PLoS ONE: Udnyttelse af Murine koloskopi for ortotopisk Implantation af kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

Kolorektal-cancer (CRC) forskning har i høj grad nydt godt af tilgængeligheden af ​​små dyr tumormodeller. Spontane og kemisk inducerede CRC-modeller er meget udbredt endnu begrænset i deres lighed med sygdomme hos mennesker og er ofte langvarig, ikke præcist gentagne, og associeret med inflammatoriske bivirkninger. In-situ murint eller humant tumorimplantation i mavetarmkanalen hos mus er ekstremt udfordrende, og begrænset af variation mellem dyr indbyrdes og procedure komplikationer og dødelighed. Som et resultat, i hyppige undersøgelser CRC er implanteret i distale steder, oftest den subkutane region, en tilgang, der er stærkt begrænset af mangel på normal gastrointestinal tumor miljø og har væsentlige virkninger på tumor udvikling.

Mål

i denne undersøgelse har vi foretrukket at udvikle veltolereret gentagne værktøj til at studere CRC i små dyr ved at tilpasse det murine koloskopi system til at fungere som en platform for colon sub-mucosale ortotopisk implantation af humane og murine CRC tumorceller.

Resultater

Vi rapporterer etablering af et nyt lille dyr CRC model, der er minimalt invasiv, hurtig, veltolereret, meget reproducerbar, og giver præcis styring af tumor nummer, placering og vækst sats. Endvidere viser vi, at denne model entydigt tillader side-by-side induktion af distinkte genetisk manipulerede tumorer, muliggør mekanistisk forsøg tumor interaktion og krydstale i det native intestinal mikromiljø.

Konklusioner

Beskæftigelse af denne nye fremgangsmåde kan være et stort teknisk fremskridt for

in vivo

studie af CRC

Henvisning:. Zigmond E, Halpern Z, Elinav E, Brazowski E, Jung S , Varol K (2011) Udnyttelse af murint koloskopi for ortotopisk Implantation af kolorektal cancer. PLoS ONE 6 (12): e28858. doi: 10,1371 /journal.pone.0028858

Redaktør: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, USA

Modtaget: Juli 17, 2011; Accepteret: November 16, 2011; Udgivet: 12. december, 2011

Copyright: © 2011. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Crohns Colitis Foundation of America (CCFA) (til S.J. nummer – 7108160101, website: www.ccfa.org). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal-cancer (CRC) er den næststørste årsag til dødelighed af kræft i mange industrialiserede lande [1]. CRC modeller i små dyr har givet vigtige redskaber til at undersøge de underliggende ætiologiske og patofysiologiske mekanismer i CRC udvikling og for den prækliniske vurdering af nye terapeutiske modaliteter. Talrige murine CRC modeller er blevet udviklet og beskrevet i litteraturen [2], [3]. De vigtigste metoder omfatter mutante mus, som udvikler spontane tumorer, behandling med en lang række af kræftfremkaldende stoffer, med eller uden induktion af kronisk inflammation og ektopisk eller orthotopisk implantation af tumorceller.

Spontane CRC transgene musestammer nøje efterligne human cancer syndromer, såsom HNPCC (HNPCC) [4] og familiær adenomatøs polypose (FAP) [5]. Disse modeller har vist sig uvurderlig for studiet af virkningerne af kendte genetiske ændringer på sygdomsforløbet. Men mange af disse musemodeller danner adenomer primært i tyndtarmen, og er typisk forbundet med en langsom vækst og betydelig variation mellem dyr indbyrdes [3] APC

Min /+ mus stamme blev etableret baseret på resultaterne afledt fra en kimcellelinje mutagenese studie med N-ethyl-N-nitrosourea kombineret med fænotypisk screening [5]. Selv om denne model er associeret med forekomsten af ​​et stort antal benigne adenomer i tyndtarmen, CRC tumorer udvikle sig i mindre end halvdelen af ​​dyrene. Alligevel behandle disse mus med den kræftfremkaldende middel azoxymethan (AOM) i det væsentlige forøger tumorincidensen i koloner fra disse mus, og denne model har vist sig at være nyttige til undersøgelse af virkningerne af kemoforebyggende forbindelser [6], [7].

