PLoS ONE: Knockdown af PPAR δ Gene fremmer væksten af tyktarmskræft og Reducerer følsomhed til Bevacizumab i nøgne mus Model

Abstrakt

rolle peroxisomproliferatoraktiveret – aktiveret receptor δ (PPAR δ) gen i kolon carcinogenese fortsat meget kontroversielt. Her har vi etableret nøgne mus xenograftmodel anvendelse af et humant coloncancercellelinie KM12C enten med PPAR δ tavshed eller normal. De xenotransplantater i PPAR δ-lyddæmpet gruppe voksede betydeligt større og tungere med mindre differentiering, fremmet celleproliferation, forøget ekspression af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og lignende apoptose indeks sammenlignet med de PPAR δ-normal gruppe. Efter behandling med den specifikke VEGF-inhibitor bevacizumab, blev kapaciteten i vækst og proliferation af xenotransplantater faldet i begge grupper samtidig stadig betydeligt højere i PPAR δ-lyddæmpet gruppen end i PPAR δ-normal gruppe. Administration af PPAR δ agonist faldt betydeligt VEGF-ekspression i PPAR δ-normale KM12C-celler, men ikke i PPAR δ-lyddæmpede celler. Disse resultater viser, at, knockdown af PPAR δ fremmer væksten af tyktarmskræft ved at inducere mindre differentiering, fremskynde proliferation og VEGF-ekspression af tumorceller in vivo, og reducerer tumor følsomhed over for bevacizumab. Denne undersøgelse viser, at PPAR δ dæmper kolon carcinogenese

Henvisning:. Yang L, Zhou J, Ma Q, Wang C, Chen K, Meng W, et al. (2013) Knockdown af PPAR δ Gene fremmer væksten af tyktarmskræft og Reducerer følsomhed til Bevacizumab i nøgne mus Model. PLoS ONE 8 (4): e60715. doi: 10,1371 /journal.pone.0060715

Redaktør: Alan P. Fields, Mayo Clinic College of Medicine, USA

Modtaget: April 24, 2012; Accepteret: 2. marts, 2013; Udgivet: April 8, 2013 |

Copyright: © 2013 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkender tilskud støtte fra Natural Science Foundation of China (nr 30.801.332, https://www.nsfc.gov.cn/), ph.D. Programmer Foundation of Undervisningsministeriets Kina (nr 200.806.100.058, https://www.chinapostdoctor.org.cn/), og den svenske Cancer Foundation (https://www.cancerfonden.se/). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

peroxisomproliferatoraktiveret – aktiveret receptor-δ (PPAR δ), et medlem af ligand-aktiverede PPAR nuklear receptor familien [1], er ubikvitært udtrykt i de fleste væv og højt udtrykt i epitel, især hud og tarm [2], [3]. Ligner andre nukleare hormonreceptorer, PPAR δ heterodimeriserer med retinoid-X-receptoren og udøver sin virkning via regulering af gentranskription ved binding af ligand [4]. Den bedst karakteriseret rolle for PPAR δ til dato er at regulere lipidmetabolisme og energi homeostase, såsom induktion revers cholesterol transport, opløftende high-density lipoprotein, stigende fedtsyreoxidation og energi frakobling [5], [6]. Desuden er PPAR δ også impliceret i embryo implantation, sårheling, inflammatorisk respons, endotelcelleproliferation, angiogenese, hudkræft og kolorektal carcinogenese [7], [8].

I modsætning til den velkarakteriserede roller PPAR δ i metaboliske og energiske homeostase, rolle PPAR δ i kolorektal carcinogenese fortsat usikker. Nogle undersøgelser giver beviser, at PPAR δ fremmer tumorigenese mens andre giver modstridende resultater, som vi tidligere gennemgået [9]. Disse inkonsistente resultater diktere behov for yderligere at undersøge funktionen af PPAR δ i patogenesen af kolorektal cancer. For nylig har vi med succes etableret PPAR δ-Knockdown modeller af tyktarmskræft cellelinjer (KM12C etc.) ved lentivirus-medieret RNA forstyrrende (RNAi) [10]. Vi fandt, at PPAR δ knockdown signifikant inducerede mindre differentiering og fremmet proliferation af disse celler [9], [10]. Disse fund indikerer, at PPAR δ kan spille en tumor suppressor rolle ved at lette differentiering og inhibering af proliferation af tyktarmskræft. Men der stadig mangler af in vivo forsøg at vidne disse in vitro resultater. Til mere stringent definere PPAR δ rolle i kolorektal carcinogenese, undersøgte vi effekten af PPAR δ knockdown på nøgne mus xenografter oprettet med KM12C celler i nærværende undersøgelse.

