PLoS ONE: Expression og funktion Androgen receptor coaktivator P44 /Mep50 /WDR77 i æggestokkene Cancer

Abstrakt

Hormoner, herunder østrogen og progesteron, og deres receptorer spiller en vigtig rolle i udviklingen og progressionen af ​​ovariecancer . Androgen, dens receptor og coaktivatorer har også været impliceret i disse processer. p44 /Mep50 /WDR77 blev identificeret som en underenhed af methylosome kompleks og sidst karakteriseret som et steroid receptor coaktivator, der forbedrer androgen receptor samt østrogen receptor-medieret transkriptionel aktivitet i en ligand-afhængig måde. Vi har tidligere beskrevet særskilt udtryk og funktion af p44 i prostata, testikel, og brystkræft. I denne rapport, undersøgte vi udtryk og funktion af p44 i kræft i æggestokkene. I modsætning til resultaterne i prostata og testikelkræft og ligner brystkræft, P44 viser stærk cytoplasmatisk lokalisering i morfologisk normale æggestokkene overflade og æggeleder epitel, mens der observeres nukleare P44 i invasiv ovariecancer. Vi observerede, at p44 kan tjene som en coaktivator af både androgen receptor (AR) og østrogen-receptor (ER) i ovarieceller. Endvidere overekspression af nuklear-lokaliserede p44 stimulerer proliferation og invasion i ovariecancerceller i nærvær af østrogen eller androgen. Disse resultater antyder kraftigt, at p44 spiller en rolle ved mediering af virkningerne af hormoner i æggestokkene tumorigenese

Henvisning:. Ligr M, Patwa RR, Daniels G, Pan L, Wu X, Li Y, et al. (2011) Ekspression og funktion Androgen receptor coaktivator P44 /Mep50 /WDR77 i kræft i æggestokkene. PLoS ONE 6 (10): e26250. doi: 10,1371 /journal.pone.0026250

Redaktør: Ilya Ulasov, University of Chicago, USA

Modtaget: Marts 7, 2011; Accepteret: September 23, 2011; Udgivet: 13. oktober 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af Northwestern Memorial Hospital Dixon Translationel Research Fund tilskud til JJW. Den bidragyder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den femte hyppigste dødsårsag af kræft hos kvinder, og den anden mest dødelige gynækologisk malignitet i USA [1]. Epiteliale ovariecancer tegner sig for omkring 3% af de samlede kræfttilfælde hos kvinder. National Cancer Institute anslås, at i 2010, ville 21.880 kvinder blive diagnosticeret og 13,850 kvinder ville dø af kræft i æggestokkene [2].

Kræft i æggestokkene er en gruppe af heterogene sygdomme og består af forskellige histologiske typer, der kan let differentieres ved histologisk evaluering [3]. Aktuelle kliniske retningslinjer fastsat af Verdenssundhedsorganisationen skelne otte histologiske tumor undertyper: papillær serøs karcinom (PSC), endometrioide carcinom (EMC), mucinøs carcinom (MUC), klar celle carcinom (CCC), overgangsordning celle carcinom (TCC), planocellulært , blandet epitel, og udifferentierede, med serøs carcinoma viser den mest maligne fænotype [4], [5]. Genom-bred global genanalyse definerer yderligere særskilte udtryk profiler af forskellige typer ovariecancer [6]. Forskellige histologiske typer ovariecancer synes at blive reguleret af forskellige patogene pathways [7]. Mest EMC og PSC foreliggende moderate til høje niveauer af ER [8], [9], [10] og AR-ekspression [11], [12].

steroidhormonreceptorer, såsom ER, progesteronreceptor ( PR), og AR er involveret i udviklingen af ​​endokrine organer kræftformer, herunder ovariecancer [12], [13], [14]. Østrogener er kendt for at være regulatorer af vækst og differentiering i normale ovarier, samt i udviklingen af ​​ovariecarcinom, men mekanismen ved denne hormonelle regulering forbliver tvetydig. Østrogen virker via to nukleære receptorer, østrogenreceptor alfa (ERa) og østrogen receptor beta (ERp), der binder til et østrogen respons element (ERE) i promotorregionen af ​​målgener, der regulerer deres transkriptionsaktivitet [15]. Tilsvarende AR er også en ligand-aktiveret transkriptionel faktor. Bindingen af ​​androgen til AR resulterer i kernelokalisering af hormonet-receptor-komplekset sammen med coaktivatorer og basal transkriptionel maskineri. Når i kernen det derefter binder til en androgen reaktionselement (ARE), der regulerer ekspressionen af ​​målgener [16].