Inducerbare CRC musemodeller, på den anden side, er almindeligt baseret på anvendelsen af ​​forskellige kræftfremkaldende stoffer, såsom azoxymethan (AOM), 1,2-dimethylhydrazin (DMH) og andre [2]. De kemisk inducerede etablerede tumorer deler mange af de histopatologiske karakteristika for ikke-arvelig human CRC [2], [8]. Tumorudvikling i disse modeller er blevet rapporteret at være i området fra 30 uger. Især kombinationen af ​​kræftfremkaldende forbindelse med kronisk inflammation, såsom i tilfældet med AOM /dextran natriumsulfat (DSS) model, har vist sig at forkorte latenstiden observeret i den klassiske model til ca. 10 uger, og at målrette induktion af tumorer hovedsagelig til den distale colon [8], [9]. Disse fordele, såvel som dets høje potens, enkel tilstand af ansøgningen, bred vifte af modtagelighed, og relativ omkostningseffektivitet, har gjort denne model meget almindelige i CRC forskning, og en fremragende forskning værktøj til at studere tidlige kræftfremkaldende begivenheder og evaluere potentielle terapeutiske tilgange [2], [8]. Men i denne model tumorer udvikler, under de miljømæssige påvirkninger af kronisk inflammation, en tilstand der efterligner inflammatorisk tarmsygdom (IBD) associeret CRC men ikke den meget mere almindelige sporadisk human CRC. Vigtigt er det, alle CRC

in- vivo Salg modeller nævnt ovenfor lider en iboende manglende evne til at styre tumor tal og vækstkinetik.

Adskillige ortotopisk murine CRC modeller er blevet beskrevet, hvoraf de fleste kræver en udløsende tilgang til injektion eller implantation af kræftceller i tyktarmen eller cecale lag [10], [11]. Kompleksiteten af ​​den kirurgiske procedure, hvilket resulterer traume, procedure-relaterede inflammation og dødelighed, alvorligt begrænse værdien af ​​disse systemer til undersøgelse af medfødte og adaptive anti-tumor immunrespons.

Hos mennesker endoskopisk undersøgelse af kolon er den vigtigste metode til opdagelse og opfølgende pleje af CRC. For nylig,

in vivo

murine endoskopi er blevet udviklet så høj opløsning billeddannelse af tyktarmen i levende mus, og gør det muligt for forskerne at direkte visualisere og score patologiske væv ændringer i tyktarmen [12], [13] og i intra for maskine organer [14]. Desuden indgreb såsom gentagne biopsier af colonlæsioner i levende mus under opfølgningsperioden af ​​et eksperiment, og deres efterfølgende proteomisk analyse har indført nye stærke redskaber til CRC forskning [15].

Vi præsenterer her for første gang en tilpasning af det murine koloskopi system og dets ansættelse til etablering af en ny ortotopisk musemodel af CRC. Denne fremgangsmåde giver en nem og ligetil løsning på de tekniske begrænsninger, der er forbundet med eksisterende CRC-modeller.

Resultater

Etablering af ortotopisk musemodel af CRC udnytte det murine koloskopi systemet

Lille dyr endoskopi betragtes i dag som den gyldne standard værktøj til overvågning af colon inflammatoriske lidelser og CRC. For at tilpasse dette system med henblik på ortotopisk implantation af CRC tumorceller i colon sub-mucosa har vi specielt konstrueret en hypodermisk nål, der kan passere gennem den endoskopiske kappe arbejdskanalen af ​​Karl Storz Coloview miniendoscopic system. De kanyler blev skræddersyet ifølge vores specifikation af kadencen Inc. USA, og er fremstillet af 8 tommer langt fleksibelt rustfrit fleksibel stål, med 30 gauge ydre diameter, og en kort skråkant i en 45 graders angel (fig S1). Denne kanyle giver flere design fordele; den fleksible stål sammen med nål dimensioner lindre injektionen manøvre og tillade glat passage gennem arbejdskanalen og Luer-lås, som er skruet på den for at undgå luftlækager. Desuden stumpe affasning tillader injektion i sub-mucosa med nedsat risiko for perforering eller spild af det injicerede materiale til hulrummet. Vi undersøgte først vævsfordelingen af ​​injicerede reagenser og vurderede passende injektionsvolumen ved at injicere tusch mærkning farvestof i colon sub-mucosa lag. Et injektionsvolumen på 50 pi gav den bedste kombination af minimal lækage og fokal spredning af trykfarven under epithellaget (figur 1A). Skylning af tyktarmen lumen ved at anvende saltvand gennem undersøgelsen kappe af endoskopet bekræftede lokalisering af den injicerede blæk under epithellaget (Film S1). Histologisk analyse bekræftede, at tusch tilbageholdes i colon lamina propria selv 5 dage efter sin ortotopisk injektion (fig S2A). Vigtigere, histologisk analyse af mus injiceret med sterilt Dulbeccos phosphatbufret saltvand uden calcium og uden magnesium (PBS

