PLoS ONE: HIF-1α inducerer multiresistens i Gastric Cancer Cells ved at inducere MIR-27a

Abstrakt

Denne undersøgelse havde til formål at bestemme korrelationen mellem HIF-1α og miR-27a udtryk og til at vurdere effekten af ​​hæmning af HIF-1α udtryk på miR-27a udtryk og resistens i gastrisk cancer ( GC). I den foreliggende undersøgelse blev realtid-PCR og Western blot udført for at detektere ekspression af HIF-1α i GC væv og cellelinier. Derefter blev OCUM-2MD3 /L-OHP-celler transficeret med HIF-1α-siRNA, en MIR-27a efterligner eller pcDNA-HIF-1α, og celleoverlevelse blev bestemt via MTT-assayet. Ekspressionen af ​​HIF-1α, MIR-27a, og MDR-beslægtede gener blev målt via realtid-PCR og Western blot. Chip og dobbelt luciferaseaktivitet blev udført for at vurdere den transkriptionelle regulering af HIF-1α og MIR-27a. Resultaterne viste, at transfektion med HIF-1α-siRNA markant nedsat niveauerne af MIR-27a, hvilket resulterer i drastisk forbedret inhibering af proliferation på OCUM-2MD3 /L-OHP celler. Sammenlignet med ikke-transficerede celler, blev overlevelsesraten betydeligt reduceret i cellerne transficeret med HIF-1α-siRNA efter behandling med L-OHP. Cellen overlevelsesrate var signifikant forøget i OCUM-2MD3 /L-OHP celler transficeret med miR-27a efterligner, mens HIF-1α overekspression ikke resulterede i nogen klar ændring i celle overlevelse. Resultaterne af den dobbelte luciferaseaktivitet assay viste, at HIF-1α øger transkriptionel aktivitet af miR27a promotoren i celler transficeret med et reporterplasmid indeholdende den opstrøms promotor regionen miR27a sammen med pcDNA-HIF-1α. Chipanalyse foreslog, at HIF-1α direkte binder til promotorområdet af miR27a. Inhibering af HIF-1α eller miR27a ekspression faldt MDR1 /P-gp, LRP, og Bcl-2-ekspression i OCUM-2MD3 /L-OHP celler. , Fandt således vi, at HIF-1α er tæt forbundet med MDR i GC og at HIF-1α kan undertrykke MDR1 /P-gp, LRP og Bcl-2-ekspression ved inhibering MIR-27a ekspression

Henvisning:. Zhao Q, Li Y, Tan Bb, Fan Lq, Yang Pg, Tian Y (2015) HIF-1α inducerer multiresistens i Gastric Cancer Cells ved at inducere MIR-27a. PLoS ONE 10 (8): e0132746. doi: 10,1371 /journal.pone.0132746

Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: Januar 5, 2015; Accepteret: 17 jun 2015; Udgivet: 20 August, 2015

Copyright: © 2015 Zhao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af følgende tilskud:. den Provincial Natural Science Foundation i Hebei-provinsen (nr H2013206311 til Qun Zhao)

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

mavekræft (GC) er blandt de mest almindelige maligne sygdomme, der forårsager alvorlig skade på verdensplan [1, 2] Efter flere år med teknologiske fremskridt i diagnosticering og behandling af GC, har dens forekomst og dødelighed faldt på verdensplan, men forblive høj i asiatiske lande [3, 4]. Øjeblikket, gastrisk resektion er den eneste tilgængelige metode til at helbrede GC. Det er imidlertid vanskeligt at opnå en fuldstændig helbredelse trods kirurgisk fjernelse af tumoren, fordi de fleste patienter lider af fremskreden GC ved diagnose [5, 6]. Derfor kemoterapi spiller en særdeles vigtig rolle i den omfattende behandling af GC. Selvom kemoterapi i høj grad udviklet sig med hensyn til behandling af fremskreden GC, [7, 8] prognosen for GC fortsat utilstrækkelig, med en 5-års overlevelse på mindre end 30% [9]. Denne prognose er primært på grund af multilægemiddelresistens (MDR) i GC-celler. MDR i GC ofte fører til svigt af kemoterapi [10-12]. Derfor er der et presserende behov for at udvikle nye lovende terapeutiske strategier til effektivt at reducere MDR i GC.

