PLoS ONE: Kombinatorisk Effekt af ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler og NF-KB-inhibitorer i kræft i æggestokkene Therapy

Abstrakte

Flere epidemiologiske studier har korreleret brugen af ​​ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) med nedsat risiko for kræft i æggestokkene, den mest dødbringende gynækologisk cancer, diagnosticeret som regel i sene stadier af sygdommen. Vi har tidligere konstateret, at pro-apoptotiske cytokin melanom differentiering associerede gen-7 /Interleukin-24 (

MDA

-7 /IL-24) er et afgørende mediator af NSAID-induceret apoptose i prostata, bryst, nyre- og mave cancerceller. I denne rapport evalueres vi forskellige strukturelt forskellige NSAID for deres effektiviteter at inducere apoptose og

mda

-7 /IL-24-ekspression i æggestokkene cancerceller. Mens flere NSAID’er induceret apoptose, Sulindac Sulfid og Diclofenac mest potent induceret apoptose og reduceret tumorvækst. En kombination af disse midler resulterer i en synergistisk virkning. Desuden

mda

-7 /IL-24-induktion af NSAID er afgørende for programmeret celledød, da hæmning af

mda

-7 /IL-24 ved små interfererende RNA ophæver apoptose.

mda

-7 /IL-24-aktivering fører til opregulering af vækst anholdelse og DNA-skader inducerbare (GADD) 45 α og γ og JNK aktivering. NF-KB-familien af ​​transkriptionsfaktorer er blevet impliceret i ovarieudvikling cancer. Vi har tidligere etableret NF-KB /IKB signalering som et væsentligt skridt for celle overlevelse i kræftceller og hypotese, at målrette NF-KB kan forstærke NSAID-medieret apoptose induktion i æggestokkene cancerceller. Faktisk kombinerer NSAID-behandling med NF-KB-inhibitorer førte til forøget apoptose induktion. Vores resultater indikerer, at inhibering af NF-KB i kombination med aktivering af

MDA

-7 /IL-24 ekspression kan føre til en ny kombinatorisk terapi for ovariecancer

Henvisning:. ZERBINI LF, Tamura RE, Correa RG, Czibere A, Cordeiro J, Bhasin M, et al. (2011) Kombinatorisk Effekt af ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler og NF-KB-inhibitorer i kræft i æggestokkene Therapy. PLoS ONE 6 (9): e24285. doi: 10,1371 /journal.pone.0024285

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: April 12, 2011; Accepteret: August 5, 2011; Udgivet 12. september, 2011

Copyright: © 2011 ZERBINI et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. RET er en modtager af ICGEB ph.d.-stipendium. Denne forskning blev støttet af National Institutes of Health giver 1R01 CA85467, P50 CA090381, P50 CA105009 og Hershey Foundation (TAL), NIH tilskud 1R01 CA097318, 1R01 CA127641, P01 CA104177, Samuel Waxman Cancer Research Foundation (PBF) og Department of Defense tilskud PC051217 og OC0060439 (LFZ). DS er et Harrison Scholar i Cancer Research og en Blick Scholar i VCU Massey Cancer Center og VCU School of Medicine. PBF holder Thelma Newmeyer Corman Stol i Cancer Research i VCU Massey Cancer Center og er en SWCRF investigator. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er den mest dødelige gynækologiske kræft og 5