– /-) afslørede en normal sund colon arkitektur på injektionsstedet bekræfter, at denne metode er minimalt invasiv (fig S2B)

(A) Koloskopi billede præsentere colon sub-slimhinden injektion af Indien-blæk farvestof i C57BL /6 mus for vurderingen af ​​det relevante injektionsvolumen og dens fordeling på colon lamina propria. (B) Repræsentative koloskopi billeder angiver den gradvise udvikling af CRC tumor i samme C57BL /6 mus efter ortotopisk implantation af 1 × 10

5 MC38 CRC celler fra dag 5, gennem dag 12 til dag 19. (C-D) repræsentant billede af histologi prøve farvet med hematoxyline og eosin (H 0,05) i alle de tidspunkter for procentdel af colon omkreds såvel som for tumor klasse. Usædvanlige var sammenligningen af ​​tumorklassificering mellem 10E4 . 10E5 grupper i uge 3 som de fleste af tumorerne i disse grupper allerede var grad 5, der omfatter alle tumorer over 50% af colon omkreds

(A) repræsentant koloskopi billeder demonstrerer korrelationen mellem mængden af ​​injicerede MC38-tumorceller og størrelsen af ​​de etablerede CRC tumor 3 uger efter ortotopisk tumorcelleimplantation. (B) Grafer sammenfatter vækst kinetik, omkreds procent og udviklingsmæssige kvalitet af colon tumor i sammenhæng med mængden af ​​injicerede MC38 CRC celler. Bemærk en hurtig etablering af klasse 5 tumorer allerede 2 uger efter implantation af kun 1 × 10

5 MC38-CRC celler. Hver gruppe bestod af 5 mus.

Kollektivt, vi etableret her en ny metode til effektiv ortotopisk implantation af CRC tumorer under anvendelse murine endoskopi i en hurtig og minimalt invasiv måde med en begrænset mængde af celler, der kræves til injektion, og med en absolut kontrol på tumor s incidens, placering og vækst kinetik.

ortotopisk implantation af genetisk manipulerede CRC-tumorceller

en af ​​fordelene for kræft implantation end spontane udviklingslande tumormodeller er evnen til genetisk at modificere den etablerede tumor. Som et bevis på princippet, vi injicerede BALB /c mus med 1 × 10

5 CT26 murine CRC celler, som tidligere var blevet genetisk manipuleret til at udtrykke luciferase. Hele kroppen bioluminescens optisk billeddannelse (Biospace Photon imager) afsløret eksistensen af ​​en CRC tumor specifikt omkring injektionsstedet, der kunne være yderligere semi-kvantificeret i henhold til dens udsendte luminescens (figur 3A). Især kan denne fremgangsmåde være nyttig til vurdering af tumorbelastninger uden at skulle ofre musene. En yderligere ægte fordel ved den endoskopiske implantation model er evnen til at implantere flere tilstødende endnu adskilte tumorer i samme mus, der genetisk er blevet modificeret til at overudtrykke eller inaktivere gener af interesse, muliggør deres direkte sammenligning på identisk vært milieu. Ved hjælp af en lentiviral reporter-system, vi transduceret to distinkte fluorescerende reporter gener i MC38-cellelinien at etablere MC38-GFP og MC38-RFP linier (figur 3B øverste venstre panel). Injektion af MC38-GFP-celler og støder op til dem MC38-RFP-celler resulterede i den samtidigt dannelsen af ​​to genetisk identiske tumorer, der varierer kun ved deres placering og ekspression af de indsatte reportergener (figur 3B nederste venstre panel og højre panel) .

