PLoS ONE: Mod opdage nye anticancer-midler Målretning Topoisomerase IIα: En Facile Screening strategi tilpasses til høj Throughput Platform

Abstrakt

Topoisomeraser er en familie af vitale enzymer, der kan løse topologiske problemer i DNA under forskellige genetiske processer. Topoisomerase giftstoffer, blokering genforening spaltede DNA-strenge og stabilisere enzym-medieret DNA spaltning kompleks, er klinisk vigtige antineoplastiske og antimikrobielle midler. Men den hurtige stigning i resistens, der hæmmer den terapeutiske virkning af disse livreddende lægemidler gør opdage nye blyforbindelser stadig mere presserende. Vi rapporterer her en letkøbt high throughput screening for agenter målrettet menneskelig topoisomerase IIα (Top2α). Bestemmelsen er baseret på måling af fluorescens anisotropi af en 29 bp fluorofor-mærket oligonucleotid dupleks. Da lægemiddel-stabiliseret Top2α-bundet DNA har en højere anisotropi sammenlignet med frit DNA, kan dette assay fungere, hvis man kan bruge en dissocierende middel til specifikt forstyrre enzym /DNA binære komplekser, men ikke den lægemiddel-stabiliseret ternære komplekser. Her demonstrerer vi, at NaCIO

4, et chaotropt middel, tjener en kritisk rolle i vores screeningsmetode til at skelne den lægemiddel-stabiliseret enzym /DNA-komplekser fra dem, der ikke. Med denne strategi screenes vi et kemisk bibliotek på 100.000 forbindelser og opnåede 54 positive hits. Vi karakteriseret tre af dem på denne liste, og vist deres virkninger på Top2α-medierede reaktioner. Vores resultater tyder på, at denne nye screening strategi kan være nyttige i at opdage yderligere kandidater af anti-cancer midler

Henvisning:. Lin YS, Huang WC, Chen MS, Hsieh Ts (2014) Mod opdage nye anticancer-midler Målretning Topoisomerase IIα: En Facile Screening strategi tilpasses til høj Throughput Platform. PLoS ONE 9 (5): e97008. doi: 10,1371 /journal.pone.0097008

Redaktør: Maria Spies, University of Iowa, USA

Modtaget: December 26, 2013; Accepteret: 14. april, 2014 Udgivet: 8. maj 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Research Program for Biopharmaceuticals (Chembank og High-throughput screening Resource center, NSC-101-2325-B-001-029), og NSC (NSC102-2325 og NSC103-2811). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

DNA transaktioner, der overfører og genoprette genetisk information uvægerligt medføre afvikling og tilbagespoling af dobbelt spiralformede strukturer. På grund af den topologiske sammenhæng mellem sekundære og højere orden DNA-strukturer, den spiralformede afvikling /tilbagespoling resultat i sammenfiltring og sikringsanlæg af kromosomer og DNA. Disse topologiske forviklinger vil skulle løses på en rettidig og præcis måde, uden hvilke celler ikke kan overleve. Topoisomeraser er naturens løsning på disse tilsyneladende uløselige topologiske kompleksiteter [1] – [6]. De udfører disse topologiske transformationer gennem en cyklus af reversibel transesterificering mellem det aktive site tyrosyl rest og fosfat rygraden i DNA. Den forbigående enzym /DNA additionsprodukt skaber en DNA gate gennem hvilket et andet DNA-segment kan transporteres og resulterer i topologiske ændringer. Baseret på strukturen og mekanismen, er topoisomeraser inddeles i to typer: type I enzym medierer strengen transport gennem en enkelt streng DNA gate medens type II-enzymet transporterer DNA-segment gennem en dobbeltstreng gate. Begge typer topoisomeraser er yderligere klassificeret i to familier, A og B, og disse enzymer er allestedsnærværende i naturen og har væsentlige funktioner for vækst og udvikling af alle organismer [7], [8].

