PLoS ONE: Nuclear målrettet Slettet i leverkræft en (DLC1) er mindre effektiv i Udøvelse Dens Tumor Smittespredningshæmmende aktivitet både in vitro og i Vivo

Abstrakt

Baggrund

Slettet i leverkræft 1 (DLC1) tjener som en vigtig RhoGTPase aktiverende protein (RhoGAP) protein, der afslutter aktiv RhoA signalering i humane kræftformer. Stigende beviser har vist, at tumor undertrykkende aktivitet DLC1 afhænger ikke kun af RhoGAP aktivitet, men også afhængig af korrekt omdrejningspunkt vedhæftning lokalisering gennem sin interaktion med Tensin familie proteiner. For nylig, er der rapporter viser, at DLC1 kan også findes i kernen; Men eksistensen og den relative tumor undertrykkende aktivitet af nuklear DLC1 er aldrig blevet klart behandlet.

Metode og vigtigste resultater

Vi heri give nye beviser, at DLC1 protein, der overvejende er forbundet med fokale sammenvoksninger og lokaliseret i cytosolen, dynamisk sendt mellem cytoplasmaet og kernen. Behandling af celler med nukleare blocker eksport, Leptomycin B (LMB), beholdt DLC1 i kernen. For at forstå den nukleare optagelse af DLC1 identificerede vi aminosyrerne 600-700 af DLC1 som en ny region, der er vigtig for dens kernelokalisering. Tumoren undertrykkende aktivitet af nuklear DLC1 var direkte vurderes ved at ansætte en kernelokaliseringssignal (NLS) fusion variant af DLC1 (NLS-DLC1) med præferentiel nukleare lokalisering. I SMMC-7721 HCC celler, ekspression af NLS-DLC1 undladt at undertrykke dannelse koloni dannelse og actin stress fiber

in vitro

. Den ophævede tumor undertrykkende aktivitet af nuklear DLC1 blev demonstreret for første gang

in vivo

ved subkutan intravenøse p53

– /- RASV12 hepatoblasts med stabil NLS-DLC1 udtryk i nøgne mus. De injicerede hepatoblasts med NLS-DLC1 udtryk effektivt dannes tumorer sammenlignet med ikke-nukleare målrettet DLC1.

Konklusioner /Betydning

Vores undersøgelse identificerede en roman region ansvarlig for det nukleare indtastning af DLC1 og demonstrerede den funktionelle forskel på DLC1 i forskellige cellulære rum både

in vitro

in vivo

Henvisning:. Chan LK, Ko FCF, Sze KM-F, Ng IO -L, Yam JWP (2011) Nuclear-målrettede slettet i leverkræft en (DLC1) er mindre effektiv i Udøvelse Dens Tumor Smittespredningshæmmende Aktivitet Begge

In vitro

In Vivo

. PLoS ONE 6 (9): e25547. doi: 10,1371 /journal.pone.0025547

Redaktør: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, USA

Modtaget: Juni 7, 2011; Accepteret: September 6, 2011; Udgivet: 26 September, 2011

Copyright: © 2011 Chan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Hongkong Research Grants Rådet (HKU7798 /07m), Hongkong Research Grants Rådets Collaborative Research Fund (HKU 1 /06C og HKU 7 /CRG /09) og Outstanding Young Researcher Award (til JWP Yam). I.O.L. Ng er Loke Yew professor i patologi. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

slettet i leverkræft en (DLC1) blev først klonet ved subtraktiv hybridisering som et gen fragment, blev ofte slettet i human hepatocellulært carcinom (HCC) [1]. Akkumulerende beviser i det sidste årti har støttet, at DLC1 er underexpressed i forskellige former for menneskelige kræftformer udover HCC [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Restaurering af DLC1 ved ektopisk udtryk i celler med lav eller ingen endogen udtryk for DLC1 forsinker celleproliferation, inducerer apoptose, sinker celle bevægelse og opløses actin cytoskeletal struktur

in vitro

[8], [9], [10 ]. Omvendt DLC1 knockdown fremmer tumorigenese af en Myc drevet

in vivo

mus hepatocarcinogenese model med en p53 null baggrund [11]. Arten af ​​den hyppige patologiske underekspression af DLC1 og den robuste eksperimentelle tumor undertrykkende aktivitet både kraftigt støtte DLC1 fungerer som en

bona fide

tumorsuppressor.