AR er en udbredt sex steroid receptor udtrykt i ovariecancere. Eighty-fire procent af tumorer udtrykker AR, mod kun 74% af tumorer, der udtrykker ER og 41% udtrykker PR [17]. Der er en højere risiko for ovariecancer i post menopausen, på hvilket tidspunkt androgener er de primære steroider udskilt af ovariet [18]. Høj ekspression af PR er associeret med god prognose i multivariant analyse for ovariecancer [19]. Men resultaterne er kontroversielle for korrelationen af ​​disse tre receptorer med prognose og overlevelse hos patienter [12], [20].

p44 er en 44 kDa AR-interagerende protein, som har vist sig at øge AR transkriptionsaktivitet. Den indeholder 342 aminosyrerester og fire formodede WD40 gentagelser [21]. Endvidere eksisterer p44 i en methylsome kompleks med arginin methyl transferase 5 (PMRT5), og er også en underenhed af overlevelsen af ​​motoriske neuroner (SMN) kompleks [22]. På grund af phosphorylering af sin underenhed, SMN komplekset er aktiv i cytoplasmaet, hvor det fremmer U snRNP samling [23]. Udtrykket og funktion af p44 protein er blevet rapporteret i prostata, testikel, og brystkræft. Interessant, vi observerede tydelige mønstre af udtryk og funktion i disse reproduktive organer [21], [24], [25]. Vi fandt distinkt intracellulær lokalisering af p44 i godartede (som nuklear protein) og maligne (som cytoplasmatisk protein) prostatavæv. Nuklear ekspression af p44 inhiberer prostatakræft vækst under indflydelse af androgen [21]. I modsætning hertil blev p44 udtrykt som et cytoplasmatisk protein i godartet brystepitel og som et kerneprotein i brystkræft. Nuklear p44 fremmes brystkræft cellevækst i nærvær af østrogen [21], [24]. Vores resultater indikerer, at P44 fungerer som en cofaktor påvirke organspecifik tumorigenese i sex steroid hormon-regulerede tumorer.

I denne undersøgelse undersøgte vi ekspressionen af ​​p44 i benigne og maligne humane ovarieceller. Vi fandt, at p44 differentielt blev udtrykt i forskellige typer ovariecancer. I endometrioide og serøse ovariecancer, blev p44 udtrykt som en nuklear protein. Imidlertid p44 blev udtrykt som et cytoplasmatisk protein i benign ovarie (OSE), æggeleder (FT), og endometrisk (EM) epithel. Vores data indikerer også, at AR og ER spille en rolle i reguleringen af ​​den nukleare-cytoplasmatisk translokation af P44 i kræft i æggestokkene og efterfølgende kræft cellevækst og invasion.

Resultater

Expression og cellulære lokalisering af AR coaktivator P44 i human ovariecancer: potentiel regulering af lokalisering af androgen og østrogen

for at afgøre om P44 er forbundet med ovariecancer, vi undersøgte P44 udtryk i godartet æggestok, endometrie, og fallopian rør væv og forskellige histotypes af ovariecarcinomer ved immunohistokemi. For at bestemme den cellulære lokalisering af p44, ekspressionen af ​​p44 i cytoplasmaet og kerner blev semikvantitativt scorede separat (se Materialer og fremgangsmåder).

