PLoS ONE: Spyt MicroRNA i bugspytkirtelkræft Patienter

Abstrakt

Baggrund

Kræft i bugspytkirtlen er den fjerde hyppigste årsag til kræft død i de vestlige lande, med den laveste 1 års overlevelse blandt almindeligt diagnosticeret kræft. Pålidelige biomarkører for kræft i bugspytkirtlen diagnose mangler og er et presserende behov for at give mulighed for kurativ kirurgi. Som microRNA (miRNA) for nylig dukket op som kandidat biomarkører for denne sygdom, vi udforsket i nærværende pilotundersøgelse forskellene i spyt microRNA profiler mellem patienter med pancreas tumorer, der ikke er berettiget til kirurgi, forstadier til kræft, inflammatorisk sygdom eller kræft-fri patienter en potentiel tidlig diagnostisk værktøj.

Metoder

Hele spytprøver fra patienter med kræft i bugspytkirtlen (n = 7), pancreatitis (n = 4), IPMN (n = 2), eller raske kontroller (n = 4) blev opnået under endoskopisk undersøgelse. Efter total RNA isolation blev udtryk af 94 kandidat miRNA screenet af q (RT) PCR ved hjælp Biomark Fluidgm. Menneskelige-afledte bugspytkirtelkræftceller var xenotransplanteret i atymiske mus som en eksperimentel model af kræft i bugspytkirtlen.

Resultater

Vi identificerede HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR- 23b og miR-29c som værende signifikant opreguleret i spyt af bugspytkirtlen kræftpatienter sammenlignet med kontrol, som viser følsomhed 71,4%, 85,7%, 85,7% og 57%, henholdsvis og fremragende specificitet (100%). Interessant er HSA-miR-23a og HSA-miR23b overudtrykt i spyt hos patienter med kræft i bugspytkirtlen prækursorer læsioner. Vi fandt, at HSA-MIR-210 og lad-7c overudtrykkes i spyt hos patienter med pancreatitis sammenlignet med kontrolgruppen, med følsomhed på 100% og 75%, og specificiteten af ​​100% og 80%, hhv. Sidste HSA-MIR-216 blev opreguleret hos cancerpatienter i sammenligning med patienter diagnosticeret med pancreatitis, med følsomhed på 50% og specificitet på 100%. I eksperimentelle modeller af PDAC, spyt microRNA afsløring forud systemisk detektion af kræftceller markører.

Konklusioner

Vores nye resultater viser, at spyt miRNA er diskriminerende i bugspytkirtelkræft patienter, der ikke er berettiget til kirurgi. Desuden viser vi i forsøgsmodeller, som spyt miRNA detektion forud systemisk detektion af cancerceller markører. Denne undersøgelse stilke for brug af spyt miRNA som biomarkør for tidlig diagnosticering af patienter med inoperabel kræft i bugspytkirtlen

Henvisning:. Humeau M, Vignolle-Vidoni A, Sicard F, Martins F, Bournet B, Buscail L, et al. (2015) Spyt MicroRNA i bugspytkirtelkræft Patienter. PLoS ONE 10 (6): e0130996. doi: 10,1371 /journal.pone.0130996

Redaktør: Kandiah Jeyaseelan, National University of Singapore, Singapore

Modtaget: December 10, 2014 Accepteret: 27. maj 2015; Udgivet: 29 juni 2015

Copyright: © 2015 Humeau et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. Disse forfattere har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser: forfatterne har indgivet et patent på “brug af spyt microRNA til diagnosticering af kræft i bugspytkirtlen “. Et udkast er blevet skrevet i samarbejde med vores IP-afdeling (INSERM Transfert), og deponeret under # EP15305020.8 men er endnu ikke tilgængelig online. Ikke desto mindre, ændrer dette ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker vedrørende datadeling og materialer. Forfatterne har ikke andre relevante erklæringer om beskæftigelse, rådgivning, patenter, produkter i udvikling eller modificerede produkter.