Interessant forbigående og reversible DNA pauser medieret af topoisomeraser, så kritisk for deres biokemiske og biologiske funktioner, også oprette en akilleshæl for cellerne. Mange cytotoksiske midler, syntetiske eller natur-producerede, mål på dette trin af topoisomerase reaktion og stabilisere spaltning mellemliggende dermed skabe potentielt dødelige DNA streng brud [5], [9] – [14]. Nogle af disse topoisomerase målretning agenter har vist sig at være klinisk vigtig anti-cancer medicin og antibiotika. Den terapeutiske effekt af disse livreddende lægemidler er ofte kompromitteret på grund af stigningen af ​​lægemiddel-resistens i tumor eller mikrobielle celler. Søgning efter nye modaliteter og narkotika bliver stadig mere presserende, hvis vi ønsker at holde trit med truslen om resistens. På grund af de væsentlige roller topoisomeraser i celledeling og fordi de er bevist mål for klinisk nyttige lægemidler, er det rimeligt at forvente, at der skal afsættes intensiv indsats for at opdage flere lægemidler rettet mod topoisomeraser. Men de biokemiske analyser, der oftest bruges til overvågning af topoisomerase aktiviteter ikke let kan tilpasses til automatisering og høj platform. For biokemiske assays de mest alsidige assays er baseret på anvendelsen af ​​agarosegelelektroforese, da det kan detektere DNA strukturelle overgange forbundet med strengen spaltnings- og passage aktiviteter af topoisomeraser. Den arbejdskrævende natur og den besværlige proces i at erhverve data gør gelelektroforese usandsynlig en metode til automatisering og kvantificering.

For at rette op på dette problem, er der en række tilgange udviklet for nylig, at der kan tilpasses til automatiseret high throughput platform til at identificere topoisomerase-targeting forbindelser [15] – [18]. De er alle fluorescens-baserede topoisomerase aktivitetsassays, således mere medgørlige til automatiseret kvantificering. de er imidlertid også karakteriseret ved anvendelse af en plasmid-DNA ved fremgangsmåden ifølge assays. Vi rapporterer her vores bestræbelser i udviklingen af ​​en ny fremgangsmåde under anvendelse af en fluorofor-mærket oligonucleotid dupleks som et substrat til bestemmelse af dannelsen af ​​stabiliserede topoisomerase /DNA-komplekser i nærvær af en specifik kandidat-middel. Vi beskriver vores indledende skærm ved hjælp af denne analysering teknik af et kemisk bibliotek med 100.000 forbindelser og karakterisering af tre af de positive hits. Denne screeningsmetode kan tilvejebringe en alternativ tilgang til at opdage nye topoisomerase målretning agenter og berige vores arsenal til at bekæmpe tumorer og mikrobielle patogener.

Materialer og metoder

Rensning af human Top2α

Vi anvendte et konstrueret YEpWob6, en vektor med hexahistidin-mærkede human Top2α under en

GAL1

inducerbar promotor, til at udtrykke rekombinant human Top2α i gær [19]. Gærceller efter galactose induktion blev høstet, resuspenderet i hypertonisk puffer (1 M sorbitol, 20 mM kaliumphosphat pH 7,4, 20 mM 2-mercaptoethanol) og lyseret ved tilsætning lytiske enzym (Zymolyase 100T, Amsbio). Kerner blev høstet ved centrifugering (20 minutter ved 55,000X

g

), resuspenderes i en puffer af 20 mM kaliumphosphat pH 7,4, 0,2% Triton X-100, 5 mM 2-mercaptoethanol med en proteasehæmmer cocktail herunder 1 mM PMSF, 2 pg /ml leupeptin, og 1 ug /ml pepstatin A og homogeniseret. Vi udvundet Top2α fra kerner ved at øge NaCl-koncentrationen til 500 mM og fjernet nukleare pellet ved centrifugering ved 15,000X

g

i 25 min. Supernatanten blev fraktioneret ved 3 kromatografiske trin (GE Healthcare). Det første var en HisTrap FF råt Ni-chelaterende søjle og Top2α blev elueret ved 40 mM imidazol med en gradient af 20-200 mM imidazol, i 20 mM kaliumphosphat pH 7,4, 500 mM NaCI og 0,1% Triton X-100. De samlede fraktioner blev fortyndet tre gange med 20 mM kaliumphosphat pH 7,4, og yderligere oprenset gennem HiTrap SP-søjle. Top2α eluerede ved 500 mM NaCl i en gradient af 200-800 mM NaCl. De samlede fraktioner blev fortyndet tre gange med 20 mM kaliumphosphat pH 7,4, og påført til Mono S 5/50 GL-søjle. Top2α blev elueret ved 500 mM NaCl og fraktionerne blev samlet, dialyseret natten over mod 50% glycerol, 15 mM natriumphosphat pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM PMSF og 5 mM 2-mercaptoethanol og opbevaret ved -20 ° C. Den endelige Top2α fraktion er over 90% rent og har en specifik aktivitet på mindst 10

6 enheder /mg med én enhed defineres som den mængde enzym er nødvendigt for at slappe af 0,5 ug pUC19 DNA i 30 min.