Materialer og metoder

Cell Culture

Den menneskelige coloncancercellelinie KM12C (fra professor IJ Fidler, Anderson cancer center, TX), ubehandlet eller behandlet af lentivirus-medieret RNA forstyrrende (RNAi) mod PPAR δ gen fra vores tidligere undersøgelse [10], blev anvendt. Celler blev holdt i Eagles minimale essentielle medium (MEM) med Earles salte, L-glutamin og ikke-essentielle aminosyrer (Sigma-Aldrich), suppleret med 1,5% NaHCO3, 1 mm Na-pyruvat (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 × MEM vitamin Solution (Invitrogen), 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen), 1 ug /ml puromycin (kun for de behandlede celler for at opretholde renhed) og 10% føtalt bovint serum (Invitrogen). Ekspressionen af PPAR A er blevet stabilt stumme i cellerne behandlet med lentivirus-medieret RNAi som undersøgt i vores tidligere undersøgelse [10].

Etablering af tumorxenografter i nøgne mus Salg

Fourty-otte kvindelige nøgne mus af seks uger blev købt fra Sichuan University Laboratory Animal center (Chengdu, Kina). Mus blev opretholdt i 7 dage i en konventionel dyrepleje enhed før starten af undersøgelsen.

Mus blev bedøvet med intraperitoneal injektion af pentobarbital (65 mg /kg, katalog No.p3636, Sigma-Aldrich, Sverige). De KM12C-celler enten med stabilt tavshed PPAR δ og ubehandlet blev derefter injiceret subkutant (2 × 10

6 celler /mus i 100 pi PBS) i højre flanke af hver mus (24 mus pr gruppe). Fireogtyve timer efter inokulering blev tolv tilfældigt udvalgte mus fra hver gruppe injiceret med bevacizumab (Avastin ™, Genentech, CA) via halevenen på 5 mg /kg legemsvægt. Tumorvækst blev overvåget med regelmæssige mellemrum ved at måle to tumordiametre ved hjælp af elektroniske calipre. Tumor volumen blev beregnet med følgende formel: (længde × bredde

2) /2. Musene blev aflivet 25 dage efter inokulering, og tumorer blev fikseret i 10% neutral formalin. Procedurerne blev drevet i et blindet måde ved en investigator (L. Yang) uden kendskab til gruppering oplysninger

Etik erklæring:. Håndteringen dyr blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for den pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Protokollen blev godkendt af godkendt af Animal Experimental etiske komité af Sichuan University. Alle operation blev udført under natrium pentobarbital anæstesi, og blev gjort alle bestræbelser på at minimere lidelse.

Hematoxylin og Eosin (HE) Farvning

De xenotransplantater fra mus blev regelmæssigt indlejret i paraffin og derefter sektioneret på en tykkelse på 5 um. Snittene blev afparaffiniseret i xylen, rehydreret i ethanol, renset i destilleret vand, og derefter fikseret med 4% formaldehyd, farvet med Ehrlich Hematoxylin og eosin (Sigma-Aldrich) efterfulgt af dehydrering i gradueret alkohol. Slides blev monteret og analyseret under lysmikroskop.

immunhistokemisk analyse (IHC)

De immunostaings blev udført på 5 um paraffinindlejrede sektioner som tidligere rapporteret [9]. De primære antistoffer var kanin-polyklonalt anti-PPAR δ IgG (ARP37889, Aviva Systems Biology, CA), anti-Ki67 Ig G (ab15580, Abcam, MA) og muse monoklonalt anti-VEGF IgG (ab68334, Abcam, MA). Envision System Labelled Polymer-HRP anti-kanin (DakoCytomation, CA) blev anvendt som et sekundært antistof. Sektioner, der vides at vise positiv farvning for PPAR δ, Ki67 eller VEGF blev indbefattet i hver kørsel, der modtager enten det primære antistof eller PBS, som positive eller negative kontroller. I alle farvningsprocedurer, viste de positive kontroller klar farvning, mens der ikke var nogen farvning i de negative kontroller.