Iltsvind er udbredt i solide tumorer og er forbundet med en række biologiske funktioner. I øjeblikket, hypoxi-inducerbare faktor (HIF) -1α anses for at være tæt forbundet med hypoxi. HIF-1α udtrykkes kraftigt i en række forskellige maligne tumorer [13, 14] og virker som en væsentlig faktor til at regulere tilpasning af tumorceller for hypoxi [15]. HIF-1α er blevet foreslået at være tæt forbundet med GC MDR [16, 17]. Det er dog uklart, hvilken pathway medierer rolle HIF-1α i GC MDR.

I de senere år rolle microRNA (miRNA) i cancer er blevet en udbredt undersøgt mekanisme tumorinitiering og behandling. MIR-27a, et medlem af miRNA familien, har vist sig at påvirke MDR af GC [18]. Endvidere er ekspression af MIR-27a steget i et hypoxisk miljø [19]. Disse resultater tyder på, at HIF-1α kan regulere ekspressionen af ​​miR-27a og påvirke GC MDR. De specifikke reguleringsmekanismer er endnu ikke belyst. Den foreliggende undersøgelse viste, at ekspressionen af ​​HIF-1α og MIR-27a var signifikant opreguleret i GC væv og cellelinjer, især i resistente cellelinier.

Transfektion med et specifikt lille interfererende RNA til at blokere endogent HIF -1α resulterede i en reduktion i mIR-27a ekspression og lindring af MDR i GC cellelinier. Disse nye fund antyder, at inhibering af HIF-1α ekspression undertrykker transkription af MDR-beslægtede gener MDR1 /P-gp, LRP, og Bcl-2 til at dæmpe MDR af GC-celler ved at undertrykke MIR-27a-ekspression.

Materialer og metoder

1.1 Materialer

Gastrisk cellelinje OCUM-2MD3 var fra professor Masakazu Yashiro i Japan Oita Medical Kirurgi [20]. Den stabile resistente cellelinje OCUM-2MD3 /L-OHP2 blev opnået via dyrkning og udvælgelse af vores forskningsgruppe. Den GSE-1 cellelinje blev købt fra Cell Resource Center på Shanghai Institutes for Biologisk Institut for kinesiske videnskabsakademi. RPMI 1640 dyrkningsmedium og trypsin blev erhvervet fra Gibco Company; Trizol-reagens og Lipofectamine 2000 transfektionsreagens blev indkøbt fra Invitrogen. Revers transkription kit og fluorescens kvantitativ PCR-reagenser blev opnået fra Promega Corporation. PCR primere og små interfererende RNA blev syntetiseret af Shanghai biologiske Engineering Company. Proteinet ekstraktionskit blev opnået fra Beyotime Company, Kina. Primære antistoffer mod HIF-1α, MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2, TS eller GAPDH blev erhvervet fra Santa Cruz. MTT blev opnået fra Sigma. Vores undersøgelse blev godkendt af den etiske komité i fjerde Tilknyttede Hospital i Hebei Medical University.

1.2 Klinisk prøveforberedelse

Alle 65 patienter med GC blev udvalgt efter gastrisk resektion og patologisk bekræftelse i den fjerde Hospital i Hebei Medical University, herunder 42 mænd og 23 kvinder i alderen 60,5 ± 8,1 år, som ikke havde modtaget præoperativ strålebehandling eller kemoterapi. Kræft og para-carcinom væv (ca. 1,0 cm × 0,5 cm × 0,5 cm) blev taget fra hver patient, og prøverne blev hurtigt nedfrosset i flydende nitrogen og efterfølgende overført til -80 ℃ bevarelse. Alle deltagere underskrevet informeret samtykke.