Introduktion

Pancreas duktalt adenokarcinom (kræft i bugspytkirtlen, PDAC) er den fjerde førende årsag til kræft død i de vestlige lande, med de laveste fem-år i forhold [1] og 1-års overlevelse [2] satser blandt almindeligt diagnosticeret kræft. kræft i bugspytkirtlen forventes at flytte til den anden hyppigste årsag til kræft død på verdensplan i 2020 i fravær af forbedringer i behandlingen [3]. Der er i øjeblikket ingen midler til pålidelig diagnosticering af tidlige stadier af kræft i bugspytkirtlen. Følgelig langt størstedelen af ​​patienterne (85%) viser en fremskreden sygdom, der resulterer i en lav resektion sats (15% af patienterne), hvilket fører til en trist samlet median overlevelse på 4 til 6 måneder. Således kan opdage biomarkører for tidlig kræft i bugspytkirtlen diagnose favorisere tidlige patienternes ledelse og prognose.

MikroRNA’er (miRNA) har for nylig dukket op som en ny klasse af robuste biomarkører for cancer diagnose, herunder PDAC [4]. Disse potente regulatorer af genekspression kan kvantificeres grundigt i forskellige væv og væsker, på grund af deres iboende høj stabilitet i sammenligning med proteiner og messenger-RNA’er. Af betydning, kan miRNA kvantificeres i meget lave mængder af materiale, herunder mikro-biopsier, og i stærkt nedbrudte prøver. De seneste rapporter viste udførligt, at miRNA profiler med succes kan skelne normale fra kræft i bugspytkirtlen væv, og kan også forudsige kræft prognose eller respons på behandling [4]. Stabiliteten af ​​miRNA er igen fremhævet som miRNA profilering i plasma nylig blev demonstreret at differentiere PDAC patienter fra raske kontroller [4]. Sådanne fund bane vejen for anvendelsen af ​​cirkulerende miRNA som minimalt invasiv PDAC biomarkører.

Flere andre kropsvæsker, såsom urin, sæd og spyt er for nylig blevet betragtet som depoter til cancerdiagnose [5,6]. Spyt har den overordnede fordel, da prøvetagningen er enkel, ikke-invasiv, forårsager lidt angst hos patienter og kan gentages. Spyt er blevet påvist at indeholde proteiner /peptider, nukleinsyrer, elektrolytter og hormoner, der stammer fra både lokale og systemiske kilder og nyere undersøgelser har foranlediget interesse for at anvende spyt som en kilde til biomarkører. Anvendelse af spyt til detektion af orale sygdomme er blevet grundigt påvist [7], og spyt nylig vist sig som en rig kilde til miRNA, såsom har-MIR-31, til oral cancer diagnose [8-11]. På den anden side, spyt anvendelse til systemisk sygdom er stort set uklar. I de seneste år, metabolisk [12], transkriptom [13] og mikrobiota [14] spyt profiler blev demonstreret at besidde diskriminerende effekt til påvisning af PDAC, med høj specificitet og følsomhed.

Så vidt vi ved, anvendelse af spyt miRNA til diagnosticering af ikke operérbar bugspytkirtelkræft er ikke blevet rapporteret til dato. Derfor er målet med denne undersøgelse var at udforske de videnskabelige beviser og give en begrundelse for brugen af ​​spyt for inoperabel PDAC detektering, der repræsenterer langt størstedelen af ​​patienter diagnosticeret med denne kræft. I denne pilotundersøgelse, fandt vi, at fire spyt miRNA (HSA-mir-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b og HSA-miR-29c) med succes segregerede PDAC patienter fra cancer-fri donorer, mens HSA-miR -210 og lad-7c indikerer pancreatitis og HSA-mIR-216 diskriminerer pancreatitis af kræft. Derudover viser vi her i forsøgsmodeller af PDAC at spyt miRNA detektion forud detektering af systemiske cancerceller markører. Tilsammen præsenterer vi foreløbige data, der viser signifikante forskelle i miRNA profiler mellem spyt fra patienter med PDAC og spyt fra patienter, der er tumor-fri. De opdagede spyt biomarkører besidder iboende diskriminerende potentiale for en noninvasiv diagnostisk værktøj for PDAC hos patienter, der ikke er berettiget til kirurgi.