th førende årsag til kvinder dødsfald relateret til kræft i USA [1]. Sent diagnose er en af ​​de vigtigste forhindringer til behandling af kræft i æggestokkene, som næsten 70% af kvinderne til stede med et fremskredent stadium af sygdommen på diagnosetidspunktet [2]. Flere epidemiologiske undersøgelser har antydet, at brug af NSAID i klinisk relevante koncentrationer reducerer kolorektal [3], bryst [4] og ovariecancer risiko [5], [6], [7], selv om kontroverser stadig [8], [9 ]. En væsentlig målsætning af NSAID handling er hæmning af cyclooxygenase (COX), som er ansvarlig for omdannelsen af ​​arachidonsyre til prostaglandiner og beskæftiger en række forskellige mekanismer. De to COX gener, COX-1 og COX-2, er næsten identiske; dog én relevante forskel er, at COX-1-ekspression er konstitutiv, hvorimod COX-2-ekspression induceres af vækstfaktorer og proinflammatoriske stimuli [10]. NSAID’er er typisk klassificeret som specifikke COX-2-hæmmere eller ikke-specifikke COX-inhibitorer. I ovariecancer, men ikke COX-2 er blevet fundet COX-1, der skal overudtrykkes [11], [12], rapporterede alligevel andre undersøgelser, at COX-2 også opreguleres [13], [14]. High COX-1-ekspression i kræft i æggestokkene stærkt korrelerer med høje niveauer af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) [15], [16], [17] og NSAID hæmmer VEGF produktion i æggestokkene kræft cellelinjer [12], [18], der angiver at COX-1 kan regulere VEGF-ekspression. Angiogenese og VEGF-ekspression er impliceret i ascites dannelse [19] og metastase af ovariecancer [20], mens dens hæmning forhindrer ascites dannelse og hæmmer dissemineret kræft vækst [21].

Vores tidligere undersøgelse viser, at NSAID også fremkalde apoptose af cancerceller via induktion af

mda

-7 /IL-24 udtryk [22], hvilket fører til øget ekspression af to medlemmer af Growth Arrest og DNA-skader 45 (GADD45) familie [23]. Den GADD45 genfamilien koder tre strukturelt nært beslægtede vækst arrest- og DNA-beskadigelse-inducerbare proteiner, GADD45 α, β og γ spille en rolle i G2 /M checkpoint i respons på DNA beskadigelse [24]. Under normale fysiologiske betingelser,

MDA

-7 /IL-24 udtrykkes i celler i immunsystemet og normal melanocytter [25]. Høje niveauer af

mda

-7 /IL-24 har vist sig at specifikt inducere apoptose af cancerceller, og derfor

mda

-7 /IL-24 er blevet nævnt som en “magisk kugle” [26], [27]. Desuden flere undersøgelser vist, at overekspression af

mda

-7 /IL-24 ved en rekombinant adenovirus resulterer i kræftcellen apoptose og terapeutiske fordele i ovariecancer [28], [29].

NF-KB /IKB-signalering er en anden vej, der har været impliceret i lægemiddelresistens og overlevelse i ovariecancer [30], [31]. NF-KB /IKB vej fremstår som central aktør i tumorigenese, invasion og metastase til forskellige kræftformer [30], [31] og er et afgørende skridt for kræftceller at undslippe programmeret celledød [32]. Endvidere modstand af cancerceller til kemoterapimidler er blevet forbundet med deregulerede NF-KB-aktivering [33]. Desuden har vi vist, at hæmning af konstitutivt aktiv NF-KB ved adenoviral udtryk for IKB inducerer apoptose i prostatacancerceller og hæmmer tumor dannelse i SCID-mus [34].

I denne rapport, vi sammenlignet en bred vifte af NSAID’er til deres effektiviteter til at inducere apoptose af ovariecancerceller. Da vores tidligere undersøgelse viste en rolle for

mda

-7 /IL-24 i NSAID-medieret celledød, vi også vurderet, om apoptose induktion ved NSAID skyldes induktion af

mda

-7 /IL-24-ekspression. Viral levering af

mda

-7 /IL-24 er i øjeblikket anvendes i kliniske forsøg for forskellige kræftformer [27]. Identifikation af lægemidler, som er mest effektive i

mda

-7 /IL-24-induktion kan være et alternativ til viral levering for at udnytte de antineoplastiske virkninger af

mda

-7 /IL-24 . Vi hypotese også, at kombinere NSAID med hæmmere af NF-KB-vejen kan forstærke effekten af ​​NSAID mod kræft i æggestokkene. Vi har derfor testet farmakologiske inhibitorer af NF-KB-vejen for deres evner til at inducere apoptose i ovariecancerceller. Her vil vi vise, at Sulindac sulfid og Diclofenac er de mest potente NSAID, der inducerer ovariecancer apoptose via

mda

-7 /IL-24-ekspression og også reducere tumorvækst

in vivo

.