1.3 Celledyrkning og transfektion

OCUM-2MD3, OCUM-2MD3 /L-OHP og GSE-1 cellelinjer blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin og 100 mg /ml streptomycin. Især blev mediet af OCUM-2MD3 /L-OHP celler behandlet med L-OHP ved en koncentration på 75μg /ml til at opretholde deres drug-resistens fænotype, en uge før operation for at stoppe behandlingen. Cellerne blev inkuberet i en fugtig 5% CO

2 atmosfære ved 37 ° C

Tre HIF-1α-siRNA-sekvenser blev designet ved hjælp BLOCK-iT RNAi Designer (sekvens 1:. GAGGAAACUUCUGGAUGCUGGUGAUtt; sekvens 2: GGAUGCUGGUGAUUUGGAUAUUGAAtt; sekvens 3: CAGGACAGUACAGGAUGCUUGCCAAtt), der hver blev annealet med deres komplementære sekvens og transficeret henholdsvis ind i OCUM-2 MD3 /L-OHP GC-celler. En ikke-specifik siRNA-sekvens (NS-siRNA: GAGUGGGUCUGGGUCUUCCCGUAGAtt) blev anvendt som en negativ kontrol. Den miR27a mimetiske sekvens var 5′-UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC-3 ‘. Humant fuldlængde HIF-1α Coden sekvens blev subklonet ind pcDNA3.1-vektor. pGL3-miR27a-luc, blev pcDNA-HIF-1α, pGL3-Basic og pRL-TK plasmider konstrueret og bevaret i vores laboratorium.

GC-celler blev podet i 6-brønds plader i 24 timer før transfektion ved en densitet på 4 x 10

5 celler /ml. De plasmidvektorer, siRNA eller miR27a mimic blev transficeret ind i GC celler eller lægemiddelresistente celler ved anvendelse af transfektionsreagens Lipofectamine efter producentens anvisninger. Derefter blev cellerne vasket med serumfrit RPMI 1640 mangler antibiotika. Transfektionseffektiviteten blev målt 24 timer senere, efterfulgt af de efterfølgende eksperimenter.

1.4 MTT assay

GC væv og normal para-carcinom væv blev homogeniseret til fremstilling enkeltcellesuspensioner ved filtrering gennem en 300 -mesh kobber gitter. GC-celler spaltet under anvendelse 0,02% EDTA-0,25% trypsin blev podet ved en densitet på 5 x 10

4 celler /ml i 96-brønds plader. Når cellerne nåede ca. 60% konfluens, blev HIF-1α-siRNA transficerede eller et kemoterapeutisk lægemiddel (150 ug /ml L-OHP) blev påført. Hver gruppe bestod af seks brønde. Derefter, 20 pi af 5 mg /ml MTT blev tilsat i 4 timer før afslutningen af ​​forsøget. Cellerne blev dyrket i 4 timer, og derefter blev dyrkningsmediet bortkastet. Dernæst 150 pi DMSO blev sat til hver brønd, og OD-værdierne blev målt ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser efter omrystning pladen i 15 minutter ved stuetemperatur. Forsøg blev gentaget tre gange.

1.5 RNA-isolering og kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol ettrins fremgangsmåde, og 2 ug RNA blev anvendt til revers transkription til at generere skabelon-cDNA. De relative mRNA-niveauer blev bestemt via kvantitativ PCR, tjente GAPDH som en intern reference-gen. PCR parametre var som følger: 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 45 cykler med denaturering ved 94 ° C i 30 s og annealing ved 60 ° C i 30 s. Primersekvenserne blev konstrueret ved anvendelse af primer 5.0 og blev søgt efter specificitet. Primersekvenserne er som følger: HIF-1α (93 bp): (F) 5′-GACAGCCTCACCAAACAGAG-3 ‘og (R) 5′-CTCAAAGCGACAGATAACACG-3′; MDR1 (126 bp): (F) 5’-GAATGTTCAGTGGCTCCGAG-3 ‘og (R) 5′-ACAATCTCTTCCTGTGACACC-3′; GST-π (151 bp): (F) 5’-ATACCATCCTGCGTCACCTG-3 ‘og (R) 5′-TCCTTGCCCGCCTCATAGTT-3′; Bcl-2 (98 bp): (F) 5’-TGTGTGGAGAGCGTCAACC-3 ‘og (R) 5′-TGGATCCAGGTGTGCAGGT-3′; LRP (129 bp): (F) 5’-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 ‘og (R) 5′-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3′; TS (129 bp): (F) 5’-TTTCTGACGGCAACTTCAAC-3 ‘og (R) 5′-AGTCCAATGTCCAGCCCAT -3′; og GAPDH (138bp): (F) 5’-GACCCCTTCATTGACCTCAAC-3 ‘og (R) 5′-CGCTCCTGGAAGATGGTGAT-3’. De kvantitative PCR resultater blev beregnet ved anvendelse af 2