DNA Substrater

Fluorescerende DNA-substrat (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA) er designet svarende til hvad der tidligere blev beskrevet (Smiley, Collins et al. 2007), en 29 bp oligonucleotid dupleks, der indeholder en top2 spaltningssted i centrum og Alexa Fluor 488 i 3′-enden. Plasmid pUC19 DNA oprenses ved CsCI dobbelt banding, phenol-chloroform ekstraktion og alkohol nedbør blev brugt til afslapning og spaltningsprodukter assays (Sander og Hsieh 1983).

Pre-HTS (high throughput screening) Anisotropi Assay

I 50 pi Top2 reaktionspuffer indeholdende 10 mM Tris-HCI pH 7,9, 5 mM MgCl

2, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 0,5 mM ATP. 50 nM Alexa Fluor 488-mærket DNA, 1,25 pM human Top2α, og teniposid (VM26) i en række koncentrationer fra 60 til 300nM, blev reaktionsblandingen inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Før måling af anisotropi, NaCIO

4 blev tilsat til opnåelse af en slutkoncentration på 250 mM. Eksperimenter tester effekten af ​​NaClO

4 koncentrationer viste, at inden for et interval på 100-750 mM det har en lignende effekt i modulerende fluorescens anisotropi (at være detaljerede i Resultater afsnit).

For at teste effekten af Rækkefølgen for tilsætning, blev 50 nM Alexa Fluor 488-mærket DNA, 250 nM human Top2α, og 250 mM NaCIO

4 med eller uden 300 pM VM26 indført i en anden rækkefølge til 50 pi reaktionsbuffer. Den samlede reaktionstid var 30 minutter ved 37 ° C, medmindre andet er angivet.

For at undersøge de positive hits efter anisotropi-assay under bulk-betingelser, blev reaktionen udført i 50 pi reaktionsbuffer indeholdende 50 nM Alexa Fluor 488 -mærket DNA, 250 nM human Top2α, og 15 uM testforbindelse. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter før tilsætning NaCIO

4.

anisotropi assays under bulk-betingelser blev målt ved Fluorolog-3 Spektrofluorometer (Hiroba Scientific) forsynet med to polarisatorer i kanalerne for excitation og emission ved anvendelse af L-format metode. Den excitation og emission bølgelængde var 492 nm og 515 nm, hver med en spaltebredde på 2 nm, og forstærkningen G-værdi sat til 1.

High Throughput Anisotropi Screening

For HTS blev screeningerne udført på Genomics Research center of Academia Sinica i Taiwan, efter protokollen tidligere offentliggjorte og brug af kemisk bibliotek genereret og indsamles dér [20]. Kort fortalt blev screeninger udført i 1536-brønds plader ved anvendelse af high-throughput screening (HTS) -systemet fremstillet af GNF systemer (GNF, San Diego, CA). Det HTS-systemet er integreret med dispensere, en 1536-polet overførsel værktøj, væksthuse og en ViewLux pladelæser (Perkin Elmer Inc.). Reaktionsvolumenet var 4 pi per brønd indeholdende 100 nM Alexa Fluor 488-mærket DNA med 150 nM human Top2α i reaktionspuffer. Efter 30 minutters inkubation ved 37 ° C, 100 mM NaCIO

4 blev tilsat til hver brønd for at standse reaktionen, og anisotropien værdi blev målt. Screeningen blev udført med et repræsentativt bibliotek af 100.000 kemikalier i en koncentration på 12,5 pM. 300 uM teniposid (VM26) blev inkluderet som en positiv kontrol, mens 5% DMSO var den negative kontrol. Z blev beregnet ved hjælp af følgende formulering:. SD af MAX og SD af MIN er standardafvigelsen af ​​positive og negative kontroller. En screeningsmetode egnet til HTS platform vil have en Z faktor større end 0,5. Med den første runde screening af over 100.000 kemikalier, blev 107 testforbindelser scoret positivt af de kriterier, der skal beskrives i teksten. Anden screeningsrunde blev udført ved at teste anisotropien udlæsninger på 8 forskellige koncentrationer af hver kandidatforbindelse ved hjælp af to gange fortyndinger startende fra 12,5 uM. Kun forbindelserne resulterer i 20% stigninger i detekterede signaler i de negative kontroller, og viser dosisafhængige reaktioner ved to eller flere punkter blev defineret som hits. Der var 54 hits scoret i anden runde af screening.