MDA

-7 /IL-24-ekspression fører til GADD45α og γ opregulering og JNK-kinase-aktivering. Adskillige farmakologiske NF-KB-inhibitorer også inducere apoptose af kræft i æggestokkene celler og i kombination med NSAID potenserer apoptotiske effekt af NSAID.

Resultater

NSAID er potente inducere af

mda

-7 /IL-24 og apoptose i æggestokkene cancerceller

En bred panel af NSAID blev testet for deres evner til at inducere apoptose og

mda-

7 /IL-24 genekspression i fire æggestokkene cancercellelinier, SKOV-3, CAOV-3, SW626 og 36m2. Koncentrationerne for alle NSAID lægemidler anvendt i denne undersøgelse blev udvalgt til at være sammenlignelig med opnåelige fysiologiske plasmakoncentrationer [35] – [49]. Apoptose blev målt 24 timer efter behandling af SKOV-3, CAOV-3, SW626 og 36m2 ovariecancer celler med dette sæt af NSAID’er, afslører, at mange forskellige, men ikke alle NSAID’er induceret apoptose (fig 1a og S1a). Konsekvent stærke inducere af apoptose i alle fire cellelinjer inkluderet Sulindac Sulfid, Diclofenac, ebselen og Naproxen sammenlignet med opløsningsmiddel kontroller. Nogle NSAID resulterede i signifikant induktion af apoptose i en undergruppe af ovariecancer cellelinjer, herunder Sulindac sulfon, Acetaminophen, aspirin og Flurbiprofen hvorimod behandling med NS-398, Ibuprofen, finasteride, flufenaminsyre og Meloxicam medførte kun marginal eller ingen apoptoseinduktion ( Figur 1a og S1a).

SKOV-3 cellelinie efter behandling med 5 mM aspirin, 200 uM Ibuprofen, 1 mM Acetaminophen, 200 uM Naproxen, 200 uM NS-398, 200 uM diclofenac, 50 uM Finasteride, 200 pM flufenaminsyre, 40 pM meloxicam, 50 uM ebselen, 20 nM Flurbiprofen, 50 uM Sulindac Sulfid og 50 uM Sulindac sulfon eller DMSO som kontrol. (A) Apoptose assay af kræft i æggestokkene celler efter NSAID-behandling. Data betyder ± s.d. af tredobbelte uafhængige eksperimenter for hver behandling. (B) Dosisafhængig induktion af apoptose ved NSAID’er i ovariecancerceller. Apoptose-assay af SW626 ovariecancer celler. Cellerne blev behandlet med 50, 25, 10 og 5 uM Sulindac Sulfid; 200, 100, 40 og 20 uM af diclofenac; 200, 100, 40 og 20 uM af naproxen og 50, 25, 10 og 5 uM ebselen eller DMSO. Apoptose blev målt 24 timer efter behandling. Data betyder ± s.d. af tredobbelte uafhængige eksperimenter for hver behandling. (C) Real time PCR-analyse af

mda

-7 /IL-24-ekspression i SKOV-3 celler efter 24 timers behandling med forskellige NSAID. Hver prøve blev normaliseret til hGAPDH. (D) Apoptose assay af CAOV-3 ovariecancerceller efter NSAID-behandling eller DMSO og infektion med lentivirus kodning

MDA

-7 /IL-24 siRNA-duplexer. Data betyder ± s.d. af tredobbelte uafhængig infektion for hver vektor ved hver behandling.