(A) Farvekodede repræsentativt billede af hele kroppen bioluminescens optisk billeddannelse af BALB /c mus 2 uger efter sub-slimhinden injektion af PBS

– /- (venstre museknap) eller 1 x 10

5 CT26 CRC tumorceller, der udtrykker luciferase og 10 minutter efter ip injektion af D-Luciferin. Bemærk luminescens emission specifikt fra det område af injicerede CRC tumorceller (højre mus). (B) Øverst til venstre panel – fluorescerende stereo-mikroskopisk billede oven på et foto grafisk billede af modtagerens C57BL /6 mus kolon 3 uger efter sin ortotopisk injektion med MC38 CRC celler, der blev genetisk manipuleret af lentiviral reporter-system til at udtrykke RFP, forstørrelse x10. Ned venstre panel – koloskopi billede af C57BL /6 mus kolon efter ortotopisk implantation af 2 tilstødende MC38 CRC tumorceller; MC38-RFP (rød pil) og MC38-GFP (grøn pil). Right panel – fluorescerende stereo-mikroskopisk billede oven på et foto grafisk billede af modtagerens C57BL /6 mus åbnet kolon 2 uger efter side-by-side ortotopisk injektion af MC38-RFP (distal) og MC38-GFP (proksimale) CRC tumorceller, forstørrelse x10. Bemærk induktion af 2 tilstødende CRC tumorer, som kun adskiller sig ved ekspressionen af ​​det transducerede reportergenet. Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Vi beskriver heri en roman ortotopisk murine CRC model baseret på tilpasning af kommercielt tilgængelige miniendoscopy system, der giver mange fordele i forhold til kendte murine CRC modeller. Det er en nem at anvende, minimalt invasiv, og meget reproducerbar fremgangsmåde, som kan anvendes på mus fra enhver genetisk baggrund. I denne model kan induceres både murine og humane CRC-tumorer. Modellen tillader også præcis styring af tumorforekomst og placering i tyktarmen. Desuden denne fremgangsmåde muliggør absolut kontrol på tumorvækst kinetik; det kan være meget hurtig nåede grad 5 i 2 uger efter implantation af kun 1 × 10

5 tumorceller, eller man kan forsinke det ved at injicere lavt antal celler. Vigtigere er det, denne tilgang undgår sikkerhedsstillelse skader og inflammation set i mange af de andre øjeblikket er beskæftiget modeller. Desuden er det entydigt muliggør induktion af genetisk manipulerede CRC-tumorer og sammenligningen af ​​flere særskilte tumorer etablerede side om side i samme mus undgå variation mellem dyr indbyrdes.

Ektopisk subkutan implantation af tumorcellelinier er almindeligt anvendt som et forskningsværktøj, især til vurdering af cytostatiske terapeutiske interventioner [17]. Men ektopisk implantation bort kompleksiteten af ​​den unikke egenskab makeup af den native mikromiljø. Faktisk er det blevet fastslået, at den inkongruente vært stroma kan påvirke tumorigenicitet og cellecyklusregulering forhold til implantation i det native væv seng [18], [19]. Fordelen ved at vælge en ortotopisk tilgang er af særligt betydning for tarm miljø, som er hjemsted for unikke immunologiske cellulære og molekylære enheder, der er bosat i kontinuerlig interaktion med mikrobiota og konstitutive udsættelse for kosten antigener.

Udførelse af mere end 200 ortotopisk CRC implantationer udnytte denne metode har sikret, at denne model er veltolereret og meget reproducerbar. Endnu en mulig komplikation af proceduren er perforering af tyktarmen og potentielt lækage af luft og celler til bughulen. Øjeblikket, i vore hænder, denne komplikation er sjælden, udgør mindre end 5 procent af alle procedurer. Dødeligheden under proceduren er yderst sjældent og kan ske på grund af bedøvelsen eller perforation. Tumor forekomst i overlevende mus (95%) er 100%, altid kulminerede i en eneste tumorudvikling specifikt på injektionsstedet. Af note, brug af en stiv sigte giver mulighed kun adgang til den distale halvdel af tyktarmen og således, begrænser ortotopisk implantation af denne tilgang til dette område.