Afslapning Analyser

I 20 ul Top2 reaktion buffer indeholdende 8,5 nM negative supersnoede pUC19 0,125 nM human Top2α med enten 5% DMSO, eller 60 uM testforbindelser blev reaktionerne udført ved 37 ° C i 5, 10 eller 15 minutter, afsluttet ved tilsætning af SDS til 0,25%, EDTA til 10 mM og proteinase K til 0,4 mg /ml, yderligere inkuberet ved 50 ° C i 1 time og analyseret ved elektroforese i 1,2% agarosegel.

spaltningsanalyser Salg

i en reaktion buffer indeholdende 8,5 nM negativ supersnoet pUC19, 3,75 nM human Top2α og 150 uM teniposid (VM26) eller som angivet i teksten, blev reaktionerne inkuberet ved 37 ° C i 15 minutter, og afsluttet ved tilsætning af SDS til 0,25%, EDTA til 10 mM og proteinase K til 0,4 mg /ml, eller ved tilsætning NaCIO

4-til 500 mM i 2 minutter efterfulgt af tilsætning af proteinase K til 0,4 mg /ml. Inkubation blev fortsat ved 50 ° C i 1 time, og prøverne blev analyseret ved elektroforese i 1,2% agarosegel indeholdende 0,15 ug /ml ethidiumbromid. Til afprøvning spaltningsreaktionerne med et lineært DNA-substrat, blev pUC19 spaltet med ScaI for at fremstille en længdeenhed molekyle. Restriktionsenzymet behandlede DNA blev oprenset og anvendt i spaltningsreaktioner.

For at teste virkningerne af positive hits i spaltningsreaktionen blev testforbindelser fortyndet i tre forskellige koncentrationer, 16, 64 og 256 uM, og reaktionerne blev udført og analyseret som beskrevet ovenfor.

glycerol gradient Sedimentation og topoisomerase Påvisning ved Immunoblots

en 3,5 ml glycerol gradient fra 30-60% i Top2 reaktionspuffer blev fremstillet i et polyallomer centrifugerør og lagdelt med en 80 pi top2 reaktionsblandinger som beskrevet i tekster. Centrifugering blev udført ved 55.000 rpm i 16 timer ved 20 ° C i TFT-80.4 rotor (Thermo Scientific). En 22-gauge nål blev anvendt til at gennembore røret og fraktioner blev opsamlet fra bunden. 50 pi prøve af hver fraktion blev sat på en forgennemvædet PVDF-membran under anvendelse af en slot-blot-manifold (Hoefer PR 648) apparat. Efter påføring blev membranen blokeret i 1 time ved stuetemperatur i 5% skummetmælk fremstillet i TBS-buffer (25 mM Tris-HCI pH 8,0, 125 mM NaCl). Blokeret membran blev inkuberet natten over ved 4 ° C med et gede-antistof mod human Top2α (1:5000; Santa Cruz Biotechnology, sc-5348). Membranen blev derefter bearbejdet for kemi-luminescens med ECL-reagens (Millipore, WBKLS0500) efter producentens anbefalinger.

Cytotoksicitetsassay

cytotoksicitet assay blev udført med HCT116-celler ved anvendelse af CellTiter 96 AQ

ueous One Solution Cell Proliferation Assay kit ifølge producentens protokol (Promega). Kort fortalt blev HCT116 celler podet i 96 brønds-plader ved en celledensitet på 7500 celler per brønd i DMEM i 24 time. Efter fjernelse medium, blev eksponentielt voksende celler inkuberet med 1 pi testforbindelse ved 6 dobbelte fortyndinger i et slutvolumen på 100 pi i hver brønd. Efter en 72 timers inkubation ved 37 ° C blev celler genopfyldes med frisk medium indeholdende 10 pi MTS tetrazolium og inkuberet i en time. Formazanen omdannet af de levende celler blev overvåget ved 490 nm. Kontrolceller indeholder 1% DMSO uden testforbindelse. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange.