For hver af de fire mest konsekvente inducere af apoptose vi bestemt den laveste dosis, der stadig inducerer programmeret celledød af ovariecancerceller. Koncentrationerne af de valgte NSAID’er blev testet ved 2, 5 og 10 gange lavere koncentrationer end de fysiologisk opnåelige doser anvendt i forsøgene for figur 1a og S1a. Apoptose blev målt i ovariecancerceller 24 timer efter behandling med forskellige doser af de fire NSAID’er. Vores resultater viser, at Sulindac Sulfid, diclofenac og naproxen koncentrationer selv ved 5 gange lavere dosis stadig effektivt inducere apoptose, mens ebselen kan reduceres kun 2 gange (figur 1b).

Baseret på vores tidligere observationer i andre typer af kræft vi stilling til, om apoptose induktion ved NSAID korrelerer med

mda

-7 /IL-24-induktion. Vi målte mRNA ekspressionsniveauer af

mda-

7 /IL-24 mRNA i respons på forskellige NSAID i Skov-3 celler ved real time PCR-analyse demonstrerer, at

mda-

7 /IL-24 (maksimalt 12 gange induktion) udtryk er almindeligt fremkaldt af NSAID, der fremmer apoptose i æggestokkene cancerceller (figur 1c). Disse resultater blev også bekræftet i yderligere to æggestokkene kræft cellelinjer. I CAOV-3 og SW626 ovariecancer cellelinjer

mda-

7 /IL-24 er også stærkt induceret (maksimalt 77 gange induktion i CAOV-3 celler) (Figur S1b). NSAID’er, som stærkt forbedrede apoptose såsom Sulindac Sulfid, naproxen, ebselen, og diclofenac (figur 1A) signifikant induceret

MDA

7 /IL-24-ekspression (figur 1c), hvorimod NSAID’er, som kun netop inducerede apoptose (fig 1a ) ikke signifikant forbedre

mda

-7 /IL-24-ekspression undtagen ibuprofen, som fremkaldte

mda

-7 /IL-24, men ikke inducere apoptose (figur 1c).

Vi og andre har vist, at overekspression af

mda

-7 /IL-24 efter infektion med en adenovirus bærer

mda

-7 /IL-24-genet inducerer apoptose og hæmmer celledeling i cancer celler [50], [51]. For at vurdere, om induktion af apoptose i cancerceller ved NSAID er afhængig

MDA

-7 /IL-24-opregulering, vi udført eksperimenter med et lentivirus koder for et siRNA mod

MDA

-7 /IL-24, der tidligere blev genereret af vores gruppe [23]. Infektion af SKOV-3-celler med

MDA

-7 /IL-24 siRNA lentivirus reduceret apoptose induceret af NSAID’er med 40-70% i forhold til kontrollen lentivirus (figur 1d), yderligere underbygger den antagelse, at NSAID- medieret apoptose i det mindste delvis afhængige af

MDA

-7 /IL-24-induktion. De samme resultater blev observeret i CAOV-3 celler (data ikke vist).

Synergieffekt af NSAID kombinationer

Brug den laveste dosis af hver NSAID, der påvirkede apoptose af kræft i æggestokkene celler (figur 1b ), vi systematisk analyseret apoptose induktion ved at kombinere lave doser af NSAID. Et panel af NSAID inklusive diclofenac, sulindac Sulfid, Naproxen og ebselen blev testet for deres evne til at inducere apoptose alene og i kombination. SKOV-3 ovariecancerceller blev behandlet med 10 pM Sulindac Sulfid, 40 uM Diclofenac, 25 uM ebselen eller 40 uM Naproxen og kombinationer deraf. Apoptose blev målt 24 timer efter behandling afslørede, at størstedelen af ​​de kombinationer af NSAID’er testede induceret apoptose betydeligt mere end nogen af ​​alene de NSAID’er i ovariecancerceller (figur 2A). Visse kombinationer såsom Sulindac sulfid og diclofenac, sulindac Sulfid og naproxen og diclofenac og naproxen var mere effektiv i apoptose induktion end andre (figur 2a). Vi valideret disse resultater i CAOV-3 og SW626 cellelinjer (figur S2). Isobologram analyse under anvendelse kombinationer af Diclofenac og Sulindac Sulfid indikerer, at kombinationer af de lægemidler resulterer i en synergistisk virkning (figur 2b).