p44 var immunoreaktive i både cytoplasma og kerner. I normale væv, herunder FT, EM, og OSE, der var højere p44 immunoreaktivt i cytoplasmaet end i kerner (cytoplasmatiske nuklear forholdet var ca. 02:01, figur 1 B). I alle 5 typer af ovariecarcinomer, herunder MUC, CCC, EMC, serøs borderline (SBT), og PSC, var der en stigning af nuklear immunoreaktivitet for P44 i forhold til cytoplasma (figur 1A, tabel 1), selv om nuklear P44 niveauer varierede mellem forskellige histologiske typer af kræft i æggestokkene. SBT havde den højeste immunreaktivitet for p44 i kerner og MUC havde den laveste (figur 1B, S1). Multiple ANOVA-analyse viste, at der var betydelige forskelle på P44 immunoreaktivitet i kerner mellem godartede (FT: 0,89 ± 0,17; EM: 0,55 ± 0,15; OSE: 0,54 ± 0,14) og ondartede (CCC: 1,64 ± 0,13; EMC: 1,71 ± 0,16; PSC: 2,06 ± 0,14, og SBT: 2,67 ± 0,17) epithel (p 0,01). Parret t-test viste, at der var signifikant forskel på p44 immunoreaktivitet i kerner parvis mellem FT og PSC, OSE og PSC, EM og EMC (p 0,05). PSC, EMC, og CCC karcinomer viste lignende immunointensity af P44 i kerner af ANOVA-analyse (p 0,05, figur 1B, S1). I modsætning hertil var der minimal forskel af cytoplasmatisk immunoreaktivitet for p44 mellem hver af benigne og maligne epiteler (p 0,05, figur 1 B). Generelt EMC, PSC, og SBT havde relativt rigelige ER udtryk og disse tumorer viste relativt højere P44 immunoreaktivitet i kerner (figur 1A, 1B, figur S1). Resultaterne af forskel i cellulær lokalisering af p44 mellem normale væv og æggestokkræft kan foreslå en rolle p44 som en østrogen receptor mægler i tumorigenese af kræft i æggestokkene.

A. Eksempler på P44 udtryk ved immunhistokemi i 4 forskellige histologiske typer af kræft i æggestokkene og normal æggeleder og endometrium (forstørrelse 200x). B. Semikvantitativ analyse af p44 immunointensity og dets cellulære lokalisering i fire forskellige histologiske typer af kræft i æggestokkene og normal æggeleder og endometriet. Mørke grå søjler er nukleare p44 og lys grå søjler er cytoplasmatisk P44. Små t-søjler repræsenterer standard fejl. C. Western blot-analyse af AR, ERa og ERp ekspression i forskellige cellelinier, herunder T29, SKOV-3, OVCAR-3. β-actin blev anvendt som en loading kontrol. Det primære antistof fortynding bruges til P44 var 1:5000, for AR 1:1000, for ERa og ERp 1:2000 og for β-actin 1:5000.

For at vurdere forholdet af p44 med AR og ER i ovariecancer, vi først undersøgt ekspressionsniveauerne for disse receptorer i de udvalgte ovarian cellelinier. Western blot-analyse afslørede, at p44-ekspression var højere i æggestokkene cancercellelinier OVCAR-3 og SKOV-3 end den godartede ovarie overflade epitel (OSE) cellelinie T29. Niveauerne af p44-ekspression positivt korreleret med ERa /β og AR udtryk (figur 1C). I særdeleshed fandt vi, at ERa udtryk var højere i SKOV-3 og omvendt, viste ERp isoform de højeste niveauer i OVCAR-3 cells.To bestemme p44 cellulære lokalisering og regulering af østrogen og androgen i benigne og maligne OSE celler, undersøgte vi lokalisering af p44 under tre forskellige medieforhold: hormon-frit medium og medium med definerede niveauer af enten androgen eller østrogen ved immunfluorescensmikroskopi. Som vist i figur 2, godartede T29 celler havde højere niveauer af cytoplasmatisk p44 og, til en vis grad, nuklear p44 i alle tre medier betingelser. I SKOV-3, blev p44 lokaliseret overvejende i kernen i hormon-frit, androgen (10 nM syntetisk androgen R1881) og østrogen (10 nM 17β-østradiol) medier (figur 2). I OVCAR-3 celler blev p44 lokaliseret i både kernen og cytoplasmaet i hormon-frit medium, og placeret til kernen i nærvær af enten androgen eller østrogen (figur 2).

p44 primært antistof og rhodamin -konjugeret kanin polyklonalt sekundært antistof blev anvendt. DAPI blev anvendt til at farve kerner. (Forstørrelse: 400x)