-ΔΔCt metode

1.6 Western blot

Vævsprøverne og celler blev lyseret ved hjælp RIPA lysepuffer:. 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,0, 0,2 mM Na3VO4, 0,2 mM phenylmethylsulfonylfluorid og 0,5% NP-40. Lige store mængder af proteinet prøver blev separeret på de 10% polyacrylamid- SDS-geler (SDS-PAGE) og blev elektrooverført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Amersham Pharmacia Biotech). Membranerne blev blokeret med 5% BSA i 2 timer og inkuberet med det primære antistof natten over ved 4 ° C. Membranerne blev inkuberet i 2 timer i en peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof. Target bånd blev detekteret under anvendelse af et forøget kemiluminescens (ECL) detektion kit (Santa Cruz, USA). β-actin blev anvendt som en endogen kontrol-gen. Eksperimentet blev gentaget tre gange.

1.7 chromatin immunoprecipitation (chip) assay

chip assays blev udført i overensstemmelse med fremgangsmåden fra Wang et al. [21]. Celler med forskellige behandling blev fikseret med 1% formaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur, og afsluttet ved en endelig koncentration på 0,125 M glycin. Derefter blev cellerne lyseret ved anvendelse af 300 pi lysepuffer (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,5% deoxycholat og proteasehæmmere). Cellelysaterne blev sonikeret i bad med isvand til opnåelse af kromatin-fragmenter omkring 600 bp, som vurderet ved agarosegelelektroforese. Efter centrifugering ved 13.000 rpm i 10 min blev supernatanterne taget og præ-blokerede i 15 minutter ved 4 ° C via inkubering med 30 pi af protein A-Sepharose-perler og afskåret DNA fra laksesæd. Efter centrifugering ved 13.000 rpm i 5 min blev supernatanterne delt i tre lige store dele: en for input, de to andre for immunopræcipitation med eller uden HIF-1α antistof. Den næste dag blev immunkomplekser udfældet med protein A-Sepharose-perler og afskåret DNA fra laksesæd, så perlerne blev opsamlet efter vasket to gange med vaskepufferen I (20 mM Tris-HCI, pH 8,1, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 og 2 mM EDTA), efterfulgt af vaskepuffer II (20 mM Tris-HCI, pH 8,1, 500 mM NaCl, 0,1% SDS, 1% Triton X-100 og 2 mM EDTA) og vaskepuffer III (10 mM Tris-HCI, pH 8,1, 0,25 M LiCI, 1% Nonidet P-40, 1% deoxycholat og 1 mM EDTA), og den endelige vaskebuffer IV (10 mM Tris-HCI, pH 8,1, og 1 mM EDTA). Immunopræcipitaterne blev elueret ved 200 pi elueringspuffer (1% SDS og 0,1 M NaHCO

3), efterfulgt af inkubation ved 65 ° C natten over. Den næste dag, DNA fra hver prøve blev isoleret, og PCR blev udført til amplifikation promotor- segmenter indeholdende en HIF-1α bindingssted.

1.8 luciferaseassays

Celler dyrket til 70% konfluens og derefter blev transficeret i tre eksemplarer med pGL3-mIR-27a-luc, pcDNA-HIF-1α eller pGL3-Basic, sammen med pRL-TK. Efter 48 timers transfektion blev cellerne opsamlet og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) ifølge producentens protokol. Luciferaseaktiviteterne af pRL-TK blev serveret som intern kontrol.

1.9 Statistisk analyse

Resultaterne præsenteres som midlet ± standardafvigelse ANOVA, og Dunnetts test blev udført ved hjælp af SPSS 11.5 software.