(A) Apoptose assay af SKOV-3-celler efter behandling med 10 pM Sulindac sulfid, 40 uM Diclofenac, 25 uM ebselen eller 40 uM Naproxen og en kombination deraf eller DMSO. Apoptose blev målt 24 timer efter behandling. Data betyder ± s.d. af tredobbelte uafhængige eksperimenter for hver behandling. (B) Normaliseret isobologram opnået ved software Compusyn. CAOV-3 celler behandlet med en kombination af 5 uM Sulindac sulfid og 20 uM Diclofenac viser synergistisk effekt.

NSAID-behandling reducerer ovariecancer xenograft vækst i SCID-mus

For at afgøre, om NSAID reducere tumorvækst

in vivo

blev SKOV-3 ovariecancerceller injiceres subkutant i SCID-mus. Musene blev tilfældigt inddelt i 3 grupper og fodret en af ​​tre diæter gennem hele eksperimentet: AIN-93G som kontrol og AIN-93G kost suppleret med enten 200 ppm Sulindac sulfid eller 100 ppm Diclofenac. To måneder senere blev dyrene undersøgt for tumordannelse og tumorvægt. Alle mus udviklede tumorer indikerer, at denne særlige dosis af NSAID ikke forhindrede tumordannelse. Men som det ses i figur 3, Sulindac Sulfid og Diclofenac behandling reducerede gennemsnitlige tumorvolumen med 30% og 20%, når det blev sammenlignet med kontrollen kost med en p-værdi. 0,05, hvilket bekræfter dens antitumoreffektivitet

For hver inokulation, 2 × 10

6 SKOV-3-celler blev injiceret subkutant i SCID-mus. Musene blev tilfældigt inddelt i tre grupper (n = 7 /gruppe) og fodret en af ​​tre diæter gennem hele eksperimentet: AIN-93G som kontrol, AIN-93G diæt suppleret med 200 ppm Sulindac sulfid eller AIN-93G kost suppleret med 100 ppm Diclofenac. Størrelsen af ​​tumorer og tumor vægt blev målt efter 2 måneder. Værdier ikke deler de samme bogstaver er statistisk signifikante med p-værdier i det mindste 0,05

Induktion af GADD45 α og γ genekspression og aktivering af JNK i kræft i æggestokkene ved NSAID

. vi har tidligere rapporteret, at induktion af apoptose ved NSAID’er er tæt knyttet til induktion af

MDA

-7 /IL-24-ekspression og derfor GADD45 α og γ opregulering i flere cancercellelinier [23]. Som NSAID fremkalde

mda

-7 /IL-24-ekspression i æggestokkene cancerceller (figur 1c og S1c), vi evalueret ændringer i GADD45 α og γ genekspression.

For at vurdere, om regulering af GADD45 gener er involveret i NSAID-medieret apoptose, blev ekspression af GADD45 α og y mRNA’er målt ved real time PCR i SKOV-3, CAOV-3 og SW626-celler behandlet med NSAID. De NSAID’er med den stærkeste pro-apoptotisk aktivitet, herunder Sulindac sulfid, Diclofenac, naproxen og Ebselen stærkt forbedrede GADD45 α og γ udtryk, hvilket indikerer, at øget GADD45 α og γ udtryk tæt korrelerer med pro-apoptotisk aktivitet af NSAID (figur S3A og S3B). Lentiviral udtryk for siRNA mod

mda

-7 /IL-24 i æggestokkene cancerceller viste, at knockdown af

mda

-7 /IL-24 reducerer diclofenac-induceret GADD45 α og γ genekspression angiver at GADD45α og γ induktion er i det mindste delvist afhængig af

mda

-7 /IL-24-ekspression (figur S3C).