IHC slides blev undersøgt selvstændigt i et blindet måde ved to efterforskere (LY og JZ) uden kendskab til gruppering information. Forskerne scoret hvert afsnit ved farvning intensiteten af tumorceller som følger: 0 (negativ farvning), 1 (svag farvning udstillet som lysegul), 2 (moderat farvning udstillet som gulbrun), og 3 (kraftig farvning udstillet som brunt) . For at undgå en kunstig effekt, blev cellerne på randen af afsnittene og i områder med dårlig morfologi ikke tælles. I de tilfælde, hvor farvningen score havde afvigende resultater, blev en konsensus score nået efter re-evaluering

Cell Apoptose Detection

Niveauet af apoptose blev bestemt ved terminal deoxynukleotidyltransferase (TdT). – medieret dUTP nick endemærkning (TUNEL) assay under anvendelse af in situ Celledød Detection Kit (Katalog nr 11684817910, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) ved at følge producentens protokol. Kort beskrevet blev snittene de-paraffinized, rehydreret, permeabiliseres og ækvilibreret. Efter mærkning reaktion blev resultaterne evalueret under anvendelse Leica DM IL HC fluorescerende mikroskop. Totale celler blev visualiseret ved 330-380 nm for DAPI-farvning, og apoptotiske celler blev visualiseret ved 465-495 nm for FITC-farvning. Sektioner uden at tilføje TdT eller modtager DNase I blev inkluderet i hver kørsel som negative eller positive kontroller hhv. For hver prøve blev tilfældigt udvalgt fem high-power felter (× 200), og antallet af apoptotiske celler blev talt for hvert felt. Apoptose indeks (AI) = antal positive celler /totale antal celler.

Real-time Reverse-transkription (RT) PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra tumorer under anvendelse TurboCapture mRNA Kit (Qiagen , Tyskland), efterfulgt af revers transkription med høj kapacitet cDNA Reverse transcription Kit (Applied Biosystems, CA). MRNA’erne, der koder VEGF, Ki67, adipocytdifferentiering-relateret protein (ADRP), lever fedtsyrebindende protein (L-FABP), og intestinal alkalisk phosphatase (ALPI) blev kvantificeret ved anvendelse af real-time RT-PCR-analyse af SYBR green detektion. PCR-reaktionen blev udført på Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systemet, ved hjælp af sammenlignende tærskelcyklus (Ct) -metoden (△△ Ct) som beskrevet tidligere [11]. De anvendte primere til at kvantificere mRNA’er blev anført i tabel 1. Ekspression blev normaliseret til glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), og 1 × blanding af GAPDH primere (Pre-udviklede TaqMan Assay Reagenser, Applied Biosystems) blev anvendt til påvisning . Hver prøve blev analyseret i tre eksemplarer.

Måling af VEGF Produktionen fra KM12C Celler

VEGF produktion fra KM12C celler blev målt med en human VEGF Kolorimetrisk ELISA-kit (Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL). Kort beskrevet KM12C-celler (1 x 10

6) med PPAR δ lyddæmpet eller ubehandlet blev dyrket i serum-frit medium i 18 timer. Derefter celler blev behandlet med vehikel eller angivet koncentration af GW501516, den specifikke agonist af PPAR δ (0, 1, 2, 4, 8 uM) i 24 timer. Supernatanterne blev underkastet ELISA i overensstemmelse med producentens anvisninger. Farven intensiteten af hver brønd blev bestemt på en mikropladelæser (Anthos htIII, Østrig) ved 450 nm. Kalibreringskurver blev konstrueret for hver analyse ved at plotte absorbansværdi mod koncentrationen for hver kalibrator. De VEGF koncentrationer af prøver blev derefter læst fra kalibreringskurven og normaliseret til nanogram per 10

6 celler.

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev bestemt ved hjælp af enten en t-test, eller eventuelt rangsumtest, variansanalyse (ANOVA) eller Chi-square test med SPSS 13.0 software. Den relative ekspression af mRNA blev analyseret ved anvendelse af softwaren REST-XL

0,05 blev taget som signifikansniveau. De viste data repræsenterer mindst tre gentagelser af hvert forsøg udført tre gange.