Resultater

1 HIF-1α og miR27a udtrykkes forskelligt mellem gastrisk para-carcinoma væv og GC væv

ekspression af HIF-1α i GC væv sammenlignet med gastrisk para-carcinom væv blev bestemt via QRT-PCR og Western blot, og følsomheden af ​​L-OHP celler blev bestemt via MTT-assayet. HIF-1α (fig 1A, 1B og 1C, qPCR og Western blot) og miR27a (Fig 1D, qPCR resultater) blev opreguleret i GC væv sammenlignet med gastrisk para-carcinoma væv. MTT-assayet viste, at cellen overlevelsesraten var større i GC væv end i gastrisk para-carcinoma væv, når L-OHP blev tilsat til de encellede væv suspensioner (Fig 1E, histogram resultater).

Klinisk gastrisk tumorprøver samt normale kontrol væv blev opnået og underkastet RT-qPCR (A) og Western blotting (B og C) for at bestemme ekspressionen af ​​HIF1α blev mIR-27a bestemt ved qPCR (D). For RT-qPCR og Western blotting assays, blev β-actin, der anvendes til en endogen henvisning at standardisere mRNA og protein-ekspressionsniveauer. Single-cellesuspension blev fremstillet fra væv og andre kræft-tilgrænsende normale væv og dyrket i MTT-assay. Cellerne blev behandlet med kemoterapeutika (L-OHP, 150 pg /ml), når de nåede 80% konfluens og anvendt til MTT-assay (E). 6 dubletter for hver behandling blev udført. Resultater blev præsenteret som middelværdi ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med kræft-tilstødende normale væv gruppe

2 HIF-1α og miR27a udtrykkes forskelligt mellem en maveslimhinden epitelial cellelinje og en GC cellelinje

ekspression af HIF-1α var den højeste i OCUM-2MD3 /L-OHP og OCUM-2MD3 celler, sekventielt, og var det laveste i GES-1-celler (fig 2A, 2B og 2C, qPCR og Western blot). Desuden udtryk for miR27a viste samme tendens, hvor OCUM-2MD3 /L-OHP celler vises det højeste udtryk efterfulgt af OCUM-2MD3 celler, og GSE-1 celler vises den laveste udtryk for miR-27a (fig 2D, qPCR resultater). MTT-assayet viste, at når L-OHP blev tilsat til de tre cellelinier, OCUM-2MD3 /L-OHP celler udviste den højeste celle overlevelsesraten, efterfulgt af OCUM-2MD3 celler, og at GSE-1-celler udviste den laveste celleoverlevelse sats (fig 2E, histogram resultater).

Normalt humant kontrol gastrisk mucosa epitelcellelinie GES-1 samt gastriske cancercellelinier OCUM-2MD3 og OCUM-2MD3 /L-OHP blev underkastet RT-QPCR (A) og Western blotting (B og C) for at sammenligne ekspressionen af ​​HIF1α in vitro. MIR-27a blev bestemt ved QPCR (D) .For RT-QPCR og Western blotting assays, blev β-actin anvendt som en endogen kontrol at standardisere mRNA og protein-ekspressionsniveauer. MTT-assay blev anvendt til at bestemme overlevelsesfrekvensen af ​​gastriske cancercellelinier efter behandlingen med L-OHP i cellerne i OCUM-2MD3 /L-OHP, OCUM-2MD3 og GSE-1 (E). Resultater blev præsenteret som middelværdi ± S.D. (N = 3). * P 0,05 sammenlignet med kræft-tilstødende normale væv eller GES-1 celler. De viste billeder er repræsentanter for mindst tre uafhængige forsøg.