Materialer og metoder

Patienter

Denne protokol var godkendt af Etisk Komité (

Comité de Protection des Personnes Sud-Ouest et Outre Mer N ° 1

,

nummer 1-10-21

). For at undgå forurening blod, blev patienterne bedt om ikke at børste deres tænder inden for 45 minutter før prøvetagning. Spyt blev indsamlet ved brug sterile tips og mikropipetter under endoskopisk undersøgelse under generel anæstesi med propofol. Spyt blev straks anbragt i præ-kølet 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende og tilsvarende volumen spyt beskytte reagens (Qiagen) og opbevaret ved -80 ° C indtil den skal bruges. I denne pilotundersøgelse, vi inkluderet patienter i alderen 18 år, der havde givet deres skriftligt informeret samtykke. Andre kriterier for optagelse var ingen kontraindikationer for generel anæstesi eller til endoskopisk ultralyd. Fin nål aspiration materiale blev anvendt til histologisk, cytologiske og molekylære (KRAS aktiverende mutation analyse [15]) diagnose af pancreatitis eller pankreascancer. Enogtyve patienter blev inkluderet i denne undersøgelse; 7 blev diagnosticeret med lokalt fremskreden inoperabel kræft i bugspytkirtlen, 4 blev diagnosticeret med pancreatitis (enten akut eller kronisk) og 4 havde ubeslægtede fordøjelsessygdomme (kontrolgruppe) (tabel 1). Patienter diagnosticeret med intraduktal papillære mucinous neoplasi (IPMN) (n = 2) blev også inkluderet. Patienterne blev ikke behandlet før spyt samling.

Eksperimentel protokol

blev udført Alle dyr forsøg i henhold til de nationale etiske retningslinjer for eksperimentel forskning og protokol blev godkendt af den regionale etiske komité Anexplo UMS 006 for dyreforsøg og blev udført i overensstemmelse med vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (amerikanske National Institutes of Health). Humane bugspytkirtelkræft-afledte Mia PACA-2 celler, der udtrykker secerneret Lucia luciferase [16,17] dyrkes i RPMI-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, L-glutamin, et antibiotikum, en antimycotisk cocktail (Life Technologies), og Plasmocin ( InvivoGen) i en fugtig inkubator ved 37 ° C i 5% CO

2. Seks to-uger gamle kvindelige nu /nu-mus blev bedøvet ved intraperitoneal injektion af pentobarbital (80 mg /kg) fortyndet i 0,9% NaCl, suppleret med oral anæstesi anvendes oxygen /isofluoran (2,5 blanding) og Mia PACA-2 Lucia celler blev implanteret i halen af ​​bugspytkirtlen som beskrevet tidligere [16,17]. Spytsekretion blev ikke stimuleret af pilocarpin. Spyt blev opnået fra mundhulen ved mikropipette og øjeblikkeligt anbragt i præ-kølet 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende og tilsvarende volumen spyt beskytte reagens (Qiagen). Samling blev afsluttet på 20 minutter, og prøver blev opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. For ikke-invasiv sporing af tumorvækst blev blod udtaget prøver ved retro-orbital indsamling og centrifugeret ved 1000 x

g

i 10 minutter i mikrocentrifugerør behandlet med EDTA. Lucia produktion blev målt i 5 pi af plasma under anvendelse af coelenterazin (50 uM) som substrat. For miRNA kvantificering undersøgelser blev tumorer frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil anvendelse. Ved slutningen af ​​eksperimenterne blev mus aflivet ved injektion af en dødelig dosis af pentobarbital.