Resultater

Vi brugte renset fuld længde human Top2α og fluorofor-mærket, dobbeltstrenget oligonukleotid indeholder en topoisomerase bindingssted at udvikle fluorescens-baserede assay (fig 1A). Ordningen af ​​screening for Top2α-målretning forbindelser er illustreret skematisk i fig 1B. Dette assay er baseret på målingen af ​​fluorescens polariserbarhed (anisotropi) som en indikation af, om et protein er bundet til fluoroforen-mærkede DNA. Ved excitation med polariseret lys, emissionen fra fluoroforen af ​​DNA substrat hvis opholder immobil, er også polariseret. Rotationshastighed diffusion ændrer retningen af ​​overgangen øjeblik og forårsager depolarisering. Topoisomerase-DNA-komplekset, kovalent eller ikke-kovalent, har en lavere tumbling rate og resulterer i en højere anisotropi. På den anden side, den frie DNA har en højere tumbling rate og dermed en lavere anisotropi. Da anisotropi assay kan let automatiseres, kan vi foretage high-throughput screening (HTS) for at identificere potentielle blyforbindelser målrettet mod Top2α. Men en central udfordring for denne screening assay til at fungere korrekt, er at differentiere narkotikarelaterede stabiliseret Top2α-DNA-komplekserne fra todelte Top2α-DNA-komplekser. Vi skal bruge en reagens at forstyrre den sidstnævnte kompleks, men opretholde det tidligere.

(A) Det fluorescerende DNA-substrat blev syntetiseret med en kendt Top2 spaltningssted (angivet ved pile). Alexa Fluor 488 markeret med asterisk blev mærket i 3′-enden. (B) Skematisk repræsentation af anisotropi-baserede Top2α lægemiddelscreening. Topoisomerase-DNA-komplekset, kovalent eller ikke-kovalent, har en langsommere roterende diffusion og resulterer i en højere anisotropi. Efter behandles med et protein-dissocierende middel, så er der ikke-kovalent bundet Top2α fjernet, og frit DNA har en lavere anisotropi. Hvis en Top2α-targeting middel stabiliseret kovalente enzym-DNA-komplekser, vil anisotropien forblive høj.

Behandling med NaCIO

4 kan resultere i en stigning i anisotropi afhængig af tilstedeværelsen af ​​et anti- cancer drug teniposid (VM26)

Brug teniposid (VM26) som model forbindelse til vores screeningsanalyse, testede vi, om en række almindeligt anvendte denatureringsmidler reagenser, herunder alkali og SDS kan give mulighed for at detektere den forbedrede stabilitet af Top2α -DNA-komplekser i nærvær af et anticancerlægemiddel. Da alkali danner fine præcipitater med Mg

++ i reaktionspuffer og SDS genererer minimal bobler begge reagenser skaber uacceptable artefakter for mikrotiter-baserede fluorescens assays. Vi opdagede, at en stærk chaotropisk reagens NaClO

4 opfylder vores krav som en dissocierende reagens i fluorescens assays. Efter tilsætning af NaClO

4-til 250 mM til den bindende reaktionsblanding, stabiliteten af ​​Top2α-DNA-komplekser som overvåget ved fluorescens anisotropi viser en klar dosisafhængig stigning som VM26-koncentrationer varierende fra 0 til 300 pM (Fig 2A ). Uden tilsætning NaCIO

4 anisotropien forbliver den samme uanset VM26 koncentration. For yderligere at bekræfte, at VM26-inducerede anisotropi ændring er enzym afhængig, udførte vi anisotropien måling uden topoisomerase i de ellers identiske reaktionsbetingelser. Af resultaterne vist i figur 2B, bekræftede vi, at lægemidlet afhængig stigning af anisotropi efter behandling med NaCIO

4 blev Top2α-medieret.

(A) Reaktioner af Alexa Fluor 488-mærket DNA med humant Top2α var udføres med VM26 koncentrationer på 60, ​​120, 180, 240 og 300 uM. En dosis-afhængig stigning i anisotropi med stigende VM26 koncentrationer blev observeret, hvis reaktionerne blev afsluttet med NaCIO

4 (udfyldt firkant), men ikke uden at det (tom trekant). (B) Den dosisafhængige stigning af anisotropi Med stigende VM26 blev observeret, når reaktionerne indeholdt humant Top2α (udfyldt firkant), men ikke uden at det (tom firkant).

