA i tidlig fase NSCLC og lungekræft cellelinier

Vi udførte omfattende galectin genekspression analyse en retrospektiv undersøgelse af resektion tumorvæv stammer fra 87 patienter diagnosticeret med tidlig fase (fase i /II) NSCLC. Den mediane alder af patienterne var 65,5 år (interval 37,4-85,5) og opfølgning var mindst 5 år, hvor 47 patienter (54,0%) præsenterede tilbagevendende sygdom og 50 patienter døde (57,5%). Den mediane samlede overlevelse (OS), defineret som tiden mellem dagen for operationen indtil dag af død, var 48,7 måneder (95% CI 33.1-64.2 måneder). Sygdomsfri overlevelse (DFS), defineret som tiden mellem dagen for operationen indtil dag af locoregional eller fjernmetastaser, var 33,3 måneder (95% CI 34.8-49.6 måneder). De overordnede demografiske og standard prognostiske variabler af patientgruppen er anført i tabel 1.

For at få indsigt i den prognostiske værdi af galectin udtryk i fase I /II NSCLC vi først afgøres, hvilken galectins udtrykkes i NSCLC tumorvæv. qPCR analyse med tidligere validerede primere rettet mod alle kendte humane galectins [23] viste, at seks galectins, dvs. galectin-1, -3, -4, -7, -8 og -9, kunne detekteres mRNA-ekspression (figur 1A ). Fordi omfattende splejsning er blevet rapporteret for galectin-9 [23], [25], [26], vi også bestemt mRNA ekspressionen af ​​de mest almindelige galectin-9 splejsningsvarianter, dvs. galectin-9 fuld længde (FL), galectin- 9 med en sletning af exon 5 (Δ5), og galectin-9 med en sletning af exons 5 og 6 (Δ5 /6). Alle tre varianter var påviselige med gal-9Δ5 som den dominerende variant (figur 1A, indsat). Protein ekspression af de forskellige galectin familiemedlemmer blev bekræftet ved screening immunohistokemiske farvninger rådighed i det humane protein atlas [27] (figur 1B). Protein ekspression af de forskellige galectin-9 splejsningsisoformer blev yderligere bekræftet ved Western blot-analyse (figur 1C). Endvidere ekspressionsprofil på forskellige lungecancer-cellelinjer bekræftede, at ekspression var begrænset til galectin-1, -3, -4, -7, -8 og -9 (fig S1). Dette bekræfter med en undersøgelse af Lahm et al. som analyserede ekspressionen af ​​multiple galectins i et bredt panel af cancercellelinjer [28]. Alle disse resultater viser, at galectin-1, galectin-3, og galectin-8 er de mest rigeligt udtrykt galectins mens ekspressionen af ​​galectin-4, galectin-7, og galectin-9 er forholdsvis lav, både i tumorvæv og i forskellige lunge cancer cellelinjer.

det indsatte viser ekspression af de tre galectin-9 splice varianter. (B) Billeder af immunhistokemisk farvning af galectins med påviselig mRNA-ekspression i NSCLC [27]. (C) Western blot-analyse af galectin-9 isoform-ekspression i NSCLC tumorvæv fra 5 forskellige patienter. Tre bands på forventede molekylvægte galectin-9FL, galectin-9Δ5 og galectin-9Δ5 /6 blev observeret ved varierende intensitet.

Forholdet mellem galectin mRNA-ekspression og kliniske parametre i tidligt stadium NSCLC