RNA-ekstraktion

Før spytprøver blev anvendt, blev de optøet på is og centrifugeret i 15 minutter ved 2600 x

g

ved 4 ° C. Den cellefri supernatant blev opsamlet fra pelleten og anvendt umiddelbart i det næste trin. Totalt RNA blev isoleret fra 250 uL spyt supernatant og fra tumorer under anvendelse Trizol LS-reagens (Life Technologies) og miRNAeasy ekstraktion kit (Qiagen), hhv. DNase I-behandling (DNase I, Qiagen) blev anvendt til at fjerne kontaminerende DNA under RNA-ekstraktion. Koncentrationen af ​​total RNA blev målt ved anvendelse NanoDrop N-100.

miRNA kvantificering

Samlet spyt, cellulær eller tumor-RNA (20 ng) blev revers transkriberet og præ-amplificeret under anvendelse af Universal cDNA syntese kit (Exiqon), efterfulgt af Specific Target Amplification (STA) ved hjælp af TaqMan preamp Master Mix (Life Technologies) og samlet 94 microRNA LNA PCR primer sæt (Exiqon, opført i S1 tabel). Efter 15 pre-amplifaction cyklusser blev STA reaktionerne fortyndet 1:10 i nuklease frit vand. qPCR Assay Mix bestod af TaqMan Gene Expression Master Mix (Life Technologies), DNA Binding Dye Sample Loading Reagent (Fluidigm), EvaGreen (Biorad), Frem og Reverse primer mix (Exiqon) og Assay Loading Reagens, og forberedt som pr fabrikantens anbefalinger . Prøver og prøve-blandingen blev fyldt på en Fluidigm chip (Fluidgm) og kvantitativ realtids-PCR reaktionen blev kørt ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 30 cyklusser ved 95 ° C i 10 sekunder og 60 ° C i 1 minut på Fluidigm platform (Fluidgm). Kvantificeringen cyklus (Cq) værdien defineres som den cyklus nummer i fluorescensemissionen, som overstiger den for en fast tærskelværdi. En Cq af 15 til 30 blev anset høj ekspression og en Cq på 35 betragtes som lav udtryk. En Cq værdi over 40 blev betragtet som ikke målbart miRNA. Data normalisering blev udført ved hjælp af RQ Manager 1.2.1 og Data Assist v3.0 fra Applied Biosystems.

Statistisk analyse

qPCR-baserede genekspression værdier mellem de forskellige grupper blev sammenlignet ved hjælp af ikke-parametrisk Wilcoxon rank-sum test. Kandidat biomarkør miRNA blev derefter udvalgt på baggrund af P 0.05

Resultater

Identifikation af kræft i bugspytkirtlen-specifikke spyt miRNA

Til denne pilotundersøgelse blev 94 miRNA udvalgt fra litteraturen som følger:. Tidligere rapporterede biomarkører for kræft, tidligere rapporterede biomarkører for kræft i bugspytkirtlen, påvises i blodet hos patienter med kræft eller fundet i spyt af patienter med kræft (S1 Table). Ekspression af kandidat miRNA blev screenet ved q (RT) PCR under anvendelse Biomark Fluidgm hos patienter med kræft i bugspytkirtlen (n = 7), pancreatitis (n = 4), intraduktal papillær mucinøs neoplasi (IPMN, n = 2) eller uden cancer (n = 4) (tabel 1).

af de 94 miRNA, 23 miRNA var målbart i alle testede prøver (S2 tabel). Vi fandt, at 4 miRNA (HSA-MIR-21, HSA-miR23a, HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29c) var signifikant udtrykt i spyt fra patienter med kræft i bugspytkirtlen (n = 7), mens der ikke kan påvises i spyt hos kontrolpatienter (n = 4, Wilcoxon test, 0.001

s

0,03) (figur 1 og tabel 2). Udtrykket af kandidatlandene miRNA var strengt specifikt af kræft i bugspytkirtlen (100%) med fremragende følsomhed (fra 57% til 86%, tabel 2). Kandidat- miRNA blev også påvist inden for spyt fra patient diagnosticeret med andre kræftformer (n = 2, tabel 2), mens HSA-miR23a og HSA-MIR-23b blev påvist i spyt hos patienter diagnosticeret med IPMN, en velkarakteriseret precursor læsion af PDAC. At bemærke, HSA-MIR-21, HSA-miR23a, kunne påvises HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29c i spyt hos patienter med pancreatitis (figur 1).