Resultater

Knockdown af PPAR δ forfremmet tumorvækst og faldt følsomhed til Bevacizumab

For at undersøge effekten af PPAR δ knockdown på tumorvækst in vivo, vi inokuleret KM12C-celler enten med PPAR δ lyddæmpet eller normale i nøgne mus og målte tumorvolumener op til 25 dage. Som vist i figur 1A, den hældning xenograft væksten var højere hele tiden for PPAR δ-lyddæmpet gruppe, og denne forskel i vækstraterne var statistisk signifikant (

0,05). Ved slutningen af vækstperioden, det gennemsnitlige tumor volumen var 2,1 gange højere for knockdown gruppe end kontrolgruppen (2,8 cm

3 vs. 1,3 cm

= 0,015; figur 1A-C), med en gennemsnitsvægt på 4,0 ± 1,4 g for knockdown gruppe og 2,5 ± 0,6 g for kontrol (

= 0,021, figur 1D).

(A). Vækstkurve af xenotransplantater. På hvert tidspunkt, de xenotransplantater i PPAR δ-lyddæmpet gruppe (n = 12) voksede betydeligt større end kontrolgruppen (n = 12) (*

0,05), selv når den behandles ved bevacizumab (**

0,05) (gennemsnit ± SD, t-test). (B). Repræsentativt fotografi af mus i hver gruppe blev taget 25 dage efter inokulering. (C). De xenotransplantater når nøgne mus aflivet. (D) De xenografter i PPAR δ-lyddæmpet gruppe var signifikant tungere end i kontrolgruppen, når nøgne mus ofret (gennemsnit ± SD *

P =

0,021; **

P =

0.02 ;. t-test)

for at vurdere relevansen af at kombinere PPAR δ knockdown med bevacizumab behandling, vi injicerede bevacizumab til mus. Vi fandt, at indgivelse af bevacizumab formindskede signifikant tumorvækst i begge grupper, mens tumorerne i PPAR δ-lyddæmpet gruppe voksede væsentligt hurtigere end PPAR δ-normal gruppe (

0,05, figur 1A). Den gennemsnitlige endelige volumen af tumorer var 1,4 gange større i knockdown gruppe end i kontrolgruppen (0,9 ± 0,11 cm

3 vs. 0,6 ± 0,15 cm

= 0,033; Figur 1a- C), med en gennemsnitsvægt på 1,2 ± 0,5 g for knockdown gruppe og 0,8 ± 0,2 g for kontrol (

= 0,02, figur 1D).

De Xenografter med PPAR δ Knockdown var Mindre differentierede

Efter Unified standard for National Colorectal Cancer Patologi Research i Kina, differentieringen af tumor blev gradueret med procentdelen af adenoid struktur komponenter som følger: veldifferentieret ( 95%), moderat (50 % -95%), dårligt (5% -50%) og udifferentieret ( 5%). Ved HE farvning, fandt vi betydeligt mere mindre-opdelte (dårligt + udifferentierede) xenografter i PPAR δ-lyddæmpet gruppe end i kontrolgruppen (85% vs. 17%,

= 0,025) (figur 2A, B). Vi kvantificeret yderligere gener associeret med terminal differentiering, og fandt, at mRNA’erne kodende ADRP blev L-FABP eller ALPI alle signifikant nedsat hos PPAR δ-lyddæmpet gruppe i forhold til kontrolgruppen (

0,05 ; Figur 2C)

(A).. Repræsentative fotografier af xenotransplantater af HE-farvning. De xenotransplantater i PPAR δ-lyddæmpet gruppe (n = 12) var naturligvis mindre-opdelte end i kontrolgruppen (n = 12). × 400 forstørrelse. (B). PPAR δ- tavshed gruppe havde signifikant mere mindre-opdelte xenotransplantater end kontrolgruppen (85% vs. 17%,

= 0,025; Chi-square test). (C). Vist ved kvantitativ RT-PCR, mRNA’erne koder ADRP, L-FABP eller ALPI blev signifikant reduceret i PPAR δ-lyddæmpet gruppe i forhold til kontrolgruppen (

0,05).