3 HIF-1α-siRNA undertrykker ekspressionen af ​​miR27a og stoffet modstand OCUM-2MD3 /L-OHP celler

Western blot-analyse viste, at mRNA og protein niveauer af HIF-1α faldt i varierende omfang i OCUM-2MD3 /L-OHP celler transficeret med tre par HIF-1α-siRNA, hvorimod HIF-1α ekspression ikke ændrede i cellerne transficeret med kontrol-siRNA. HIF-1α ekspression syntes at falde mest stejlt, med cirka 90%, under anvendelse af HIF-1α-siRNA-2 (Fig 3A). Som vist i fig 3B, HIF-1α ekspression faldt i disse celler på en dosis-afhængig måde, hvor HIF-1α ekspression faldt med mere end 95% i celler transficeret med 80 nM HIF-1α-siRNA-2, når HIF- 1α-siRNA-2 blev transficeret yderligere ved en dosis på 20 nM, 40 nM eller 80 nM. Desuden blev den maksimale inhiberende virkning påvist 48 timer efter transfektion (Fig 3C).

OCUM-2MD3 /L-OHP-celler blev transficeret med enten HIF1α-siRNA eller NS-siRNA (A) eller transficeret med 20, 40 eller 80 nM HIF1α-siRNA-2 (B), eller transficeret med 80 nM HIF1α-siRNA-2 i 24, 48 eller 72 timer (C), derefter blev cellerne opsamlet til Western blotting-assays at beregne knockdown effektivitet . MIR-27a-niveauer blev bestemt ved qPCR (D). Overlevelsesraten for OCUM-2MD3 /L-OHP blev estimeret ved MTT-assayet. (E) Resultater blev præsenteret som gennemsnit ± S.D. (N = 3). * P 0,01 sammenlignet med NS-siRNA-gruppe på Airbnb

miR27a udtryk blev signifikant nedsat efter transfektion af OCUM-2 MD3 /L-OHP celler med HIF-1α-siRNA-2 (fig 3D). . MTT-assayet viste, at cellen overlevelsesrate blev signifikant reduceret efter behandling af HIF-1α-siRNA-2-transficerede OCUM-2 MD3 /L-OHP celler med L-OHP sammenlignet med ikke-transficerede celler (fig 3E).

4 effekter af miR27a om MDR af OCUM-2MD3 /L-OHP celler

udtryk for miR27a blev opreguleret i OCUM-2MD3 /L-OHP celler, når den miR27a mimic var samarbejde transficeret ind i disse lægemiddelresistente GC-celler, som var blevet transficeret med HIF-1α-siRNA (fig 4A). Der blev imidlertid ingen signifikant forskel i ekspressionen af ​​HIF-1α detekteret i OCUM-2MD3 /L-OHP-celler efter transfektion (Fig 4B og 4C, qPCR og Western blot).

OCUM-2MD3 /L-OHP celler blev transficeret med miR27a analoger til 48 h (A), derefter blev cellerne opsamlet, miR27a og HIF1α niveauer blev detekteret ved RT-qPCR og Western blot assays (A, B og C). Overlevelsesraten for OCUM-2MD3 /L-OHP blev beregnet ved MTT-assayet (D). Resultater blev præsenteret som middelværdi ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen

MTT-analysen vist, at overlevelsesraten for OCUM-2MD3 /L-OHP celler klart blev øget efter transfektion med miR27a mimic (Fig 4D, histogram resultater ).

5 HIF-1α inducerer transskription af miR27a i OCUM-2MD3 celler

udtryk for HIF-1α blev øget betydeligt i OCUM-2MD3 celler transficeret med den eukaryote ekspressionsplasmid pcDNA- HIF-1α i 48 timer (fig 5A). Endvidere miR27a ekspression var helt opreguleres (Fig 5B). Således disse resultater antydede, at HIF-1α er en kritisk faktor, der påvirker transkriptionen af ​​miR27a. Derfor har vi etableret en luciferasereportergen plasmid, der bærer et 2 kb opstrøms for promotorregionen af ​​miR27a, som blev co-transficeret med pcDNA-HIF-1α i cellerne. DLA data viste, at HIF-1α forstærkede promotoraktiviteten af ​​miR27a efter co-transfektion (Fig 5C). Chipanalyse bekræftede yderligere, at HIF-1α direkte bundet til promotorområdet i miR27a (Fig 5D). Resultaterne viste, at HIF-1α kan fremme transkriptionen af ​​miR27a i OCUM-2MD3 celler ved direkte binding til promotorregionen af ​​miR27a.