Resultater er præsenteret som Whiskers boks (min-max) og gennemsnitlig (+) er angivet.

s Drømmeholdet værdi (ikke-parametrisk Wilcoxon rank-sum test) er angivet.

Pancreatitis er en fælles betændelse i bugspytkirtlen. Trods moderne billeddiagnostiske teknikker, problemerne fortsætter at differentiere PDAC fra godartede sygdomme som kronisk betændelse i bugspytkirtlen, især i sin pseudotumoral form [15]. Sådan overvejelse er kritisk for at undgå unødvendig resektion af godartede læsioner (såsom fokale læsioner af kronisk pancreatitis eller autoimmun pancreatitis) eller at forsinke behandlingen af ​​PDAC i en undergruppe af patienter. Vi har tidligere vist, at RNA-signaturer [18] eller

KRAS

mutation analyse [15,19] kan være nyttige til diagnostisk. I det foreliggende arbejde, vi undersøgt, om spyt miRNA kan betegne en ikke-invasiv metode til screening for pancreatitis detektion. Vi fandt, at spyt HSA-MIR-216 kan hjælpe diskriminere pancreatitis fra PDAC, med fremragende specificitet (100%), men ringe følsomhed (50%) (tabel 3). På den anden side er HSA-MIR-210 og lad-7c overudtrykt i spyt hos patienter diagnosticeret med pancreatitis, men kunne ikke påvises i spyt hos kontrolpatienter (tabel 4). Desuden HSA-MIR-210 viser bemærkelsesværdig specificitet og følsomhed for pancreatitis, enten kronisk eller akut (100%, tabel 3). På den anden side blev HSA-MIR-210 påvises i spyt hos patienter med PDAC. Tilsammen vores pilot undersøgelse tyder stærkt på, at spyt miRNA kan være nyttige til diagnosticering af pancreatitis og ikke resektabel PDAC.

spyt miRNA forud protein-baserede, systemisk detektion af PDAC i forsøgsmodeller

Derefter undersøgte vi den kinetiske af spyt miRNA detektion i eksperimentel model af pancreascancer. Mia PACA-2 humanafledt bugspytkirtelkræftceller blev implanteret i pancreas fra athymiske mus (n = 6). Vi fandt, at disse celler og deraf xenotransplantater udtrykker høje niveauer af HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a, HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29c (S3 og S4 tabellerne). Disse celler blev manipuleret til at udtrykke høje niveauer af secerneret luciferase for protein, systemisk-baseret, ikke-invasiv tumor overvågning [16,17]. Eksperimentelle bugspytkirtelkræft tumorer blev detekteret 25 dage efter tumorcelle indpodning ved hjælp systemisk dosering af secerneret luciferase og før de blev palpable (figur 2). Salg

Resultater er gennemsnit ± S.D. af 6 biologiske replikater udført i eksperimentelle triplikater. miRNA er udtrykt i Cq er Lucia niveau udtrykt i relative lysenheder (r.l.u.). Den grå zone svarer til tumor påvisning ved secerneret Lucia som en systemisk, protein-baserede tumormarkør.

Interessant HSA-MIR-21 blev let detekteret i høje niveauer i spyt fra tumorbærende mus, så snart som 14 dage efter tumor induktion (middelværdi Cq = 24.41 ± 1.29 fig 2 og S5 Table), mens der ikke kan påvises i spyt hos tumor-fri dyr (data ikke vist). Desuden spyt HSA-MIR-21-ekspression forblev forhøjede i løbet af forsøget (figur 2). På den anden side, blev spyt HSA-MIR-23a, HSA-MIR-23b og HSA-MIR-29c påvist i lave niveauer i spyt hos PDAC-bærende mus (fig 2 og S5 Table). Således har vi validere HSA-miR-21 som en spyt biomarkør i denne eksperimentelle model af PDAC; derudover vores resultater tyder på, at spyt miRNA er mere følsomme end systemiske proteinmarkører til diagnosticering af pancreas tumorer.