PPAR δ Knockdown fremmes spredning af tumorceller

Vi har tidligere vist, at PPAR δ-tavshed KM12C celler havde en fremmet vækst in vitro [9]. At vidne det in vivo, undersøgte vi ekspressionen af spredning markør Ki67 i xenotransplantaterne. Som det fremgår af IHC assay, PPAR δ-lyddæmpet gruppe havde signifikant højere udtryk for Ki67 end PPAR δ-normal gruppe (gennemsnitlig score: 3,5 ± 0,4 vs. 2,0 ± 0,6,

= 0,026, figur 3A, B). Efter bevacizumab behandling blev ekspressionen af Ki67 markant nedsat i begge grupper samtidig stadig betydeligt højere i PPAR δ-lyddæmpet gruppe end i kontrolgruppen (gennemsnitlig score: 2,3 ± 0,5 vs. 1,2 ± 0,3,

= 0,031, figur 3A, B). Den kvantitative RT-PCR gav overensstemmende resultat med IHC-assayet (

0,05; figur 3C).

(A). Repræsentative fotografier af Ki67-ekspression i xenotransplantater farves ved IHC. × 400 forstørrelse. (B). PPAR δ- tavshed gruppe (n = 12) havde signifikant højere score på Ki67 farvning end kontrolgruppen (n = 12) (*

= 0,026), selv efter behandling af bevacizumab (**

= 0,031) (middelværdi ± SD; t test). (C). MRNA-niveauet af Ki67 var signifikant højere i PPAR δ-lyddæmpet gruppe end i kontrolgruppen (*

= 0,018), selv efter behandlet ved bevacizumab (**

= 0,025).

PPAR δ Knockdown påvirkede ikke apoptose af tumorceller

effekten af PPAR δ knockdown på celle apoptose blev undersøgt af TUNEL assay. Som vist i figur 4, var signifikant forskel i AI ikke fundet mellem PPAR δ-lyddæmpet gruppe og kontrolgruppen (6,2 ± 4,7% vs. 7,0 ± 3,6%,

= 0,81), selv efter bevacizumab behandling ( 10,8 ± 4,1% vs.11.2 ± 2,9%,

= 0,75).

(A). Repræsentative billeder af hver gruppe. De totale celler blev identificeret ved DAPI-farvet, og de positive apoptose celler blev identificeret ved FITC-farve. × 200 forstørrelse. (B). Kvantitative data for apoptose indeks (AI). Der var ikke signifikant forskel på AI mellem grupperne, selv efter behandlet med bevacizumab (gennemsnit ± SD, *

= 0,81, **

= 0.75; t-test).

Knockdown af PPAR δ induceret VEGF Expression i xenografter

for at analysere sammenhængen af PPAR δ med VEGF, vi yderligere undersøgt ekspressionen af VEGF i xenotransplantaterne. Af IHC, fandt vi, at PPAR δ-lyddæmpet gruppe havde signifikant flere sager med højt udtrykte VEGF (score ≥2.0) (77% vs. 33%,

= 0,03) og højere score intensitet end kontrollen gruppe (3,1 ± 0,3 vs. 1,5 ± 0,2,

= 0,028, figur 5A, B). Kvantitativ RT-PCR-analyse viste, at mRNA’et af VEGF var øget signifikant i PPAR δ-lyddæmpet gruppe sammenlignet med kontrollen. (

P =

0,032, figur 5C)

(A). Repræsentative fotografier af VEGF-ekspression i xenotransplantater farves ved IHC × 400 forstørrelse.; (B). PPAR δ- tavshed gruppe (n = 12) havde signifikant højere score på VEGF farvning end kontrolgruppen (n = 12) (*

= 0,028; rank sum test). (C). Kvantitativ RT-PCR resultat (*

P =

0,032).