OCUM-2MD3 celler blev transficeret med pcDNA-HIF-1α, niveauet for HIF-1α og miR27a blev bestemt ved Western blot og RT-qPCR (A og B) efter 48 af transfektion. Dual luciferase reporter assay blev udført ved cotransfektion af reporter plasmid indeholdende miR27a promotoren og pcDNA-HIF-1αin OCUM-2MD3 celler (C), og chip-assay blev udført for at teste bindingen af ​​HIF-1α til promotoren af ​​miR27a i OCUM -2MD3 celler. Resultater blev præsenteret som middelværdi ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med pcDNA tomme vektor kontrolgruppe

6 Hæmning af HIF-1α hjælp siRNA undertrykker ekspressionen af ​​resistens gener

Som vist i figur 6, hæmning af HIF-1α dramatisk undertrykt udtryk for MDR1 /P-gp, LRP, og Bcl-2 i OCUM-2MD3 /L-OHP celler, men ikke signifikant ændrer ekspressionen af ​​GST-π eller TS. (Figur 6).

OCUM-2MD3 /L-OHP celler blev transficeret med 80 nM HIF1α-siRNA eller ikke-målrettet siRNA eller kun behandles med Lipofectamine 2000 for 48 timer, derefter blev underkastet RT-qPCR (A) og Western blotting (B, C) for at detektere ekspressionsniveauerne af MDR1 /P-gp, LRP, Bcl-, GST-π og TS. β-actin blev anvendt til en endogen henvisning at standardisere proteinekspressionsniveauer. Resultater blev præsenteret som middelværdi ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med ikke-målrettede siRNA-gruppe på Airbnb

7 Hæmning af miR27a reducerer af lægemiddelresistens-relateret genekspression i OCUM-2MD3 /L-OHP celler

miR27a var undertrykt i lægemiddelresistente GC OCUM-2MD3 /L-OHP celler transficeret med anti-miR27a sekvens (figur 7A). Endvidere følger denne transfektion, ekspressionen af ​​MDR1 /P-gp, LRP og Bcl-2 blev signifikant reduceret, mens ingen signifikant forskel blev påvist i ekspressionen af ​​GST-π eller TS (fig 7B, 7C og 7D, qPCR og Western blot). (Figur 7)

OCUM-2MD3 /L-OHP-celler blev transficeret med Anti-miR27a (A),, LRP, Bcl-, GST-π og TS blev påvist ekspressionsniveauerne af MDR1 /P-gp ved RT-qPCR (B) og Western blotting (C, D). β-actin blev anvendt til en endogen henvisning at standardisere proteinekspressionsniveauer. Resultater blev præsenteret som middelværdi ± S.D. (N = 3). * P. 0,01 sammenlignet med ikke-målrettet siRNA-gruppe på Airbnb

Diskussion

Selvom den verdensomspændende forekomst af GC synes at være faldet i de seneste år, en høj forekomst af GC fortsætter, alvorligt fare for sundheden for personer i Asien [22]. MDR af GC-celler bidrager til dårlig prognose af GC, hvori oxygenmangel spiller en kritisk rolle. I den foreliggende undersøgelse etablerede vi stabile OCUM-2MD3 /L-OHP cellelinie, der er resistent over for L-OHP. Vores data viser, at GC væv og cellelinjer udviser stærkere modstand stof end normale gastrisk epitelvæv og cellelinier. Vi fandt også, at resistente celler udvikler meget stærkere MDR. Vores resultater viste forøget ekspression af HIF-1α i GC væv og cellelinier, og påvistes den højeste ekspression af HIF-1α i et lægemiddelresistent cellelinie. foreslår derfor, vi, at HIF-1α bidrager til udviklingen af ​​MDR i GC-celler.