AR coaktivator P44 fungerer som både AR og ER coaktivator i ovarieceller

P44 er en co-aktivator af AR og ER og har tydelig udtryk i prostata og bryst celle linjer [21], [24]. For at bestemme om P44 fungerer som transskriptionsaktivator- i æggestokkene cancercellelinier, udførte vi en in vivo transkriptionel assay under anvendelse af dual luciferase reporter system. Vi transient transficeret T29 celler med vektor, som udtrykker p44 og enten et par vektorer, der udtrykker AR og en luciferase reporter under kontrol af fire androgen responselementer (figur 3A), eller ERa, og et luciferase reporter under kontrol af østrogen responselementer (figur 3B). I nærvær af androgen, p44 aktiveret androgenreceptor-drevet transkription på en dosis-afhængig måde, hvilket fører til så meget som 2,6 gange forøgelse af reporter-aktivitet sammenlignet med kontrollen. Ligeledes i nærvær af østrogen, p44 aktiveret østrogenreceptor-afhængig transskription på en dosis-afhængig måde: reportersignalet steget så meget som 4,5 gange sammenlignet med kontrol. Når p44 blev udtrykt alene, i fravær af enten AR eller ER blev der ikke observeret nogen virkning på reporteraktivitet både i nærvær og fravær af hormoner i medierne (data ikke vist), hvilket bekræfter p44-aktivering via hormonreceptorer. Disse resultater viste, at p44 faktisk fungerer som en co-aktivator af både androgen og østrogen receptorer i æggestokkene celler.

A. Vektorer indeholdende p44 og AR blev transficeret ind T29-celler sammen med en reporter vektor indeholdende luciferasegenet under kontrol promotoren indeholdende 4 androgen responselementer. B. Vektorer indeholdende p44 og ERa blev transficeret ind T29-celler sammen med ER-luc reporter vektor. Reporter aktivitet blev udtrykt som relative enheder.

AR coaktivator P44 fremmer æggestokkene vækst kræftcelle og invasion

For at dissekere effekten af ​​p44 på ovariecancer celleproliferation, vi først transficeret retrovirusvektorer udtrykkende NLS-p44 ind SKOV-3-celler. NLS-p44 er konstrueret med kernelokaliseringssignal (NLS) fusioneret i ramme til N-terminalen af ​​p44. SKOV-3 celler ikke er i stand til at reagere på østrogen aktivering [26], [27]. Efter bekræftelse af, at den transficerede p44 blev udtrykt, vi fortsatte med at analysere den proliferative status celler (figur 4A). I begge hormon-fri og østrogen-supplerede medier, overekspression af NLS-p44 havde ingen virkning på vækst af SKOV-3-celler (p 0,05). Men i nærværelse af androgen, overekspressionen af ​​NLS-p44 førte, til omtrent 33% reduktion i cellevækst (p 0,01). Mindske niveauerne af p44 ved at behandle SKOV-3-celler med den tilsvarende siRNA førte til lignende resultater. Mens i medier indeholdende androgen knockdown af p44 medførte -25% fald i væksthastighed (p 0,05), og -15% reduktion af vækst af cellerne i hormon-frit medium (p 0,05), var der ingen statistisk signifikant effekt af siRNA behandling på væksten af ​​celler i medium indeholdende østrogen (figur 4C). Da østrogenreceptoren i SKOV-3-celler er non-responderende for østrogen, er resultaterne validerede vores metoder til studiet

A, B:. SKOV-3-celler (A) og OVCAR-3 celler (B) blev transficeret enten med pBabe-NLSp44 overekspression vektor eller en kontrol vektor og dyrket enten i hormon-frit medium eller i nærvær af androgen eller østrogen. Overekspressionen af ​​p44 blev bekræftet ved Western blot (udtaget hver anden dag), og celler blev talt hver dag. C, D: SKOV-3-celler (C) og OVCAR-3 celler (D) blev behandlet med p44 siRNA hjælp Hiperfect og dyrket enten i hormon-frit medium eller i nærvær af androgen eller østrogen. SiRNA behandling blev gentaget hver anden dag. Overekspressionen og knockdown af p44 blev bekræftet ved Western blot (udtaget hver anden dag), og celler blev talt hver dag.