tumor undertrykkende aktivitet DLC1 er tæt knyttet til dens iboende RhoGAP aktivitet, hvilket nedregulerer Rho-medierede biologiske respons. DLC1 har vist sig at være RhoA-, B-, C- og Cdc42-specifik [12], [13]. Fokal adhæsion lokalisering gennem interaktion med tensin familie protein er en af ​​egenskaberne ved DLC1 og er funktionelt forbundet med dets tumor-undertrykkende aktivitet. Dette blev støttet af dokumentation for, at DLC1 mutant med intakt RhoGAP domæne, men undlod at være målrettet mod de fokale sammenvoksninger udstillet reduceret vækst undertrykkende aktivitet

in vitro

[10], [14]. Da omdrejningspunktet vedhæftning målrette steder i DLC1 overlap med tensin protein bindingssted er det blevet accepteret, at DLC1 par med tensin og funktioner som tumor undertrykkende kompleks i afslutning af omdrejningspunktet vedhæftning-associerede Rho-aktivitet [10], [14], [15 ].

En nylig undersøgelse har foreslået tilstedeværelsen af ​​basiske rester rige motiv i DLC1 ligner NLS [16]. Det har også været foreslået, at serin /threonin specifikt protein kinase D phosphorylerer DLC1 at skabe et 14-3-3 docking site. Kompleksdannelse med 14-3-3 isolerer DLC1 i cytoplasmaet og stopper sin nukleare post [17]. Men eksistensen og regulering af den nukleare DLC1 ikke blevet grundigt undersøgt. Vigtigst, den relative tumor suppressive aktivitet af nuklear DLC1 er aldrig blevet adresseret. I denne undersøgelse har vi givet omfattende beviser for, at DLC1 protein konstant pendulfart mellem cytoplasmaet og kernen. Vi har udført den første funktionelle karakterisering af nukleart målrettet DLC1 at undersøge dens grundlæggende og tumor undertrykkende aktivitet både

in vitro

in vivo

. Ved at studere den subcellulære lokalisering af forskellige DLC1 mutanter, har vi identificeret en roman region i RhoGAP domæne, som er vigtig og tilstrækkelig for denne nukleare import.

Resultater

DLC1 pendlet mellem cytoplasmaet og kernen

Angivelse af myc-mærket DLC1 (Myc-DLC1) i SMMC-7721 celler afslørede sin eksistens i fokale sammenvoksninger, cytoplasma og nucleus (fig. 1A). Kvantitativ undersøgelse af DLC1 udtryk i celler viste sin dominerende cytoplasmatisk lokalisering med punktformet fokal vedhæftning mønster på cellens periferi. At udforske bevægelsen af ​​DLC1 mellem cytoplasmaet og kernen, blev Myc-DLC1 lokalisering i celler undersøgt i celler behandlet med exportin blocker, LMB. Behandling med LMB resulterede i den nukleare tilbageholdelse af Myc-DLC1 i SMMC-7721 og BEL7402 celler (Fig. 1B,

venstre panel

). Især blev omdrejningspunkt vedhæftning lokaliseret DLC1 stadig observeret, implicerer kun ikke-fokal vedhæftning lokaliseret DLC1 blev pendlet og tilbageholdt i kernen. Cellular fraktionering yderligere bekræftet tilstedeværelsen af ​​DLC1 på det nukleare brøkdel af cellelysat (fig. 1B,

højre panel

). Lignende bemærkning opnået med GFP-mærkede DLC1 (GFP-DLC1) (data ikke vist). observeredes den dynamiske bevægelse af DLC1 under tilbagetrækning af LMB på forskellige tidspunkter (fig. 1C). Re-mønsterdannelse af cytoplasmatiske og fokal adhæsion blev forekom inden for 24 timer. Vi udvidede vores undersøgelse ved at undersøge lokalisering af endogene DLC1 i forskellige cellelinjer. Subcellulær fraktionering af Hep3B, HLE og SK-HEP1-celler efterfulgt af immunoblotting under anvendelse DLC1-specifikt antistof understøtter tilstedeværelsen af ​​DLC1 i kernen (fig. 1D). Immunofluorescens for endogen DLC1 i SK-HEP1 celler udviste tilsvarende subcellulære lokalisering i cytoplasmaet og kernen (fig. 1E). Konsekvent, blev endogent DLC1 i Hep3B tilbageholdt i kernen efter LMB behandling (fig. 1F). For at understøtte den antagelse, at DLC1 pendulfart mellem cytoplasmaet og kernen under fysiologiske tilstand, udførte vi immunhistokemi mod DLC1 på en human ikke-neoplastisk lever (fig. 1G). Positiv DLC1 farvning blev påvist i både cytoplasma og kernen, hvilket yderligere understøtter, at DLC1 er til stede i kernen.