Aktivering af PPAR δ Nedsat VEGF Expression i KM 12C Celler

For at bekræfte sammenhængen mellem PPAR δ og VEGF behandlede vi KM12C-celler med GW501516 (den specifikke agonist af PPAR δ) eller vehikel, og kvantificeres VEGF i cellefri supernatant ved ELISA-assay. Som vist i figur 6, sekretionen af VEGF var meget højere i PPAR δ-lyddæmpede celler end i normalthørende PPAR δ (kontrolceller) før GW501516 administration (

= 0,035). Efter behandling med GW501516 blev VEGF faldt på en dosis-afhængig måde i kontrolcellerne (

= 0,018), mens der ikke var signifikant ændring i PPAR δ-lyddæmpede celler langs (

= 0,83).

de KM12C celler blev behandlet med serielle koncentrationer af GW501516 eller køretøj, og cellefrie supernatanter blev indsamlet til VEGF kvantificering ved ELISA. Behandlet af GW501516 viste kontrolcellerne en dosisafhængig reduktion af VEGF-sekretion (*

= 0,018), mens PPAR δ-tavshed celler havde ingen signifikant ændring alle sammen (**

= 0,83;. ANOVA)

diskussion

i den foreliggende undersøgelse, fandt vi, at xenotransplantaterne i PPAR δ-lyddæmpet gruppe voksede betydeligt hurtigere med mindre differentiering, fremmet celledeling mens lignende apoptose indeks og øget VEGF sammenlignet med dem for PPAR δ-normal gruppe, uanset bevacizumab behandling. Administration af PPAR δ agonist faldt betydeligt VEGF udtryk i PPAR δ-normale KM12C celler, mens ikke påvirkede den for PPAR δ-lyddæmpede celler. Disse resultater viser, at, knockdown af PPAR δ fremmer væksten af tyktarmskræft ved at mindske differentiering og fremme spredning samt VEGF-ekspression af tumorceller in vivo, og reducerer tumor følsomhed over for bevacizumab. Disse resultater understøtter en suppressor rolle PPAR δ i patogenesen for tyktarmskræft.

I den foreliggende undersøgelse, vores fund, at de xenotransplantater i mus voksede betydeligt større og tungere efter PPAR δ knockdown indikerer, at PPAR δ kan svække tumor vækst in vivo. I overensstemmelse med dette fund seneste undersøgelser viser, at colon polyp dannelse var signifikant større i PPAR δ-deficiente mus sammenlignet med vildtype-dyr [12], [13]. I modsætning til disse observationer, Park et al. [14] rapporterede, at PPAR δ-null HCT-116 celler havde en nedsat evne til at danne xenografter i nøgne mus. En anden undersøgelse konkluderede, at PPAR δ er undværlig for polypdannelse i tyktarmen af APC

Min-mus [15]. Imidlertid blev disse konklusioner baseret på analysen af mindre end 6 mus, med begrænset statistisk styrke. Resultat af den foreliggende undersøgelse omfatter data fra i alt 48 mus, der giver mere definitiv evidens for en funktionel rolle for PPAR δ i colon carcinogenese.

For at klarlægge den mekanisme ligger til grund for fremmet væksten af tumorer efter PPARd knockdown, vi yderligere analyseret differentieringen, celleproliferation, apoptose og VEGF-ekspression i xenotransplantaterne. Vi fandt, at xenotransplantater viste signifikant mindre-opdelte histologi efter PPAR δ knockdown, med øget ekspression af differentierings-relaterede gener ADRP, L-FABP og ALPI. Disse resultater giver in vivo beviser for, at PPAR δ kan lette differentieringen af tyktarmskræft. Dette fund er i overensstemmelse med de seneste undersøgelser, der implicerer PPAR δ i reguleringen af epitheldifferentiering: Aktivering af PPAR δ stimulerer terminal differentiering af keratinocytter [16] – [18]; PPAR δ fremmer differentieringen af Paneth celler i intestinale krypter [19]. For nylig, viser vi, at PPAR δ knockdown inducerer mindre differentiering af koloncancer cellelinier og høj ekspression af PPAR δ er relateret til bedre differentiering af rektal cancer [10]. Disse resultater stemmer overens med de in vivo observationer i den foreliggende undersøgelse. Forordningen om differentiering kan ligge til grund for at fremme effekten af PPAR δ knockdown på tumorvækst som vist i denne undersøgelse.