Diskussion

Et vigtigt spørgsmål i bugspytkirtelkræft forskning er behovet for biomarkører for tidlig diagnose, ikke kun for tidlig påvisning af sygdommen i kohorte af patienter, men også for at fremskynde beslutningstagningen i vanskelige at diagnosticere bugspytkirtlen masser. Dette er yderst vigtigt i betragtning af, at patienternes overlevelse og prognose af den fase af tumoren på tidspunktet for diagnosen. Teoretisk set kan tidlig diagnose giver mulighed for tumor resektion og er normalt forbundet med den bedste prognose. Men det er vanskeligt at tidlig diagnose og den høje forekomst af metastase forbundet med kræft i bugspytkirtlen bidrage til dens dystre prognose [1]. Således har de sidste par år været vidne til intensiv undersøgelse i at søge efter mere følsomme, specifikke og omkostningseffektive biomarkører. Til dato er mange molekylær-baserede, multi-omik strategier udnyttes til at nå dette mål. Tissue miRNA blev for nylig demonstreret som nye biomarkører for diagnose, prognose og forudsigelse til behandling respons for bugspytkirtlen kræftpatienter [4]. Bemærkelsesværdigt, kan også påvises disse små ikke-kodende RNA i mange, hvis ikke alle kropsvæsker [20]. Derfor blev miRNA profilering i blod for nylig påvist at differentiere kræftpatienter fra raske kontroller [4], og cirkulerende miRNA-analyse er blevet mere og mere foreslået som en ny biomarkør for kræft i bugspytkirtlen diagnose.

I de sidste par år, miRNA i humant spyt har vist sig at være potentielle biomarkører for diagnoseformål. Fordi samling er ikke-invasiv, atraumatisk og let tilgængelig, ved hjælp af spyt til detektering tidlig sygdom er ideel. Historisk HSA-miR-31 var en af ​​de første diskriminerende miRNA spyt biomarkører identificeret for kræft i mundhulen [21]. For nylig, overekspression af har-MIR-17 og har-MIR-20a er blevet rapporteret at være signifikant associeret med dårligt resultat af spyt adenoid cystisk carcinom [22]. Desuden blev der fundet 13 miRNA signifikant dereguleret i spyt af orale pladecellecarcinom patienter sammenlignet med raske kontroller [23]. Sidst, spyt miRNA profiler afviger i spyt fra patienter med maligne fra spyt fra patienter med en godartet ørespytkirtlen tumor, og repræsenterer således en ny ikke-invasiv diagnostisk værktøj til diagnosticering af tumorer i spytkirtlerne [9]. Under redaktion af dette manuskript, Xie

et al

beskrevet, at spyt miR-3679-5p og miR-940, to nyligt karakteriserede miRNA, der ikke blev undersøgt i det foreliggende arbejde, kan være specifikke for patienter med resektabel PDAC med rimelig specificitet og følsomhed [24]. På den anden side har spyt anvendelse til miRNA detektion ikke evalueret til dato i inoperabel PDAC patienter, der repræsenterer langt størstedelen (85%) af patienter diagnosticeret med denne kræft.

I den foreliggende proof-of-concept undersøgelse, har vi samlet spyt fra patienter med inoperabel kræft i bugspytkirtlen (n = 7), pancreatitis (n = 4), IPMN (n = 2), cancer-fri patienter (n = 4) undergår endoskopisk undersøgelse. Af mere end 90 testede miRNA blev fire identificeres som værende signifikant dereguleret i spyt fra bugspytkirtlen kræftpatienter i forhold til kontrol (HSA-miR-21, HSA-miR-23a, HSA-miR-23b og HSA-miR-29c). Desuden HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b var strengt specifikke for kræftpatienter, med fremragende følsomhed (71,4% og 85,7%, henholdsvis). På den anden side, Lad-7c og HSA-MIR-210 ikke var til stede i spyt hos kontrolpatienter men let påviselig i spyt hos patienter med pancreatitis, med udsøgt specificitet og selektivitet (HSA-MIR-210).