(A) SMMC-7721-celler blev transient transficeret med myc-tagget DLC1. DLC1 blev visualiseret med anti-Myc-antistof efterfulgt af FITC-konjugeret sekundært antistof. Nucleus blev modfarvet med DAPI. Subcellulære lokalisering mønster af DLC1 af 241 DLC1 transficerede celler blev talt og kategoriseret i gruppe A til E som angivet. (B) SMMC-7721 og BEL7402 celler blev transient transficeret med myc-mærkede DLC1 og underkastet LMB rensning efterfulgt af immunfluorescensfarvning med anti-Myc-antistof (

venstre panel

). De transficerede celler blev fraktioneret i cytoplasmatiske og nukleare dele efterfulgt af immunoblotting mod Myc for eksogen DLC1, tubulin (cytoplasmatisk markør), LaminB og c-jun (nuklear markør) (

højre panel

). (C) SMMC-7721-celler blev transient transficeret med myc-mærkede DLC1, efterfulgt af LMB behandling i 6 timer. Efter LMB behandling (som blev betegnet t = 0), cellerne blev dyrket med frisk medium og blev fikseret på det angivne tidspunkt. Exogent DLC1 blev visualiseret ved anti-Myc-antistof. (D) Hep3B, HLE-celler og SK-HEP1-celler blev fraktioneret i cytoplasmatiske og nukleare portioner efterfulgt af immunoblotting under anvendelse af antistoffer mod endogent DLC1, tubulin, LaminB og c-jun. (E) Endogen DLC1 i SK-HEP1-celler blev visualiseret ved polyklonalt anti-DLC1 antistof, efterfulgt af FITC-konjugeret sekundært antistof. At tjene som en negativ kontrol, blev SMMC-7721 celler uden DLC1 udtryk farves med polycloncal anti-DLC1 antistof. Den DLC1 antistof kunne kun påvise signal i SMMC-7721 celler med eksogent DLC1 overekspression men ikke de ikke-transficerede celler. (F) Hep3B celler blev behandlet med LMB i 6 timer. Endogen DLC1 blev derefter visualiseret ved polyklonalt anti-DLC1 antistof, efterfulgt af FITC-konjugeret sekundært antistof. (G) En sektion af human ikke-neoplastisk leveren blev immunfarvet for DLC1 (Brown). Kernerne blev modfarvet ved hematoxylin (blå). Celler, der viser positive nukleare DLC1 farvning blev angivet af de faste hoveder pile. Cellekerne viser negativ DLC1 farvning blev angivet af de tomhjernede pile. Målestok:. 10 um

DLC1 600-700 rester samarbejdet med NLS i reguleringen af ​​DLC1 nukleare indgang

Proteiner af store molekylære størrelse besidder signaler for aktiv transport på tværs af nukleare transport nukleare kuvert ved hjælp af nuklear kompleks transport. Det er blevet foreslået, at en monopartite NLS (423-431) [17] og tosidet NLS (415-431) [16] er til stede i DLC1 som letter nukleare optagelse af DLC1. For specifikt lokalisering af DLC1 uden de foreslåede NLS upon LMB behandling, vi konstrueret DLC1Δ415-431 mutant specifikt mangler den foreslåede NLS (fig. S1A og S1B). Ekspression af DLC1Δ415-431 i SMMC-7721 celler viste samme subcellulære lokalisering som vildtype DLC1. Overraskende DLC1Δ415-431 var stadig følsomme over for LMB behandling og blev tilbageholdt i kernen så effektivt som vildtype DLC1 (fig. S1c). Det er også blevet rapporteret, at phosphorylering i serin-431 (S431) af DLC1 ved protein kinase D (PKD) [17] letter binding mellem DLC1 og 14-3-3-proteiner, hvilket forhindrer nuklear indtastning af DLC1. Vi fandt imidlertid, at DLC1 S431 phospho-defekt mutant viste S431A lignende grad af nuklear fastholdelse efter LMB behandling (fig. S1D). Tilsammen kunne vi ikke levere tilstrækkelig dokumentation til støtte funktionaliteten af ​​den foreslåede NLS samt rolle S431 fosforylering i reguleringen af ​​nuklear transport af DLC1.