CRC er stadig den anden førende årsag til dødelighed kræft i mange industrialiserede lande. Forsøg gennemført in små dyr har vist sig at være afgørende for forståelsen af ​​sygdommens patofysiologi samt for den prækliniske vurdering af nye terapeutiske modaliteter. Alligevel er murine CRC modeller begrænset i deres lighed med human sygdom. Dette gælder især med hensyn til dannelsen af ​​CRC tumormetastaser. En bemærkelsesværdig ulempe ved CRC murine modeller er den generelle mangel på invasive og metastatiske fænotype [2]. I AOM /DSS modellen infiltrative snore af epitelceller blev beskrevet at bryde muscularis mucosa og nå også sub-slimhinde lymfesystemet, selv om meget sjældent [20]. Ligeledes vi sjældent vidne lokal invasiv af tumor-afledte celler, men aldrig opdage distale metastaser ved hjælp af vores tilgang. De relativt hurtige vækst kinetik forbundet med vores model, som tvang den tidlige offer af implanterede mus omsorgsfulde en klasse 5 CRC tumor, sandsynligvis blive en ulempe for induktion af en metastatisk tumor. Selv ortotopisk implantation af humane CRC-celler, der vides at være aggressivt metastatisk kroppen til at inducere en metastatisk tumor. Den fælles hindring deles af murine CRC modeller til at etablere en metastatisk tumor kan indebære, at den intestinale murine miljø ikke støtter metastaser formation. Ikke desto mindre kan det være blive til en ønsket model for dem, der ønsker at undersøge den potentielle rolle af maligne gener. Til støtte for dette, kan vores system bruges til at inducere dannelsen af ​​genetisk manipulerede tumorer, hvor vi over-udtrykkelige eller stilhed gener af interesse.

Vi mener, at denne nye ortotopisk CRC model er et stort teknisk fremskridt for

in vivo

undersøgelse af CRC, og kan især bruges til at undersøge nye terapeutiske modaliteter, tumor er genetik og mekanismer vækst, og dets interaktioner i forbindelse med den indfødte tarm mikromiljø.

Metoder

Etik Statement

Alle dyreforsøg blev godkendt af Tel Aviv Sourasky Hospital etisk komité for dyreforsøg og var i overensstemmelse med de højeste internationale standarder for human pasning af dyr i biomedicinsk forskning. godkendelsesnummer Udvalg -. 037_b3428_8

Dyr

8-10 uger gamle hanner C57BL /6, Balb C og Athymiske nøgne mus blev opnået fra Harlan biotek (Rehovot, Israel). 8-10 uger gamle hanner NOD SCID mus blev venligst stillet til rådighed af prof. Tsvee Lapidot (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel).

Athymiske nøgne mus blev sub-lethaly bestrålet (450 rad) før ortotopisk implantation af humane CRC cellelinjer at eliminere immuno-afvisning. Dyr havde ubegrænset adgang til mad og vand, blev huset i temperatur og fugtighed-kontrollerede værelser, og blev holdt på en 12-timers lys /mørke cyklus.

kolorektale tumorceller

Murin C57BL /6 CRC tumorceller (MC38) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Avi Eisenthal (Tel Aviv Sourasky Medical center). Luciferase stably- transfekterede murine CRC tumorceller (CT26) blev venligst stillet til rådighed af Prof. Lea Eisenbach (Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel). De humane CRC tumor celle-linjer SW620, SW480 og LS174T blev venligst stillet til rådighed af prof. Zelig Eshhar (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). HT-29 human CRC celle-linje var den generøse gave af Dr. Isabel Zvibel (Tel-Aviv Sourasky Medical Center, Tel-Aviv, Israel). Alle cellelinier blev opretholdt i 5% CO

2 ved 37 ° C i høj glucose DMEM medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 1% af Penicillin streptomycin antibiotisk opløsning, 1% L-glutamin-opløsning og 1% natrium pyruvat løsning.

Generering af MC38 CRC tumorceller, der udtrykker GFP eller RFP

MC38-GFP og MC38-RFP CRC tumorceller blev genereret af transduktion med pCSC-SP-PW-IRES-GFP /RFP lentivira designet til at udtrykke GFP eller RFP med MOI på 50 (venligst stillet til rådighed af Dr. Alon Chen, Weizmann Institute of Science Rehovot, Israel). Efterfølgende blev MC38 celler, der udtrykker GFP eller RFP sorteres til høj renhed ved hjælp af en høj hastighed FACSAria II sorteringsanlæg (Beckton-Dickinson).