Tilsætning af NaCIO

4 ophæver Top2α binding til DNA, men bevarer narkotikarelaterede stabiliseret enzym-DNA ternære komplekser

for at undersøge, om forøgelsen af ​​anisotropi efter tilsætning af NaClO

4 kommer fra Top2α-bundne DNA-komplekser, testede vi virkningerne af ændring af rækkefølgen af ​​tilsætning af nøglekomponenter i disse reaktioner. I mangel af NaClO

4, anisotropien af ​​DNA-enzymkomplekser er 0,19 (Fig 3A-II), og tilsætningen af ​​NaClO

4 reducerer anisotropien til 0,06 (Fig 3A-III), en værdi tæt med den for frit oligonukleotid (fig 3A-i). Dette resultat viser, at NaCIO

4 er i stand til at dissociere enzym fra DNA. Mens dannelsen af ​​enzym-DNA og teniposid (VM26) ternære kompleks resultater i NaCIO

4-resistent anisotropi (Fig 3A-IV), inkubation uden Mg

++ (figur 3A-V) eller præ-inkubering af enzymet med NaClO

4 før tilsætning af DNA, uanset tilstedeværelsen af ​​VM26, fører til en lavere anisotropi (fig 3A-VI og VII). Dette resultat antyder, at NaCIO

4 er i stand til at inaktivere enzymet og inhiberer enzymets evne til at danne DNA bundet komplekser. Da Mg

++ er nødvendig for de enzymatiske aktiviteter topoisomeraser, kravet om Mg

++ antyder, at simpel binding ikke er tilstrækkelig til dannelsen af ​​NaClO

4-resistente kompleks. Undtagen for VM26-stabiliserede ternære komplekser, behandling med NaCIO

4 i alle andre betingelser reducerer anisotropien til en værdi svarende til den frie DNA-substrat, hvilket bekræfter, at NaCIO

4 er i stand til at forstyrre enzym-DNA-komplekser uden en Top2α-targeting middel. For at demonstrere koncentration afhængighed af NaCIO

4 for at muliggøre specifikt detektering af VM26-stabiliserede enzym-DNA-komplekser, analyserede vi anisotropien af ​​binære kompleks efter tilsætning forskellig mængde NaCIO

4 (fig 3B). De maksimale dissociation niveauer blev nået på en NaClO

4 koncentration på 100 mM, med IC

50 ved 40 mM, og der er små variationer op til 750 mM. Vi har således vist, at NaClO

4 er et effektivt middel til at forstyrre protein /DNA-komplekser med en bred koncentrationsområde mellem 100-750 mM, og den kan tilpasses til brug i HTS for Top2α målretning agenter.

(A) blev observeret The VM26-afhængig stigning i anisotropi, når reaktionen blev afsluttet med NaCIO

4 (reaktion IV vs reaktion III), og ikke når NaCIO

4 blev tilsat i nærvær af Top2α før tilsætning af DNA, uanset tilsætningen af ​​VM26 (reaktioner VI og VII vs reaktionsskema IV). Anisotropi observeret i kontrollerne var kun DNA (reaktion I), DNA /Top2α uden VM26 (Reaktion II), og inkubation uden Mg

++ (Reaktion V). (B) Optimering af NaCIO

4 koncentration til anisotropi assay. Reaktionen blev udført i 50 pi Top2 reaktionsbuffer med 300 pM VM26, 50 nM Alexa Fluor 488-mærket DNA og 250 nM human Top2α. Reaktionsblandingen blev inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Før måling af anisotropi, NaCIO

4 blev tilsat til hver reaktionsblanding til opnåelse af en slutkoncentration op til 750 mM. Den maksimale udstrækning af dissociation blev opnået ved en koncentration på 100 mM eller derover. (C) Anisotropi observeret med etoposid (VP16), mamsa, mitoxantron (MXT), og med teniposid (VM26) som positive kontroller, efter behandling med 200 mM NaClO

4. Koncentrationerne af disse kendte Top2α lægemidler, der anvendes her var 300 uM for VP16 og VM26, og 15 uM for mamsa og MXT.