Vi spørgsmålstegn ved, om, bortset fra den nukleare målrette motiv foreslog af de andre, er yderligere region i DLC1 involveret i den nukleare lokalisering af DLC1. For at løse dette, vi klonede og udtrykte GFP-DLC1 deletionsmutanter og undersøgt deres lokalisering efter LMB behandling i HeLa-celler (fig. 2A). Vi fandt, at DLC1 Δ292-646 intern deletion mutant viste en signifikant reduktion af nuklear lokalisering ved LMB behandling (fig. 2B og 2C). På den anden side blev nuklear retention af DLC1 1-807 C-terminale deletionsmutant ikke påvirket sammenlignet med vildtype DLC1 ved LMB behandling. Interessant, 1-807 mutant, som indeholdt den foreslåede omdrejningspunkt vedhæftning målrettet region (område 200-500) [18] kunne ikke effektivt målrettet til fokale sammenvoksninger og diffust udtrykt i cytoplasmaet.

(A) Skematisk diagram, der viser strukturen af ​​vildtype DLC1 (DLC1 WT) og dets deletionsmutanter (Δ292-646 og 1-807). (B) HeLa-celler blev transient transficeret med GFP-mærkede DLC1 ekspressionskonstruktioner som angivet i (A), efterfulgt af LMB behandling. Fokale adhæsioner blev modfarvet med anti-vinculin antistof. Den subcellulære lokalisering af DLC1 blev registreret ved at tælle mindst 100 transficerede celler per prøve. (C) Søjlediagram opsummerer den subcellulære lokalisering af DLC1 og dens mutanter i (B) med eller uden LMB behandling. Resultaterne repræsenterer en kopi af to uafhængige forsøg. Procentdelen af ​​fokal vedhæftning positiv DLC1 i enkelt gruppe blev også fremhævet.

Det er blevet foreslået, at N-terminale region af DLC1 negativt regulerer dets nukleare post [16]. En række potentielle nukleare eksport signal (NES) er blevet kortlagt på 62-71, 764-773 og 792-801 rester af DLC1 af

i silico

søgning (fig. S2A). Betydningen af ​​disse signalsekvenser i regulering af cytoplasmatiske lokalisering blev derefter vurderet ved immunofluorescens. Funktionaliteten af ​​NES på 764-773 og 792-801 rester blev udelukket af cytoplasmatiske udtryk for 1-291 og 1-400 mutanter (fig. S2B). Siden 609-stop og 648-839 mutanter de viste forbedret nuklear lokalisering, blev rollen som NES på 62-71 rester analyseres yderligere ved at skabe en DLC1 Δ62-71 mutant. Denne DLC1 mutant udviste karakteristiske fokal adhæsion lokalisering svarende til vildtype, uden at vise nogen forøgelse nuklear retention (fig. S2B). For at tydeliggøre fravær af nuklear retention ikke skyldtes den stærke fokal adhæsion association, DLC1 1-807Δ62-71, en mutant undladt at lokalisere ved fokale adhæsioner blev udtrykt. Men denne mutant blev også fundet, at være overvejende lokaliseret ved cytoplasmaet. Tilsammen, fandt vi, at fjernelsen af ​​de forudsagte NES på N-terminalen af ​​DLC1 påvirkede ikke sin nucleocytoplasmic fordeling.

Efter at fremhæve den nukleare område målrettet til centrum regionen DLC1, vi udførte den første detaljerede lokalisering analyse af et panel af GFP-DLC1 mutanter (fig. 3A). Interessant fandt vi, at ekspression af 350-807 mutanten viste en dominerende kernelokalisering. Tilsvarende fremtrædende kernelokalisering blev set i Myc-DLC1 291-807 (data ikke vist). Undersøgelse af 600-807 mutant afslørede lignende kernelokalisering, mens 700-807 mutanten lokaliseret i både cytoplasma og kernen i HeLa-celler (fig. 3B og 3C). Øget kernelokalisering af 600-807 mutant blev også støttet af den stærkeste DLC1 ekspression i den nukleare fraktion opnået i den biokemiske fraktionering assayet sammenlignet med de andre DLC1 mutanter (fig. 3D). Tilsammen, fandt vi, at DLC1 region 600-700 i RhoGAP domænet også var involveret i den nukleare indtastning af DLC1.