Murin endoskopisk systemet

Vi ansat en høj opløsning mus video endoskopisk-system ( ” Coloview systemet ”), som tidligere beskrevet for murine endoskopiske procedurer [12] – [14], som består af et miniature endoskop (anvendelsesområde 1,9 mm ydre diameter), en xenon lyskilde, en tredobbelt chip kamera, og en luftpumpe til opnå reguleret oppustning af muse tarm (Karl Storz, Tuttlingen, Tyskland). Den endoskopiske procedure blev set på en farveskærm og digitalt optaget på bånd.

ortotopisk colon sub-slimhinden implantation af CRC celler

Mus blev bedøvet ved hjælp af ketamin /xylazin. Sub-slimhindeirriterende injektioner blev udført ved hjælp af rustfrit fleksible rustfrit stål; 8 tommer lang, 30 gauge og 45 graders koniske kanyler specialfremstillede ifølge vores specifikation (Cadence Inc. U.S.A). Nålen blev indsat gennem Luer lock (Söllner, GmbH) skrues på arbejdsmiljøet kanal af anvendelsesområdet for at undgå luft lækage. Efterfølgende blev omfanget indsat i muse colon og efter inflationen nålen blev bragt igennem arbejdskanalen til anvendelsesområdet front. celleimplantation procedure CRC blev udført ved to koordinerede personer; én person var navigere koloskopi, mens den anden person opererede injektion manøvre. Injektionen blev udført under observation ved en meget blid sub-mucosale penetration med den åbne side af affasningen overskrift op i en flad vinkel. En volumen på 50 mikroliter CRC tumorer celler blev derefter sprøjtet ind i colon sub-slimhinde.

In-vivo

imaging

At følge luciferase-udtrykkende CT26 CRC tumor implantation og vækst i BALB /c-mus, 50 ul D-Luciferin (30 ug /ml) blev ip injiceret 10 minutter før og efterfølgende mus blev indsat i det lukkede mørke kammer af hele kroppen afkølet CCD-kamera Photon Imager systemet (Biospace Lab, Frankrig) . For

in vivo

visualisering af GFP og RFP positive tumorer Leica MZ16F fluorescerende stereomikroskopserien system blev anvendt (Leica Microsystems, Tyskland).

Histologi

Væv blev fikseret i 4% paraformaldehyd natten over ved 4 ° C, indlejret i paraffin, serielt i snit (15 um), og farvet med hematoxylin og eosin (Sigma).

Objektglas blev observeret ved anvendelse af Olympus BX51 mikroskop, og billedoptagelse blev gennemført med Olympus DP70 kamera og DP-manager-softwaren.

CRC tumor vækst kinetik

C57BL /6 mus blev orthotopisk sub-slimhinde injiceret med 10

3, 10

4 eller 10

5 MC38-celler. Tumoren er colon omkreds og udviklingsstadiet blev overvåget over tid ved koloskopi hver uge i 3 uger efter celle implantation. Endoskopisk sortering blev gjort i overensstemmelse med tumorstørrelse relativt til omkredsen af ​​tyktarmen som fastsat af Becker et al [12]. Kort sagt, blev tumorstørrelse gradueret som følger: Grade 1 (bare påviselig tumor), Grade 2 (tumor dækker op til 1/8 af colon omkreds), Grad 3 (tumor dækker op til 1/4 af colon omkreds), Grade 4 (tumor dækker op til 1/2 af colon omkreds) og Grade 5 (tumor dækker mere end 1/2 af colon omkreds).

Statistisk analyse

resultaterne blev analyseret ved envejs ANOVA og post-analyse med Bonferroni s flere sammenligning tests.

Støtte oplysninger

figur S1.

Specielt tilpassede kanyler anvendes til orthotopisk injicere tumorcellerne i colon sub-mucosa. De kanyler er lavet af 8 tommer langt fleksibelt rustfrit stål, med 30 gauge ydre diameter, og en kort skråkant i en 45 graders angel. Bemærk, at nålen er indsat gennem Luer lock, der efterfølgende skruet på arbejdsmiljøet kanal endoskopet for at undgå luft lækage

doi:. 10,1371 /journal.pone.0028858.s001

(TIF)

figur S2. Salg Sub-slimhinde injektioner af PBS

– /- og tusch. Repræsentative billeder af histologi prøver farvet med hematoxyline og eosin (H LS174T humane CRC cellelinier hhv.