For at teste, at vores anisotropi analyser kan være effektive til at identificere andre kendte Top2α-targeting anti-cancer medicin udover teniposid (VM26), vi målte anisotropi efter NaClO

4 behandling med etoposid (VP16), mamsa, og mitoxantron (fig. 3C). Ligner den, der målt med teniposid, alle tre kendte kræft narkotika produceret anisotropi udlæsninger over kontrollerne.

NaClO

4 kan fremme dannelsen af ​​hakkede DNA i narkotikarelaterede stabiliseret Top2α ternære komplekser

virkningerne af NaClO

4 i forstyrre Top2α-bundne DNA-komplekserne blev undersøgt med et oligonucleotid substrat overvåges af fluorescensanisotropi analyser. For yderligere at undersøge de potentielle mekanistiske roller NaClO

4 i Top2α reaktioner, vi beslutter at bruge plasmid-DNA som substrat, som giver anvendelsen af ​​agarosegelelektroforese at undersøge DNA strukturelle ændringer. Med en stærk denaturerende SDS at afslutte reaktioner med plasmid-DNA, nærvær af et anticancerlægemiddel lignende teniposid (VM26) kan indeslutte spaltelige komplekser og øge produkterne af lineariseret og nicked DNA. Vi udførte eksperimenter for at undersøge DNA-produkter der genereres fra en reaktionsblanding indeholdende Top2α-DNA-VM26 ternære komplekser, der blev afsluttet med enten SDS eller NaCIO

4. For at fjerne proteiner, der var forbundet med DNA efter behandling med disse dissocierende reagenser blev de stoppet reaktionsblandinger behandles med proteinase K før deres analyse med agarosegelelektroforese. Reaktionsprodukterne efter at være afsluttet med SDS viste det forventede af forekomsten af ​​lineariserede DNA overvejende, og nogle hakkede arter samt (Fig 4A). I en interessant kontrast, reaktionsprodukterne genereret fra NaCIO

4 behandling gav mere nicked DNA-produkter og mindre lineariseret formular. Med NaCIO

4 for at stoppe reaktionerne, produktion af nicked og lineariserede former steg parallelt ved stigende VM26 koncentrationer i disse reaktioner (figur 4B), hvilket viser, at begge produkter sandsynligvis blev genereret gennem VM26 indsats på indfangning spaltelige komplekser. Foregående rapport allerede viste, at VM26 fremmer dannelsen af ​​enkeltstrengede DNA-nicks, foruden dobbeltstrengede pauser, afhængigt concertedness af spaltning fra to protomerer i Top2 dimer [21]. Både biokemiske og strukturelle biologiske data viste, at hver protomer kan binde et enkelt lægemiddel molekyle, hvis tilstedeværelse kan påvirke spaltning /religering medieret af det dimere enzym [22], [23]. Det resultat, at NaCIO

4 tendens til at producere mindre lineariserede spaltningsprodukter, og mere hakker form skyldes muligvis, at det er en mindre potent denatureringsmiddel end SDS og mindre effektiv til at inducere dannelsen af ​​spaltningsprodukter komplekser. Man kan således forvente at observere mere lineariserede produkter med tilstedeværelsen af ​​mere enzym og som følge heraf mere spaltelige komplekser. Vi kunne vise, at ved at øge enzymet til DNA støkiometri, det lineariserede DNA-produkter steg samtidig med den nicked form, når reaktionerne blev afsluttet med NaCIO

4 (Fig 4C). Under de samme reaktionsbetingelser, men termineret med SDS, det lineariserede produkter var yderligere nedbrudt til opnåelse af DNA-fragmenter mindre end enheden længde molekylet. DNA-spaltning og huldannelse induceret af NaCIO

4 er ikke begrænset til de cirkulære DNA-substrater. Vi kunne let påvise DNA-spaltning med lineær substrat ved højere enzym /DNA-forhold (fig 4D). Nedbrydningen af ​​DNA til generering sub-fuld længde-molekyler fra NaCIO

4 behandling skyldes den tætte afstand mellem to nicks på sidestillede strenge og også nogle dobbeltstrenget spaltning under sådanne betingelser. Men under de samme betingelser tilsætning af SDS kan fremkalde mere omfattende DNA-forringelser, der viser, at SDS er en stærkere denatureringsmiddel og mere effektive i at udløse Top2α spaltningsreaktionen. Interessant, når SDS og NaCIO

4 blev tilsat sekventielt, kan SDS fremme dannelsen af ​​mindre DNA-produkter, selv når det blev tilsat efter NaCIO

4. Dette resultat igen antyder, at NaClO

4 ikke helt forstyrrer enzym /DNA /narkotika ternære komplekser, stadig bevare deres følsomhed over for SDS at fremme flere spaltningsprodukter komplekser.