(A) Skematisk diagram, der viser strukturen af ​​et panel af DLC1 fragmenter opsiges til aminosyre 807 og en række DLC1 indre deletionsmutanter til kortlægning nøgle websted den nukleare målretning. Strukturerne af vildtype DLC1 og Δ292-646 blev også angivet til sammenligning. (B) HeLa-celler blev transient transficeret med GFP-mærkede DLC1 ekspressionskonstruktioner angivet. Fokale adhæsioner blev modfarvet med anti-vinculin antistof. Den subcellulære lokalisering af DLC1 blev registreret ved at tælle mindst 100 transficerede celler per prøve. (C) Søjlediagram opsummerer procentdelen af ​​celler med cytoplasmiske og nukleare lokalisering af DLC1 og dens mutanter i (B). Resultaterne repræsenterer en kopi af to uafhængige forsøg. (D) HeLa-celler blev transient transficeret med de angivne GFP-mærkede DLC1 ekspressionskonstruktioner efterfulgt af subcellulær fraktionering. De fraktionerede cytoplasmatiske og nukleare lysater blev underkastet immunblotting med antistoffer mod GFP, tubulin (cytoplasmatisk markør) og c-jun (nuklear markør). (E) HeLa-celler blev transient transficeret med de angivne GFP-mærkede DLC1 ekspressionskonstruktioner, efterfulgt af LMB behandling. (E) Søjlediagram opsummerer procentdelen af ​​celler med cytoplasmatisk og nuklear lokalisering af DLC1 og dets mutanter i (D). Resultaterne repræsenterer en kopi af to uafhængige forsøg. Målestok:. 10 um

For yderligere at bekræfte vigtigheden af ​​denne roman region, vi slettede region 601-689 i DLC1 og vurderet sin lokalisering. Interessant nok fandt vi en markant reduktion i den nukleare lokalisering af DLC1Δ601-689 mutant efter LMB behandling (fig. 3E og 3F). Som det fremgår af den Δ415-431Δ601-689 mutant, hvor den tidligere rapporterede NLS og vores kortlagt hjemmeside blev slettet, sletning af 415-431 ikke yderligere reduceret den nukleare fastholdelse meget efter LMB behandling. Vores resultater antyder, at det tilknyttede hidtil ukendt sted spiller en væsentlig rolle i målretning DLC1 ind i kernen.

Nuclear DLC1 mistet sin inhiberende aktivitet til undertrykkelse kolonidannelse og actin stress fiber dannelse

in vitro

til dato er der ingen undersøgelse vurderer den direkte funktionelle sammenhæng mellem nuklear lokalisering og den biologiske funktion af DLC1. For at måle den funktionelle kapacitet af nuklear DLC1

in vitro

, vi skabte og bekræftede udtryk for en nuklear målrettet DLC1 (NLS-DLC1) (fig. 4A og 4B). Ved immunfluorescens, vi bekræftet, at NLS-DLC1 overvejende blev lokaliseret i kernen i SMMC-7721 celler. En NLS-drevet DLC1 RhoGAP mutant, NLS-K714E kunne også målrettet mod kernen så effektivt som vildtype DLC1 (fig. 4C). Vi derefter undersøgt integriteten af ​​actin stress fibre i SMMC-7721 celler transient transficeret med disse mutanter. I modsætning til adskillelse af actin stress fibre i DLC1 transficerede celler, kunne NLS-DLC1 kun delvis undertrykke actin stress fiber dannelse af (fig. 4D). Som en negativ kontrol, celler transficeret med DLC1 K714E viste intakte actin stress fibre. Lignende mønster blev observeret i celler, der udtrykker NLS-K714E yderligere underbygger, at vores nukleare målrette systemet ikke udøve uspecifik effekt på actin stress fiber dannelse. RhoGAP aktivitet af DLC1 har vist sig at være tæt forbundet med dens vækst suppressive aktivitet. Vi derefter udført kolonidannelse assayet at vurdere

in vitro

vækst undertrykkende aktivitet af NLS-DLC1 i både SMMC-7721 og HeLa-celler (data ikke vist). I overensstemmelse med den effekt på stress fiber dannelse, viste NLS-DLC1 stort set reduceret vækst undertrykkende aktivitet sammenlignet med DLC1 (Fig. 4E) Tager sammen, fandt vi, at nuklear DLC1 mistet evne til at undertrykke cellevækst.