Den resterende del af proliferation og apoptose spiller en afgørende rolle i kontrollen af tumorvækst. Progressionen af tumorvækst er karakteriseret ved forøget proliferation og /eller nedsat apoptose, eller begge dele. I den foreliggende undersøgelse fandt vi, at ekspressionen af Ki67 blev signifikant forøget, mens apoptose af tumorceller ikke blev ændret, efter PPAR δ knockdown. Det viser, at PPAR δ knockdown kan fremme udbredelsen mens har ingen effekt på apoptose af tyktarmskræft celler. Dette resultat er i overensstemmelse med vores tidligere observationer in vitro, som viser, at PPAR δ knockdown fremmer udbredelsen af HCT-116 celler uden effekt på apoptose [20]. Ubalancen af proliferation og apoptose er ansvarlig for den forfremmet tumorvækst efter PPAR δ knockdown.

Angiogenese er en af de vigtigste bestemmende faktorer for tumorvækst, som tumor skal stimulere værten til at skabe sit eget kar til at fortsætte med at vokse, når det vokser større end 1-2 mm

3 [21]. VEGF er en udløser af angiogenese og afgørende for udviklingen af blodkar [22], [23]. Sammen med VEGF, andre vækst–relaterede gener er involveret i angiogenese. En nylig undersøgelse viste, at aktivering af PPAR δ opreguleret VEGF i colon cancerceller [24], implicerer PPAR δ i angiogenese for tyktarmskræft. I den foreliggende undersøgelse viser vi, at VEGF var signifikant forøget i både KM12C-celler og xenotransplantater efter PPAR δ knockdown, og faldt i PPAR δ-normale KM12C celler, mens uændret i PPAR δ-lyddæmpet celler efter behandling af GW501516. Den viser, at aktivering af PPAR δ inhiberer ekspressionen af VEGF og kan således svække angiogenese for tyktarmskræft. Dette resultat er i overensstemmelse med de seneste undersøgelser viser, at PPAR δ kan hæmme proliferation af vaskulære endotelceller [7], [25], [26]. Fremme af VEGF-medieret angiogenese kan være en anden faktor, der ligger til grund forfremmet tumorvækst efter PPAR δ knockdown.

For at undersøge indflydelsen af PPAR δ knockdown på kemoterapeutisk sensitivitet, vi behandlede nøgne mus med bevacizumab. Efter behandlingen blev tumorvæksten samt celleproliferation naturligvis forsinket, og apoptose blev forøget i begge grupper, mens PPAR δ-lyddæmpet gruppe stadig viste højere kapacitet tumorvækst og celleproliferation end PPAR δ-normal gruppe. Dette fund viser, at PPAR δ knockdown reducerer følsomheden for tyktarmskræft til bevacizumab, underliggende, som kan være den øgede spredning og mindske differentiering af tumorer. Det indebærer også, at VEGF medieret vej er ikke den eneste mekanisme, ved hvilken PPAR δ regulerer tumorvækst. Så vidt vi ved, er dette den første tid til at rapportere virkningen af PPAR δ om kemosensitivitet for tyktarmskræft. Det medfører, at tyktarmskræft med normal eller høj ekspression af PPAR δ kan have bedre svar til bevacizumab end dem med lav ekspression af PPAR δ. Derfor kan ekspressionsniveauet af PPAR δ være en potentiel effekt indikator for bevacizumab, samt udvikling og anvendelse af PPAR δ-agonist middel kan være en lovende måde at fremme effekten af bevacizumab for tyktarmskræft.

I konklusion viser vi her, at PPAR δ knockdown fremmer væksten af tyktarmskræft, inducere mindre differentiering og fremskynde celleproliferation samt VEGF-ekspression, mens har ingen effekt på apoptose, uanset bevacizumab behandling. Ligandaktivering af PPAR δ formindsker ekspressionen af VEGF i colon cancerceller. Disse fund indikerer, at, PPAR δ kan inhibere tumorvækst ved at inducere differentiering, svækkende celleproliferation og VEGF-medieret angiogenese i patogenesen af tyktarmskræft, og lette tumor følsomhed over for bevacizumab. Disse resultater understøtter rationalet for at udvikle PPAR δ agonister til forebyggelse og /eller behandling af tyktarmskræft.

Tak

Vi takker Prof. I.J. Fidler (Anderson Cancer Center, Houston, TX) for at tilbyde KM12C cellelinje.

Kronisk sygdom

PLoS ONE: Knockdown af PPAR δ Gene fremmer væksten af tyktarmskræft og Reducerer følsomhed til Bevacizumab i nøgne mus Model

Be the first to comment

Leave a Reply Annuller svar