(A) Reaktioner af menneskelig Top2α og pUC19- plasmid DNA blev afsluttet med enten NaClO

4 eller SDS. Tilsætning af NaCIO

4-til 100 mM fører til dannelse af mere nicked DNA-produkter, mens tilsætningen af ​​SDS resulterer i en præference af lineære dem. Reaktioner blev udført med 8,5 nM pUC19, 3,75 nM Top2α, og 100 uM VM26, termineret med tilsætningen af ​​enten NaCIO

4 eller SDS, reaktionsprodukterne blev behandlet med proteinase K, og analyseret ved elektroforese i 1,2% agarosegel indeholdende 0,15 ug /ml ethidiumbromid. (B) DNA-spaltning blev udført under lignende betingelser bortset med stigende koncentrationer af VM26 efterfulgt af tilsætning af NaCIO

4. En stigning i det klippede DNA spaltningsprodukter blev observeret med højere mængder af VM26. (C) Plasmid DNA-spaltning blev udført ved hjælp af forskellige enzym til DNA-forhold som angivet. Lineær DNA-produkter (fuld længde eller sub-fuld længde) fra SDS behandling og både hakker og lineær DNA fra NaClO

4 behandling stigning med højere enzym til DNA-nøgletal. (D) Reaktioner i nærvær af forskellige koncentrationer af VM26 indeholdt lineære pUC19 som substrat med et enzym /DNA-forhold på 20, efterfulgt af tilsætning af NaCIO

4 eller SDS, eller begge sekventielt, for at stoppe reaktionerne. De størrelsesmarkører, og lineære pUC19 blev lagt i længst til venstre to baner. Positioner af DNA blev markeret som NC (hakker cirkulære), L (lineær), NSC (negativ supersnoede), og RC (afslappet).

NaClO

4-behandlede ternære komplekser analyseret ved ultracentrifugering i glycerol gradienter

Vi anvendte ultracentrifugering i glycerol gradienter for at undersøge stabiliteten af ​​Top2α-DNA-komplekser efter behandlingen af ​​NaClO

4, og effekten af ​​en anti-cancer medicin. Glycerol gradientcentrifugering blev ofte brugt til separate makromolekyler på basis af deres størrelse og form. Vi inkuberet Top2α med plasmid-DNA, enten i nærvær eller fravær af VM26, og anvendt det til glycerolgradient direkte eller efter behandling med NaCIO

4. Fraktionerne blev opsamlet efter centrifugering og placeringer af Top2α blev bestemt ved western blots med antistof mod Top2α. I mangel af VM26, Top2α sedimenterede mere mod bunden uden NaClO

4 behandling (figur 5, bane 1 vs 3). Tilstedeværelsen af ​​NaCIO

4 skift Top2α til en lettere fraktion, i en position svarende til frit enzym (figur 5, bane 3 versus 5), hvilket således bekræfter evnen hos NaClO

4 at forstyrre enzym-DNA-komplekset i den fravær af et anticancerlægemiddel. I nærvær af VM26, behandling med NaCIO

4 ikke groft ændre sedimentation af Top2α, hvilket antyder, at NaCIO stadig fastholder

4 fleste af de ternære komplekser (figur 5, bane 2 vs 4). Eksperimenter fra både fluorescensanisotropi og gradient sedimentation glycerol støtte opfattelsen af ​​at NaClO

4 behandling tilvejebringer et middel til at differentiere stabiliteten af ​​Top2α-DNA-komplekser afhængigt af tilstedeværelsen af ​​et anti-cancer lægemiddel, der dermed er os en tilgang til automatiseret screening assay og gør det muligt for brug i HTS platform.

gradient opløsning glycerol er lagdelt i en polyallomer rør startende fra 60% til 30% glycerol. Reaktionen til Top2α /DNA-kompleksdannelse blev udført i 80 pi af en opløsning indeholdende 100 uM VM26, 34 nM pUC19 og 3,75 nM human Top2α.