( A) Skematisk diagram, der viser strukturen af ​​den nukleare målrettet DLC1 (NLS-DLC1) anvendt til forbigående ekspression eksperiment. DNA-sekvensen, der koder for det monopartite NLS, som består af fem grundlæggende aminosyrer KKKRK blev indsat foran den åbne læseramme af Myc-mærkede DLC1. Oversættelse af den manipulerede ekspressionskonstrukt kodet myc-mærket NLS-DLC1. (B) HEK293T lysater med overudtrykt Myc-tagget DLC1 eller NLS-DLC1 blev immunoblottet med anti-Myc-antistof. (C) SMMC-7721-celler blev transient transficeret med den angivne vildtype DLC1 eller RhoGAP mutant (K714E) konstruktioner. Myc-mærkede protein blev visualiseret ved anti-Myc-antistof efterfulgt af FITC-konjugeret sekundært antistof. Den subcellulære lokalisering af DLC1 blev registreret ved at tælle mindst 100 transficerede celler pr hver prøve. Bar graf viser procentdelen af ​​celler med nukleare DLC1 farvning. Resultaterne repræsenterer en kopi af to uafhængige forsøg. (D) SMMC-7721-celler blev transient transficeret med de angivne Myc-mærkede DLC1 konstruktioner og aktin stress fibre blev farvet med TRITC-konjugeret phalloidin 1 time efter det serum induktion. Stjernen (*) markerer DLC1-transficerede celler. (E) Søjlediagram der viser den relative kolonidannelse effektivitet SMMC-7721 celler transficeres med de angivne DLC1 konstruktioner og pEGFP-C1 vektor, der bærer neomycinresistensgenet i 10:01 forholdet. De transficerede celler blev selekteret med G418 i 2 uger. De dannede kolonier blev visualiseret ved krystalviolet-farvning og kvantificeret. Den gennemsnitlige forskel mellem den angivne gruppe blev fundet at være statistisk signifikant (***

P

0,005; uparrede

t

-test). Scale bar: 10 pm

Nuclear DLC1 ikke undertrykke

in vivo

tumorgenicitet

For at vurdere tumor undertrykkende aktivitet af nuklear DLC1

in vivo

, vi udførte stabil retroviral udtryk for nuklear målrettet Myc-mærket mus DLC1 i et p53 null mus hepatoblasts med konstitutiv RASV12 aktivering [11]. DLC1 blev målrettet mod kernen ved at indsætte en tandemgentagelse af tre monopartite NLS’er (NLS3) foran startkodonen af ​​muse DLC1 i den retrovirale ekspressionskonstruktion (fig. 5A). Efter selektion med puromycin blev de resistente kloner ekspanderes og over 95% resistente kloner blev fundet at være GFP positive, hvilket bekræfter den høje retroviral transduktion effektivitet (Fig. 5B). Vi bekræftede også den vellykkede nukleare målretning af mus DLC1 ved immunfluorescensfarvning for NLS3-DLC1 fusionsprotein. Vi fandt, at over 90% af de NLS3-DLC1 transducerede celler viste nuklear farvning sammenlignet med det cytoplasmatiske farvning i DLC1 transducerede celler. Baggrundsfarvning med anti-Myc-antistof var knap påviselig i vektoren celler (Fig. 5B). Vi bekræftede yderligere ekspressionsniveauet DLC1 proteiner ved immunoblotting (fig. 5C). For yderligere at bekræfte, at den egenskab nucleocytoplasmic shuttling blev bevaret i vores DLC1 overekspression hepatoblast model, vi behandlede DLC1 udtrykker celler med LMB efterfulgt af immunfluorescens. Vi fandt, at behandling med LMB konsekvent kunne tilbageholde DLC1 i kernen (fig. 5D). Denne observation understøttes yderligere, at den nucleocytoplasmic shuttling hotel blev bevaret i de menneskelige og mus DLC1 ortologer.

in vivo

tumorgenicitet af disse stabile kloner blev undersøgt ved subkutan injektion i nøgne mus. Konsekvent, DLC1 udviste suppression virkning på tumordannelse, mens nuklear DLC1 viste en signifikant reduktion i at undertrykke tumorigenicitet

in vivo

(fig. 5E og 5F).