I modsætning til SKOV-3 cellelinie, de OVCAR-3 celler reagerer til østrogen stimulation [28]. Faktisk, når OVCAR-3 celler blev dyrket i medier suppleret med østrogen eller androgen (Figur 4B og D, åbne trekanter og firkanter), de begge viste forøget proliferation sammenlignet med celler dyrket i hormon-frit medium (55% og 40%, henholdsvis ). I modsætning til situationen i Skov-3 celler, observerede vi en stærk positiv effekt af nuklear P44 overekspression på vækst af OVCAR-3 celler i medier suppleret visne enten androgen eller østrogen. I nærvær af androgen, overekspressionen af ​​NLS-p44 resulterede i 1,5 gange stigning i vækstraten, og i nærvær af østrogen den observerede vækst induktion var 1,6 gange. Der var ingen signifikant påvirkning af cellevækst ved P44 overekspression i hormon-frie medier (figur 4B).

Vi observerede også en stærk, men negativ, effekt af udtømning af P44 i OVCAR-3 celler ved hjælp siRNA bekræftet proteinniveauet ved western blot-analyse. Mens overekspression af p44 havde ingen signifikant indflydelse på væksten i hormon-frit medium, knock-down af P44 protein niveauer førte til 25% reduktion af væksten i hormon-frit medium. I hormon-suppleret medier dukkede væksten reduktion forbundet med p44 udtynding endnu stærkere. I østrogen medier, p44 udtømning forårsagede 40% reduktion af tumorcellevækst rate, mens i nærvær af androgen denne forskel udgjorde 33% (figur 4D).

Vi yderligere testet P44 virkninger på celleinvasion evne anvendelse af en

in vitro

Matrigel invasion assay. Vi observerede øget invasionsevne af cellerne i medium suppleret med androgen sammenlignet med hormon-frit medium. Behandling af celler med østrogen ændrede ikke antallet af celler, der passerer membranen (figur 5A). Når vi overudtrykt NLS-p44 i SKOV-3-celler, var der ingen ændring i cellernes evne til at invadere gennem Matrigel membranen, enten i hormonfrit medium eller medier tilsat androgen eller østrogen. For at blokere endogen p44 udtryk, vi introducerede P44 siRNA i SKOV-3 celler. I medierne mangler hormoner, har udtømning af p44 ikke påvirke tumorceller invasion gennem Matrigel, da det ikke påvirker tumor invasion i østrogen-holdige medier. I medier tilsat androgen, manglende p44 udtryk faldt betydeligt celle invasion op til 3 gange (figur 5C)

A, B:. Skov-3 celler (A) og OVCAR-3 celler (B) var transficeret enten med pBabe-NLSp44 overekspression vektor eller en kontrol vektor; C, D: SKOV-3-celler (C) og OVCAR-3 celler (D) blev behandlet med p44 siRNA hjælp Hiperfect og dyrkes enten i hormonfrit medium eller i nærvær af androgen eller østrogen. Overekspressionen og knockdown af p44 blev bekræftet ved Western blot (se figur 4). Celler blev podet på Matrigel membraner i hormon-frie medier. Androgen eller østrogen blev anvendt som chemoatractants i nederste kammer.

Vi testede også virkningen af ​​p44 på invasion i OVCAR-3 celler. Svarende til SKOV-3 celler, stigning eller fald af p44-ekspression påvirkede ikke celleinvasion i hormon-frie medier (figur 5B, D). I androgen eller østrogen-suppleret medier, blev mere end fordobling af Matrigel invasion bemærket (figur 5B). Konsekvent, knockdown af P44 i OVCAR-3 celler resulterede i en dramatisk reduktion af invasion evne i hormon-suppleret medier.