men i denne fase af dette projekt, spyt test undladt at skelne mellem pancreatitis og PDAC, som HSA-miR-216 er kun påvises i pancreatitis og ikke i kræft, men med dårlig følsomhed. Tilsammen viser vi for første gang, at spyt-miRNA er indikative for pancreatisk sygdom og kan anvendes til at diagnosticere inoperabel PDAC (HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a, HSA-MIR-23b) eller pancreatitis (HSA-miR -210). HSA-miR-21, HSA-miR-23a og HSA-miR-23b blev fundet signifikant dereguleret i spyt hos resektable PDAC patienter sammenlignet med raske kontrol under opdagelsen fase, men blev ikke undersøgt nærmere, da de ikke udstille på mindst 4 gange ændring i udtryk mellem de to grupper [24].

i dette arbejde er vi begyndt at undersøge, om spyt miRNA kan hjælpe til diagnosticering af befolkningen i risiko for at udvikle kræft i bugspytkirtlen, og dermed kunne anvendes som markør til at forebygge forekomsten af ​​tumorer. Intraduktal papillære mucinous neoplasmer (IPMNs) er ikke-invasive forstadielæsioner af pancreascancer. For nylig har miRNA i cystevæske blevet påvist at identificere høj kvalitet IPMN der kræver resektion og at udelukke ikke-mucinous cyster indebærer konservativ behandling med høj følsomhed og specificitet [25]. Vi har fået foreløbige resultater tyder på, at HSA-miR-23a og HSA-miR-23b er også til stede i spyt fra patienter diagnosticeret med IPMN, og kunne anvendes til beslutningstagning i IPMN ledelse.

Men vores undersøgelse synes at vise, at HSA-mIR-21, HSA-mIR-23a og HSA-mIR-23b er til stede i spyt hos patienter med pancreatitis, mens HSA-mIR-210 påvises i spyt af en fraktion af patienter med PDAC . Desuden HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b er til stede i spyt hos patienter med IPMN. Dette kan let forklares som pancreatitis og IPMN er to-velkarakteriserede PDAC forstadielæsioner, hvilket indikerer, at PDAC positive for HSA-MIR-210, eller HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b, være afledt af pancreatitis eller IPMN, henholdsvis. Tværtimod patienter diagnosticeret med pancreatitis og forhøjede spyt HSA-MIR-21, HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b, eller patienter diagnosticeret med IPMN og forhøjet spyt HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b kan være i risiko for at udvikle PDAC og kan kræve omhyggelig klinisk opfølgning. Vi er klar over, at den foreliggende undersøgelse lider lille prøve dimensionering og kræver en ekstern validering befolkning. Derfor har vi for nylig udgjorde den første klinisk kommenteret kohorte af bugspytkirtlen kræftpatienters prøver fra forskellige institutter (den BACAP initiativet https://www.chu-toulouse.fr/-projet-bacap-). En sådan kohorte vil være uhyre oplysende for yderligere validering og fremtidig klinisk anvendelse af vores metode, fordi det repræsenterer en enestående kilde til PDAC prøver, men også fordi det er rekapitulere den “naturlige historie” af denne sygdom. En sådan kohorte kan bidrage til at skabe spyt miRNA, sammen med yderligere kliniske variabler, som nye biomarkører for kræft i bugspytkirtlen patienternes ledelse. Derudover har vi endnu til at udføre sammenlignende undersøgelser mellem forskellige kræftpatienter til at retfærdiggøre, at de biomarkører vi identificeret heri er specifikke for kræft i bugspytkirtlen.