(A) Skematisk diagram, der illustrerer den retrovirale vektorer anvendes til at drive stabil ekspression af myc-mærket mus DLC1 og den nukleare målrettede mus DLC1 (NLS3-DLC1). (B) Hepatoblasts inficeret med vektor, blev DLC1 eller NLS3-DLC1 retrovira fikseret, og ekspressionen af ​​Myc-mærkede protein blev visualiseret ved anti-Myc-antistof efterfulgt af Texas Red-konjugeret sekundært antistof. (C) Lysater af inficerede hepatoblasts med vektor, DLC1 eller NLS3-DLC1 retrovirus blev underkastet immunoblotting under anvendelse af antistoffer mod Myc, DLC1 og GFP. β-actin blev serveret som lastning kontrol. (D) Hepatoblasts inficeret med DLC1 retrovirus blev underkastet LMB behandling. Cellerne blev derefter fikseret og lokaliseringen af ​​Myc-mærkede DLC1 blev visualiseret ved anti-Myc-antistof efterfulgt af Texas Red-konjugeret sekundært antistof. Bar graf viser procentdelen af ​​celler med nukleare DLC1 farvning. Resultaterne repræsenterer en kopi af to uafhængige forsøg. (E) Den tumorigenicitet af de angivne retroviral transducerede hepatoblasts blev vurderet ved subkutan nøgne mus injektion. 1 × 10

5 hepatoblasts blev subkutant injiceret på dag 0 og volumenet af tumorstørrelsen blev overvåget dagligt fra dag 4. Alle mus blev aflivet på dag 14. På dag 14 blev musene aflivet, og tumorerne blev dissekeret. (F) De dissekerede tumorer blev vejet og deres masse blev registreret. Målestok:. 10 um

Det er blevet rapporteret, at ektopisk udtryk for DLC1 i DLC1 negative celler kunne inducere apoptose [19]. For at teste om NLS3-DLC1 udviste differentiel biologisk aktivitet i inducere apoptose, vi etableret og analyseret HEK293T celler stabilt udtrykker nuklear DLC1 ved flowcytometri for subG1 cellepopulationen (fig. S3B). For at undgå enhver mulig klonal effekt blev to kloner fra hver gruppe plukket til analysen. Vi fandt, at DLC1 udtrykkende celler viste en øget peak subG1 sammenlignet med vektoren og NLS3-DLC1 udtrykkende celler. DLC1 udtrykkende celler viste også en reduceret G1 men steg S population (fig. S3B). Plausibel forklaring på dette kan være, at DLC1 udtrykkende celler kan tilbringe længere tid i S-fase, når de træder cellecyklussen. Disse observationer gang vist, at NLS3-DLC1 var mindre robust til at inducere apoptose og formildende cellecyklusprogression sammenlignet med vildtype DLC1.

Diskussion

I silico

sekvensanalyse har afslørede en række potentielt basisk aminosyre rige todelte NLS’er i DLC1 [16]. Tilstedeværelsen af ​​disse motiver fik os til at spørge, om DLC1 eksisterer som et nukleart protein. I denne undersøgelse har vi vist, at DLC1 var et protein kontinuerligt sendt mellem cytoplasmaet og kernen i forskellige cellelinier. Denne observation giver en afbalanceret forklaring på tilstedeværelsen af ​​nukleare DLC1 og støtter dens iboende cytoplasmatisk lokalisering som demonstreret ved forskellige undersøgelser [10], [18], [20], [21], [22]. Det er bemærkelsesværdigt, at efter behandlingen med LMB, stadig fokal adhæsion lokaliseret DLC1 var detekterbar. Denne iagttagelse antydede, at kun ikke-specifik, cytoplasmatisk DLC1 blev tilbageholdt i kernen efter behandlingen. Focal vedhæftning lokaliseret DLC1 var relativt statisk i naturen. Denne observation er kompatibel med den partielle kernefarvning observeret for DLC1 fokal adhæsion lokalisering defekt mutant, Y442F i en lunge celle model [10]. Selv positiv kernefarvning kunne findes i normal ikke-neoplastisk lever i immunhistokemisk farvning, ville det være interessant at observere, om der er en skelnelig forskel nukleart DLC1 farvning mellem normalt levervæv og DLC1-positive HCCs (eller andre cancertyper).