Diskussion

Steroid hormoner er vigtige faktorer i udviklingen og progressionen af ​​æggestokkene kræft. De hormonreceptorer og deres co-faktorer er afgørende for hormon handling. Mest ovariecarcinomer, herunder serøse og endometrioide typer, vise forskellige niveauer af ER, PR, og AR-ekspression [12], [27]. Angivelse af køn steroidhormonreceptorer og deres cofaktorer i æggestokkræft give mål for anti-hormonbehandling. Således er det afgørende at karakterisere rolle kønshormoner og deres cofaktor-medieret tumorigenese i kræft i æggestokkene. Det er blevet rapporteret, at AR er en vigtig markør i ovariecancer [29], men de molekylære mekanismer for AR forbundet aggressiv ovariecancer adfærd [30], [31], [32] er stadig dårligt forstået.

i vores tidligere undersøgelser fandt vi, at AR coaktivator p44 spiller en vigtig rolle i både prostata og brystkræft, hvilket indikerer inddragelse af AR pathway i tumorigenese af disse endokrine organer. I denne undersøgelse har vi anvendt tilsvarende principper til at bestemme bidraget fra p44 til onkogene funktioner i ovariecancer tumorigenese, i forhold til androgen eller østrogen. Vi fandt, at cytoplasmatisk p44 udtrykkes kraftigt i godartet ovarie-, endometrie-, og æggeleder overflade epitelceller. Men i forskellige tumortyper, P44 har, differentielle cellulære ekspressionsmønstre, afspejlet i forskellige niveauer af cytoplasmatiske og nukleare lokaliseringer. p44 er betydeligt overudtrykt i high-grade serøst karcinom, endometrioide carcinomer, klar cellecarcinom, og serøse borderline tumorer (figur 1A). Især nukleare P44 udtryk er markant højere i kræft i æggestokkene væv end i deres matchede godartede kolleger, støtter den funktionelle rolle af nuklear P44 i tumorigenese af kræft i æggestokkene. Tilsvarende Western blot-analyse afslørede samme grad af p44 mellem OVCAR-3 og SKOV-3 (figur 1C), når cellerne blev dyrket i komplet medium (med phenolrødt og ikke-trækul strippet serum), men i androgen-suppleret medium, immunfluorescensfarvning viste, at p44 udtrykkes ved højeste niveau i kernen (figur 2). Det vil være af stor interesse for at afgøre, i fremtidige undersøgelser, om niveauerne af ER, AR og p44-ekspression er associeret med specifikke histologiske typer af kræft i æggestokkene, tumor kvalitet, etaper, og overlevelse.

For yderligere at definere den funktionelle roller p44, undersøgte vi p44 i benigne og maligne OSE cellelinier i nærvær og fravær af androgen eller østrogen. Vi anvendte godartet immortaliseret æggestokkene overflade epitelcellelinie T29 og to maligne æggestokkene cancercellelinier SKOV-3 og OVCAR-3 i denne undersøgelse. Det blev rapporteret, at SKOV3 ikke reagerer på østrogen, mens OVCAR-3 celler er lydhøre over for østrogen stimulation. Efter aftale, fandt vi, at østrogen ikke påvirkede p44 lokalisering, celleproliferation eller invasion i SKOV-3-celler, mens østrogen forøget p44 kernelokalisering, celleproliferation, og invasion i OVCAR-3 celler. Mens både ERa og ERp udtrykkes i Skov-3-celler (figur 1C), kan SKOV-3 non-responsivitet til østrogen skyldes mutation i ERa [27], hvilket indikerer funktionen af ​​p44 kan medieres af ERa, i stedet for ERp.

p44 signifikant forøget malign OSE celleproliferation og invasion i nærvær af androgen eller østrogen, hvilket viser, at ekspression af AR eller eR er nødvendige for p44 til at stimulere mitogenese og invasion (figur 1C). p44-medieret tumorigen funktion synes at være forskellige mellem prostata og ovariecancer. I prostatacancer, nuklear p44 inhiberer celleproliferation i en androgen-afhængig måde. I kræft i æggestokkene cellelinje OVCAR-3, nuklear P44 fremmer cellevækst. Navnlig bemærkes det, at nuklear p44 fremmer invasion i både androgen og østrogen medier. Resultaterne fra ovariecancer svarer til hvad vi observeret i bryst-. I brystcancer, nuklear p44 fremmer tumorcelleproliferation i en østrogen-afhængig måde [24]. Selvom vores siRNA-medieret Knockdown eksperimenter viste, at vores p44 antistof specifikt anerkendt et enkelt protein arter i prostata, bryst, og æggestok, kan vi ikke helt udelukke muligheden for, at meget beslægtede, men funktionelt distinkte proteiner (f.eks splejsning varianter af P44) fungerer som distinkte hormon receptor cofaktorer i hver af disse væv. Med denne advarsel, vores resultater tyder på, at p44 også kan virke gennem en ER-medieret funktionel vej i ovarievæv.