I denne artikel har vi identificeret HSA-miR-21, HSA-miR -23a og HSA-mIR-23b, der var forskelligt udtrykt mellem spytprøver fra patienter med en malign tumor og kræft-fri patienter, med fremragende specificitet og sensitivitet. Mens HSA-MIR-21 også er forbundet med mange fysiologiske betingelser, herunder, men ikke begrænset til kardiovaskulære og pulmonale sygdomme, herunder hjerte- og lungefibrose samt myokardieinfarkt, men også med immunologiske og udviklingsmæssige processer [26], HSA-MIR-21 er en af ​​de mest citerede miRNA i onkologi [27], herunder pancreascancer [4]. Vi har tidligere vist, at HSA-miR-21 er tidligt til udtryk under bugspytkirtlen carcinogenese [28], og at målrette HSA-miR-21 provokerer tumorregression i forsøgsmodeller af bugspytkirtelkræft [17]. Påfaldende, HSA-MIR-21 synes at være konstant opreguleret i bugspytkirtelkræft, og for at indicere ringe overlevelse, respons på behandling og /eller metastatisk sygdom [4]. Derudover en nylig metaanalyse nylig vist cirkulerende HSA-MIR-21 prognostisk stedet diagnostisk værdi i forskellige cancere [29]. I den foreliggende undersøgelse, vi spekulere at spyt HSA-MIR-21 kan også være af interesse for kræft i bugspytkirtlen diagnose, og fuldende den tidligere karakterisering af spyt HSA-MIR-21 til detektering af esophageal cancer [10]. Så vidt vi ved, giver vi heri den første demonstration af, at kunne påvises HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b i spyt hos patienter diagnosticeret med cancer; dog specificiteten af ​​både kandidat miRNA for PDAC er endnu ikke vist. HSA-MIR-23a er for nylig blevet forbundet med KRAS [30] og C-MYC [31] medieret signalvej, og beskrives som en kandidat kørsel miRNA i pancreascancer [30]. HSA-MIR-23a har også været forbundet med nedsat NK-cellecytotoksicitet [32], EMT [33] og modstand mod behandling [34-36]. Interessant nok blev HSA-miR-23b nylig vist at regulere autofagi forbundet med radioresistance af bugspytkirtelkræftceller [37].

Vi næste undersøgte den kinetiske af påvisning af spyt miRNA i en eksperimentel model af kræft i bugspytkirtlen. Mens HSA-MIR-23a og HSA-MIR-23b blev højt udtrykt i humane pankreatiske cancerceller-afledte xenotransplantater, de var knap påviselige i spyt i denne model af tumorbærende mus. På den anden side blev HSA-MIR-21 let påvises i tumorer og i spyt hos mus xenotransplanterede med humane pancreas cancer-afledte celler, mens der ikke kan påvises i kontroldyr. Sidstnævnte fund tyder på, at spyt HSA-miR-21 stammer fra eksperimentelle tumorer, sandsynligvis

via

tumorafledte exosomer, som for nylig beskrevet [38]. Derudover viser vi her, at spyt HSA-miR-21 afsløring forud påvisning af kræft-celle specifikke tumor markør i denne eksperimentelle model af PDAC. Dette tyder stærkt på, at spyt miRNA, herunder HSA-MIR-21, er mere følsomme end systemiske-baserede proteinmarkører til diagnosticering af PDAC.

Konklusion

Tilsammen viser vi heri til første gang, at spyt miRNA kunne være værdifulde biomarkører til at skelne patienter med inoperabel PDAC fra raske kontrolpersoner, og at spyt miR-210 kan hjælpe med at registrere pancreatitis. Mens multicenter studier med større stikprøvestørrelser er brug, dette arbejde stilke for brug af spyt miRNA som nye biomarkører til diagnosticering af inoperabel PDAC.

Støtte Information

S1 Table. miRNA kvantificeret i denne undersøgelse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0130996.s001

(XLSX)

S2 tabel. miRNA Cq værdier i spyt fra patienter uden cancer (n = 4), begning pancreatitis (n = 4), pancreas adenocarcinom (n = 7) eller IPMN (n = 2)

doi:. 10,1371 /journal.pone. 0130996.s002

(XLSX-)

S3 Table. Kandidat miRNA CQ værdier fra Mia PACA-2 Lucia-celler (n = 3)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0130996.s003

(XLSX)

S4 Table. Kandidat miRNA CQ værdier fra n = 6 eksperimentelle pancreas tumorer (ET)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0130996.s004

(XLSX)

S5 Table. Udskilles luciferase og spyt kandidat miRNA CQ værdier fra n = 6 mus med eksperimentelle pancreas tumorer

doi:. 10,1371 /journal.pone.0130996.s005

(XLSX)

Tak

forfatterne vil gerne takke Drs Geneviève Tavernier og Jean-José Maoret for deres nyttige råd.