Analyse af forholdet mellem de forskellige galectin mRNA ekspressionsniveauer udviste en signifikant positiv korrelation mellem total galectin-9 og de særlige galectin-9 splejsningsvarianter, dvs. gal-9FL (r = 0,48), gal-9Δ5 (r = 0,85 ), og gal-9Δ5 /6 (r = 0,52). Inden disse splejsning varianter var der en signifikant sammenhæng mellem gal-9FL og gal-9Δ5 (r = 0,44) samt mellem gal-9Δ5 og gal-9Δ5 /6 (r = 0,53). Væsentlige korrelationer blev også observeret mellem galectin-3 og gal-9FL (r = 0,34) og mellem gal-4 og gal-9Δ5 /6 (r = 0,31). Ingen signifikante korrelationer blev fundet mellem mRNA ekspressionsniveauer i de øvrige galectins. Med hensyn til forholdet mellem galectin mRNA udtryk og de kliniske parametre, dvs. alder, scene, køn, histologi, og rygning status, vi observerede en svagt signifikant sammenhæng mellem køn og gal-9Δ5 (r = 0,24) og mellem alder og henholdsvis gal-1 (r = 0,26), gal-9 (r = -0,25) og gal-9Δ5 (r = -0,30). Ingen signifikant sammenhæng mellem galectin mRNA udtryk og de resterende parametre, dvs. histologi, scene, og rygning status, blev fundet.

associering mellem galectin mRNA-ekspression og prognose i tidlig fase NSCLC

Dernæst univariable Cox regressions analyser blev udført for at vælge de markører med den stærkeste association med OS (tabel 2) og DFS (tabel 3). Denne identificeret fase, gal-1, gal-9FL og gal-9Δ5 som mulige prognostiske faktorer for både OS og DFS tidligt stadie NSCLC patienter. Efterfølgende Kaplan-Meier-analyser blev anvendt til at estimere median OS og DFS hos patienter, der udtrykte en bestemt galectin under eller over medianen mRNA udtryk niveau. Patienter, der udtrykte galectin-1 ovenfor median niveauer haft en betydelig kortere OS og DFS (figur 2A og tabel 4). Den univariable Cox modellen også identificeret to splejsningsvarianter af galectin-9, dvs. gal-9FL og gal-9Δ5, som eventuelt er forbundet med både OS og DFS. Faktisk patienter med enten gal-9FL eller gal-9Δ5 ekspressionsniveauer under medianen havde signifikant kortere OS samt kortere DFS (figur 2B + C og tabel 4). Ingen af ​​de andre galectins var signifikant associeret med OS eller DFS. Vejviser

Endelig blev multivariable Cox regressionsanalyse udført med fremad udvælgelse af de væsentligste faktorer, der er identificeret i univariable analyser, dvs. stage, alder, galectin-1 galctin-9FL og galectin-9Δ5. Disse analyser viste, at for OS, den mest betydningsfulde prognostiske model omfattede fase, alder, gal-1 og gal-9Δ5 mens modellen for DFS inkluderet fase, alder og gal-9Δ5 (tabel 5).

lokalisering og distribution af galectin-1 og galectin-9 proteinekspression i tidlig fase NSCLC væv

for at få mere indsigt i lokaliseringen og distribution af galectin-1 og galectin-9 protein vi udførte immunhistokemiske farvninger på et repræsentativt undergruppe af tumorer (n = 45). Galectin-1 blev bredt udtrykt i de fleste tumorvæv. Udtrykket i tumorcellerne varierede mellem tumorer samt inden tumorer, med nogle væv viser ingen positive tumorceller, mens i andre væv tumorcellerne var stærkt positiv. Fleste væv viste positiv farvning i stroma samt i tumoren endotelceller (Figur 3A). Galectin-9-farvning var mindre fremtrædende i forhold til galectin-1. Faktisk blev positive tumorceller kun sjældent observeret selvom nogle væv syntes at vise en gradient med stigende galectin-9 niveauer i tumorcellerne tættere på det stromale væv (figur 3B). Både stroma og de tumor endotelceller farvet positive oftere (figur 3B).

Farvning blev observeret i tumorceller rum (T), stromal rum (S) og i tumor endotelceller (pile). Den indsatte til venstre viser isotypekontrol farvning. Scale bar = 50 mikrometer. De søjlediagrammer viser kvantificering af IHC scoringer for galectin-1 og galectin-9 i forskellige tumor rum.

Efterfølgende Pearson korrelation analyse af farvning scoringer viste, at der var en signifikant omvendt korrelation mellem score på galectin-1 og galectin-9 i tumorcellerne (korr. coef. -0,36), mens der var en positiv korrelation mellem galectin-1 og galectin-9 protein score i tumor endotelceller (korr. coef. 0,44). Imidlertid blev hverken de galectin-1 eller galectin-9 protein farvning scoringer forbundet med OS eller DFS. Endvidere var der ingen sammenhæng mellem IHC scores og mRNA-niveauer.