Sammenfattende angivet vores data nukleare p44 er involveret i kræft i æggestokkene spredning og invasion. Disse processer reguleres ved androgen og østrogen. P44 kan være et potentielt mål for behandling af kræft i æggestokkene.

Materialer og metoder

Case udvælgelse, TMA og IHC

Sagerne blev opsamlet efter kirurgi på Northwestern Memorial Hospital og New York University fra 1996 til 2009. Godkendelser af Institutional Research Board (IRB) fra begge institutioner blev opnået (undtaget). I alt 105 tilfælde af ovariecancer blev indsamlet til denne undersøgelse (tabel 1). Alle PSC og EMC sager blev hentet fra NYU vævsbanken og alle andre former for kræft i æggestokkene, samt normale kontrol væv, blev hentet fra NWU vævsbanken. Dette omfattede histologisk diagnose af high-grade papillær serøs carcinom (PSC, N = 32), serøs borderline tumor (SBT, N = 9), endometrioide ovariecarcinom (EMC, N = 34), mucinøs ovariecarcinom (MUC, N = 15 ) og klar celle ovariecarcinom (CCC, N = 15). Normale kontrol væv anvendt i denne undersøgelse omfattede: 30 normale æggeledere (FT, de nærmeste normale kontroller for høj kvalitet serøs karcinom), 20 normale endometrier (EM, de nærmeste normale kontroller for endometrioide karcinom), og 28 normale æggestokke (OSE, ovarie overflade epitel, som generel kontrol væv).

Alle karcinomer var æggestokkene primære. Tissue microarray (TMA) forberedelse er blevet beskrevet i vores tidligere undersøgelse [33]. Kort fortalt blev 0,6 og 1 mm væv kerner indsamlet fra hvert tilfælde af velbevarede tumor sektioner og høj tæthed TMA er udarbejdet i to på kvittering blokke.

Produktion, affinitet rensning, og specificitet af kanin polyklonale P44 anvendte antistof er tidligere blevet [34] beskrevne. Præimmunt serum blev anvendt som kontrol. Specificiteten af ​​p44 antistof blev bekræftet af en siRNA analyse, som viste reduceret P44 udtryk med p44 RNA-interferens [21]. De relative niveauer af p44-ekspression blev scoret semi-kvantitativt ved kombination af immunointensity [0 (negativ), 1+ (svag), 2+ (svag), 3+ (moderat), og 4+ (stærk) udtryk] og immunopercentage ( 1 som 0-10%, 2 som 10-50%, 3 som 50-75% og 4 som 75-100%)]. Statistiske analyser blev udført ved t-test.

Cellekultur og celleproliferationsassay

cellelinier SKOV-3 [35] og OVCAR-3 [28] blev opnået fra American Type Culture Samling. Den godartet immortaliseret ovarie overflade epitelcellelinie T29 [36], som tidligere beskrevet i detaljer, blev opretholdt i medium 199 og MCDB105 (Sigma). De to ovarian cancer cellelinjer SKOV-3 og OVCAR-3 blev dyrket i McCoys 5a medium (Invitrogen) og RPMI 1640 (Gibco) henholdsvis suppleret med 10% FBS og 1 U /ml penicillin og 1 ug /ml streptomycin. For at måle proliferationshastighed, 2 × 10

4-celler blev podet i plader med 6 brønde. På de relevante tidspunkter blev cellerne behandlet med 0,25% trypsin og 0,38 mg /ml EDTA (Gibco) og talt under anvendelse af et hæmocytometer (Reichert).