HIF-1α genet koder for et protein, der består af 826 aminosyrer med en molekylvægt på 120 kDa [23]. Mange undersøgelser har bekræftet, at øget ekspression af HIF-1α er stærkt forbundet med forekomsten og udvikling af tumorer [24-28]. Andre undersøgelser har antydet, at overekspression af HIF-1α forbedrer resistente egenskaber af en række tumorceller [29-32]. Desuden er vores undersøgelse viste at GC væv og cellelinier udviser stærkere modstand mod kemoterapeutiske lægemidler end gastriske para-carcinom væv og gastriske mucosa cellelinier. Vi har detekteret også den mest potente lægemiddel-resistens i GC celler. Men de mekanismer, hvormed HIF-1α regulerer MDR har endnu ikke klart identificeret i GC celler. Derfor har vi undersøgt yderligere virkningerne af HIF-1α på MDR egenskaber af GC celler via gen interferens og kloningsteknikker. RNA-interferens (RNAi) har vist fordele i specificitet, effektivitet og holdbarhed for regulering af target genekspression [33]. Vores data indikerer, at inhibering af HIF-1α signifikant reduceret lægemiddelresistens i OCUM-2MD3 /L-OHP celler. Endvidere har vi vist, at medikamentresistens dramatisk blev forøget, når pcDNA-HIF-1α, som blev anvendt til at overudtrykke HIF-1α, blev transficeret i ikke-lægemiddel-resistente GC cellelinier. Vores resultater indikerede, at HIF-1α spiller en væsentlig rolle i udviklingen af ​​MDR i GC.

Nylige undersøgelser har indikeret, at MDR er nært beslægtet med miRNA i tumorer [34-36]. Hu har rapporteret, at inaktivere miR-27a kan vende multiresistente egenskaber GC celler [18]. Endvidere er det blevet rapporteret, at MIR-21, MIR-27a, MIR-210 og MIR-181b opreguleret via HIF pathway i hypoxisk miljø baseret på et gen-chip assay [19]. I overensstemmelse med vores resultater, blev HIF-1α positivt associeret med ekspressionen af ​​MIR-27a i GC væv og cellelinier, og inhibering af HIF-1α faldt MIR-27a. I modsætning hertil overekspression af HIF-1α induceret ekspression af MIR-27a. Disse resultater indikerede, at HIF-1α regulerer ekspressionen af ​​MIR-27a. Desuden viste vores undersøgelse, at miR-27a efterligner reddet de lægemiddel-resistens egenskaber af HIF-1a-knockdown celler. Vigtigst er det, HIF-1α binder direkte til og fremmer miR27a transkription, hvilket indikerer, at HIF-1α regulerer MDR af GC via MIR-27a.

Vi kendetegnet ekspressionen af ​​gener, der er tæt forbundet med MDR, herunder MDR1 /P-gp, GST-π, LRP, Bcl-2 og TS, før og efter modulationen af ​​HIF-1α ekspression i GC-celler for at belyse den mekanisme, hvormed HIF-1α-mIR-27a pathway regulerer MDR af GC . Vi demonstrerede, at inhibering af HIF-1α-ekspression reduceres ekspressionen af ​​MDR1 /P-gp, LRP og Bcl-2. Ekspressionsniveauerne af disse gener blev signifikant forøget, når cellerne blev transficeret med MIR-27a mimic, mens ekspressionsniveauerne af GST-π og TS ikke blev væsentligt ændret. I overensstemmelse med dette fund, over-ekspression af HIF-1a kraftigt opreguleret ekspression af MDR1 /P-gp, LRP, og Bcl-2 i GC OCUM-2MD3 cellelinie. Derfor er vores data viser, at HIF-1α-miR-27a pathway medierer MDR ejendomme i GC ved at inducere MDR1 /P-gp, LRP og Bcl-2-ekspression.

Vores undersøgelser viser, at HIF-1α og miR -27a er opreguleret i GC væv og cellelinier. HIF-1α virker som en opstrøms regulator af MIR-27a. HIF-1α-MIR-27a signalering forbedrer egenskaberne af MDR ved at inducere ekspression af MDR1 /P-gp, LRP og Bcl-2 i GC. Disse resultater tyder på, at HIF-1α-miR-27a vej spiller en afgørende rolle i initiering af MDR i human GC, der kan tjene som en ny terapeutisk mål for MDR i GC.

Støtte oplysninger

S1 File. Data for MTT og vestlige

doi:. 10,1371 /journal.pone.0132746.s001

(ZIP)