Diskussion

Vi evaluerede den prognostiske betydning af galectin mRNA-ekspression i patienter med stadie I /II ikke-småcellet lungekræft. Univariable Cox regression analyser blev anvendt til at vælge et sæt af de mest prognostiske kliniske parametre og galectins. Disse blev efterfølgende anvendt i en multivariabel analyse til at generere en model, der kunne tjene til at forudsige OS eller DFS i patienter med stadium I /II NSCLC. Det vigtigste resultat af denne undersøgelse er, at for at forudsige OS, den mest betydningsfulde prognostiske model omfattede fase, alder, gal-1 og gal-9Δ5 mens modellen for DFS inkluderet fase, alder og gal-9Δ5.

Galectins har tidligere været forbundet med lungekræft progression [16], [17], [29]. Vores observation, at patienter, der udtrykker galectin-1 ovenfor median niveauer har en betydelig kortere samlet er i overensstemmelse med disse undersøgelser [16], [17] samt med studier i andre typer af kræft [30]. Den prognostiske værdi af galectin-1 blev bekræftet i multivariabel analyse. Galectin-3, som også er blevet forbundet med dårlig resultat sygdom i lungekræftpatienter [16], [17], ikke nåede statistisk signifikans i vores patientgruppe. Dette bestyrker med to nyere undersøgelser [31], [32]. På den anden side er det blevet foreslået, at cellulære lokalisering af galectin-3, dvs. nuklear vs. cytoplasmatiske kunne være af prognostisk værdi for tilbagefald [33]. Vi har kun målt galectin-3 mRNA ekspressionsniveauerne og ikke bestemme den cellulære lokalisering af galectin-3 proteinekspression i vores patientgruppe. Således kan vi ikke udelukke, at disse parametre kunne være af prognostisk værdi i fase I /II NSCLC patienter.

En roman fund af den aktuelle undersøgelse var identifikation af en specifik gal-9 splice variant, dvs. galectin-9Δ5 som en prognostisk markør i NSCLC. Brug multivariabel Cox regressionsanalyse vi nu observeret, at lav galectin-9Δ5 udtryk blev forbundet med dårlig OS og DFS i tidlige stadie NSCLC patienter. Disse observationer er i overensstemmelse med andre rapporter, hvori galectin-9-ekspression blev omvendt korreleret med kræft progression og patientoverlevelse i en række forskellige typer cancer, herunder hudcancer, levercancer og brystcancer [34] – [36]. For nylig Jiang et al. identificeret galectin-9 udtryk som en selvstændig prognostisk faktor i en retrospektiv undersøgelse af 305 patienter med mavekræft. Igen blev lav galectin-9-ekspression er forbundet med ringe overlevelse [37].