Western blot-analyse

Western blot analyse var anvendes til at kontrollere p44, AR, ERa, og ERp ekspression i komplet medium, knockdown af p44, og overekspression af P44 plasmider (pBabe vektor og pBabeNLSp44) i ovariale cellelinier. Cellerne blev enten dyrket i 10 cm skåle, 6 brønd eller brønd plader 24. Lysis buffer indeholdende protease cocktail inhibitor (Sigma) i 1:100 forholdet blev sat til pellets til resuspension. Proteinkoncentrationen blev målt under anvendelse Bio-Rad protein assay og passende mængde protein blev påsat for elektroforese på SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE). Proteinet blev derefter overført til nitrocellulose membran til Western blot-analyse. Membranerne blev blokeret i 1 time i 5% fedtfri tørmælk i Tris-bufret saltvand og Tween 20 (20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 150 mM NaCl og 0,1% Tween 20). Blots blev derefter inkuberet med antistoffer dannet mod AR, ERa, ERp (Santa Cruz Biotechnology), p44 og β-actin i 2 timer ved stuetemperatur, vaskes med Tris-bufret saltvand Tween 20 tre gange. Efter vaskene blev blots inkuberet i 2 timer med passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (GE Healthcare). Proteinbåndene blev påvist ved hjælp af forøget kemiluminescens-kit (GE Healthcare).

Immunfluorescerende mikroskopi

T29, SKOV-3, og OVCAR-3 celler blev dyrket ved to densities- 3 × 10

4 og 1 × 10

4 per brønd for tre forskellige medieforhold (hormon-fri, androgen og østrogen) på kamre dias. Cellerne blev først skyllet tre gange i PBS og fikseret i 20 minutter med 4% paraformaldehyd i PBS ved stuetemperatur. Efter fiksering blev cellerne permeablized med methanol og acetone (1:01) og inkuberet ved -20 ° C i 20 minutter. Cellerne blev vasket 3 gange i PBS og blokeret i 1 time med en opløsning af 5% BSA i TBS-T. Cellerne blev derefter inkuberet med p44 primært antistof (1:250) i 2 timer ved stuetemperatur. Efter inkubation med primært antistof blev cellerne farvet med rhodamin-konjugeret kanin-polyklonalt antistof (1:500) (Abcam) i 1 time i mørke ved stuetemperatur. For counter farvning DAPI blev påført (1:1000) og inkuberet ved stuetemperatur i 5 minutter i mørke. Den intracellulære lokalisering af P44 blev derefter undersøgt ved hjælp af Nikon Digital DXM1200 F mikroskop med Nikon-ACT-program.

RNA Interference assay

Tre siRNAs mest effektive til at reducere niveauet af p44 protein i ovarieceller blev samlet i ækvimolære mængder og anvendt i efterfølgende eksperimenter i almindelighed en koncentration på 100 nM (tabel 2). Scrambled siRNA (Ambion) blev anvendt som kontrol.

Celler blev dyrket i plader med 6 brønde til ønsket sammenflydning i 2 ml passende medium indeholdende serum uden antibiotika. 100 nM siRNA blev fortyndet i 423 pi Opti-MEM-medier (Gibco) uden serum, efterfulgt af 75 pi HiPerfect reagens (Qiagen) og inkuberet i 10 minutter ved stuetemperatur for at tillade dannelse af transfektionskomplekser. Cellerne blev derefter inkuberet med transfektionskomplekser under deres normale betingelser i 48 timer

Elektroporation

Tre plasmider -. PBabe vektor, pBabeNLSp44 [21], og GFP (kontrol) – blev transficeret ind i celler ved anvendelse af elektroporering. Cellerne blev dyrket i tre betingelser – hormon-fri, androgen (10 nM), og østrogen (10 nM). Cellerne blev dyrket til 80% konfluens. De pelleterede celler blev derefter resuspenderet i 100 pi Nucleofactor opløsning (82 pi opløsning 18 pi supplement opløsning) (Lonza) for hver reaktion. Fire ng plasmid blev derefter kombineret og celle /DNA suspension blev overført til elektroporation cuvette. Nucleofactor program anbefales til hver cellelinie af producenten blev valgt og anvendt. Efter elektroporation kuvetten blev fjernet, og cellerne straks overført til 10 ml af tilsvarende medium med FCS og inkuberet i 48 timer under normale vækstbetingelser.

Luciferase assay

In vivo reporter transskription blev udført bruger Dual-reporter Luciferase Assay System (Promega) ifølge producentens instruktioner. Lyseffekten blev målt ved Lumat LB9507 luminometer (Berthold).