Selv om tilstedeværelsen af ​​nuklear DLC1 tidligere er blevet diskuteret, dets tumor-undertrykkende aktivitet i kernen ikke blevet klart rettet. Til direkte undersøgelse af tumor suppressive aktivitet af nukleare DLC1, vi transient eller stabilt udtrykt NLS-DLC1 i HCC-cellelinier efterfulgt af en serie af funktionel karakterisering. Vi brugte denne metode i stedet at studere DLC1 mutant mangler kortlagt signal nukleare målretning (600-700 rester blev overlappet med RhoGAP domæne) som vi forudsagde, at fjerne denne signal ville forstyrre dens iboende RhoGAP aktivitet og gøre sammenligningen med vildtype DLC1 umuligt . Også til lang sigt LMB behandling producere nukleare DLC1 er også ugunstig og det blokerer globale nukleare protein eksport og udgør stress til cellerne [23]. Mens romanen funktion af nuklear DLC1 mangler at blive udforsket, vi bekræftet, at NLS-DLC1 var mindre effektive til at undertrykke cellevækst, opløsning formation RhoA-medieret actin stress fiber, og inducere celledød

in vitro

. NLS-DLC1 var også mindre effektive til at undertrykke tumorvækst i en mus xenograft model. Vi spekulere nukleare mislocalization kan være en potentiel mekanisme ophævelse DLC1 aktivitet i human cancer med intakt DLC1 udtryk.

Funktionelt, vores resultater er i modstrid med den konklusion, foretaget af tidligere rapporter. Yuan et al. demonstreret nuklear translokation af DLC1 kan inducere apoptose og lette dens tumor undertrykkende funktion i en forbigående udtrykt DLC1 negativ human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinie model [16]. Men vores stabile nukleare DLC1 udtryk model med mus hepatoblasts og menneskelig HEK293T celler hverken mislykkedes i at forbedre eller inducere apoptotisk delpopulation som indikeret ved flowcytometri analyse. Plausibel forklaring omfatter transient ekspression frembringer et meget højt niveau af DLC1 der kan forårsage toksicitet for cellerne; mens vores stabile cellesystem kan have været underkastet en form for tilpasning under stabile celle udvælgelse, der tillader cellerne at blive formeret med ekspressionen af ​​nuklear DLC1. Også de celle type og cellelinje afhængige effekter i at bidrage til forskellen i DLC1 aktivitet inducere apoptose og vækst anholdelse skal overvejes [11], [16], [24]. På den anden side har Scholz et al vist, at DLC1 S327AS431A mutanten kan ikke kompleks med 14-3-3 i cytoplasmaet og er biologisk mere aktiv end vildtype DLC1. Desværre, fandt forfatterne, at indførelsen af ​​negativt ladede rester i de angivne steder kan ikke efterligne konstitutiv aktiv 14-3-3 bindende konformation. Manglen på en gunstig mutant hindrer vurdering af, hvordan disse 14-3-3 bindende rester påvirker LMB følsomhed DLC1 [17]. Ved at antage DLC1 S327AS431A er mindre tilbøjelige til at blive afsondret i cytoplasmaet, kan man forudsige, at denne mutant kan være sendt ind i kernen oftere. Det er imidlertid i øjeblikket ukendt, om hyperaktivitet af denne mutant er et resultat af den forøgede nuklear indgang i kort sigt, eller skyldes den konformationelle ændring, der favoriserer DLC1 RhoGAP funktion. Det er muligt, at den øgede nukleare indtastning af en biologisk hyperaktiv DLC1 kan tjene som en negativ reguleringsmekanisme at nedregulere den hyperaktive DLC1 i en lang sigt.

To uafhængige undersøgelser har forsøgt at kortlægge NLS i DLC1 [16] , [17]. Yuan et al foreslog DLC1 415-431 er den formodede NLS, mens Scholz et al foreslog, at DLC1 nuklear transport kræver kun den sidste halvdel af det samme sted involverer resterne 428 og 429. Vi fandt imidlertid, at DLC1 mutant mangler hele foreslåede NLS kunne stadig bevares effektivt i kernen, hvilket indikerer ekstra strukturel sekvens i DLC1 kan være involveret i denne nukleare transport. For at løse dette, vi udførte detaljeret subcellulære lokalisering undersøgelse af GFP-DLC1 deletionsmutanter. Vi fandt, at DLC1 Δ292-646 mutant var mindre LMB følsomme. Konsekvent, fandt vi, at udtryk af fragmenter, der repræsenterer kun midterområdet af DLC1 viste nukleare lokalisering. Observationen indebærer, at ændringen i begge ender af DLC1 kan udsætte elementer, som er drivende kernelokalisering af DLC1. Ud fra disse data, vi yderligere foreslå og bekræfter, at regionen 600-700 i RhoGAP domæne er vigtig i dirigere kernelokalisering af DLC1.