galectin-9Δ5 er en af ​​de tre hyppigst identificerede galectin-9 varianter. Disse splejsning varianter koder proteinisoformer der varierer i længden af ​​linker-regionen mellem de to CRD-domæner som påvirker multimerdannelse og valens [38], [39]. Tidligere data antyder, at de forskellige galectin-9 isoformer har en divergerende rolle i tumorceller, f.eks de forskelligt påvirke adhæsionen af ​​celler til ECM og til endotelet [40]. Generelt har ændret galectin-9-ekspression blevet forbundet med unormal celleadhæsion, vækst og migration [39]. Andre har beskrevet, at galectin-9 kan påvirke celleoverlevelse samt homo- og heterotypisk celleaggregering [9], [34], [40] – [43]. Tab af galectin-9 udtryk kan kompromittere vævsintegritet tillader tumorceller at intravasate i omløb og metastaserer. Ja, i brystcancer lav galectin-9-ekspression var en bedre indikator for fjernmetastaser sammenlignet med lymfeknude-status [42]. Lignende observationer blev gjort i melanom og cervikal pladecellecarcinom [34], [44]. Men disse virkninger afhænger af flere parametre, herunder de specifikke galectin-9 variant af celletypen og adhæsionen matrix komponent, som cellerne binder [45]. Hvorvidt og hvordan alle disse parametre har indflydelse lungekræft progression kræver yderligere undersøgelser. Eventuelt kan galectin-9 virke som en kemoattraktant for lunge- cancerceller lignende som beskrevet for eosinofiler [46], [47] eller endotelceller [26]. Sammen med vores observation, at stroma galectin-9Δ5 udtryk forbliver forhøjet i lunge tumorer denne chemoattracting aktivitet indikerer, at galectin-9Δ5 kan virke som en vejledning cue for metastatiske tumorceller at migrere til det sted intravasation, dvs. karrene. Dette kunne fremme tumormetastase især hvis tab af galectin-9 i tumorceller resulterer i tab af væv integritet [45]. Endelig er det blevet rapporteret, at i dyremodeller og kræftpatienter, kan tumorceller frigive galectin-9 indeholdende exosomer der kan inducere T-celle apoptose [48], [49]. Hvorvidt tumor endotelceller udskiller også galectin-9 indeholder exosomer skal undersøges nærmere, men en sådan mekanisme kunne bidrage til tumorprogression ved at give en måde at undslippe immun overvågning.

immunhistokemisk vurdering af galectin-1 og galectin- 9-protein-ekspression viste forskelle i lokalisering og fordeling i tumorvævet. Disse observationer er i overensstemmelse med tidligere resultater i forskellige tumorer, hvor der kunne påvises både galectin-1 og galectin-9 proteiner i forskellige rum i tumoren, herunder tumorceller, tumor stroma og tumor endotelceller [17], [23], [ ,,,0],30], [42], [44]. Alligevel proteinekspression havde nogen prognostisk værdi i vores patientgruppe. Sandsynligvis er dette relateret til det faktum, at immunhistokemisk farvning repræsenterer en mere kvalitativ vurdering snarere end en kvantitativ analyse. Således faktiske protein ekspressionsniveauer kunne ikke nøjagtigt kvantificeres ved IHC-farvning. Endvidere ingen galectin-9 antistoffer er tilgængelige, der genkender specifikke splejsningsvarianter. Dette antyder, at i tilfælde af tidlig fase NSCLC patienter, bestemme galectin mRNA-niveauer er af mere værdi for prognose skøn i forhold til immunhistokemisk farvning.

Den vigtigste begrænsning af den foreliggende undersøgelse er den relativt lave stikprøvestørrelse på 87 i forhold til det store antal parametre, der blev analyseret. Prøven tilladte størrelse inddragelsen af ​​kun 5 kovariater i regressionsmodellen for at minimere risikoen for over-fitting. Desuden har vi kun medtaget tidlige stadie NSCLC patienter. Således yderligere undersøgelser med store patientgrupper og herunder også senere stadier af NSCLC, dvs. stadie III /IV, kan give mere indsigt i den prognostiske værdi af galectin mRNA-ekspression profilering.

Sammenfattende profilering omfattende galectin udtryk bekræftet den prognostiske værdi af galectin-1 og identificeret gal-9Δ5 som et potentielt nye prognostiske markører i tidligt stadium NSCLC. Identifikation af sådanne markører er vigtigt at identificere patienter, der vil drage fordel af adjuverende kemoterapi. Derudover vores resultater eksemplificerer relevansen af ​​profilering individuelle splejsningsvarianter af galectin-9. Det er endnu ikke fastslået, om splejsningsvariant-specifik profilering har en lignende fordel i andre typer kræft, herunder dem, hvor den samlede galectin-9 udtryk er en prognostisk markør.

Støtte oplysninger

figur S1.

galectin mRNA-ekspression profil i forskellige NSCLC linjer. Det indsatte viser ekspression af de tre galectin-9 splejsningsvarianter

Doi:. 10.1371 /journal.pone.0107988.s001

(TIF)

anerkendelser

Forfatterne ville gerne takke Dr. F. Galindo Garre for statistisk rådgivning og E. Aanhane til teknisk bistand.