Da andre, og vi havde vist, at JNK-aktivering spiller en rolle i apoptose induktion i cancerceller og GADD45 α og γ interagere med opstrømskinase af JNK, MTK1 [52], vurderede vi aktiveringen af ​​JNK under NSAID-medieret apoptose. JNK-aktivitet blev testet i proteinekstrakter opnået fra CAOV-3 og SKOV-3-celler behandlet med Sulindac sulfid (50 uM), Diclofenac (200 uM) eller DMSO i 24 timer ved en

in vitro

kinaseassay. Western blot-analyse afslørede meget lidt JNK-aktivitet i ubehandlede kontrolceller og kraftig stigning i JNK-aktivitet i begge cellelinier efter behandling med Sulindac sulfid og Diclofenac (figur 4a og 4b). Der bekræfter dette bevismateriale en svag inducer af

mda

-7 /IL-24, GADD45 α og γ og apoptose, Flurbiprofen, demonstreret kun en marginal induktion af JNK aktivitet (data ikke vist). For at belyse den funktionelle relevans af GADD45 α og γ og

mda

-7 /IL-24 til NSAID-medieret JNK induktion og apoptose i kræft i æggestokkene, JNK kinase aktivitet blev testet i proteinekstrakter opnået fra

CAOV -3

celler behandlet med Sulindac sulfid og diclofenac og inficeret med lentivirus kodning siRNA mod GADD45 α og

MDA

-7 /IL-24 gener. Western blot-analyse afslørede JNK kinase aktivering med Sulindac sulfid og diclofenac var markant afhængig GADD45 α og

MDA

-7 /IL-24-induktion, eftersom JNK-kinase-aktivitet i Sulindac sulfid og Diclofenac behandlet

MDA

-7 /IL-24 – /- celler blev afskaffet i forhold til

mda

-7 /IL-24 + /+ celler (figur 4b). For yderligere at karakterisere virkningen af ​​NSAID’er i inducere apoptose, blev niveauerne af PARP-aktivering målt ved Western-blot, hvilket viser, at Sulindac sulfid og diclofenac er stærke inducere af PARP-spaltning (fig S4A).

(A ) Samlet lysat inden immunoprecipitation. (B) kinaseassay viser induktion af JNK-kinase-aktivitet med NSAID. Induktion af JNK-aktivering ved Sulindac sulfid og diclofenac blev analyseret i cellelysater fra SKOV-3 og CAOV-3-celler behandlet med 50 pM Sulindac Sulfid, 100 uM Diclofenac eller DMSO ved hjælp af SAPK /JNK assaykit (Cell Signaling). (C) Western blot-analyse under anvendelse af anti-phospho JNK-antistof af cellelysater fra CAOV-3-celler behandlet med 50 pM Sulindac Sulfid, 100 uM Diclofenac eller DMSO og infektion med lentivirus kodning

MDA

-7 /IL-24 siRNA, GADD45α og GFP dobbelthuse.

kombinatorisk behandling af farmakologiske hæmmere af NF-KB-vejen med NSAID inducere apoptose i æggestokkene cancerceller

Vi undersøgte den biologiske relevans af NF KB-vej i æggestokkene cancerceller og bestemt de funktionelle konsekvenser af dets hæmning. Stedet for at bruge adenoviral levering af IKB inhibitor vi flyttet i retning af en mere klinisk relevant model og anvendes farmakologiske inhibitorer af NF-KB-vejen. Inhibitorer af NF-KB-vejen blev testet for deres evne til at inducere apoptose i ovariecancerceller. Apoptose blev målt 24 timer efter behandling af SKOV-3, CAOV-3 og SW626 ovariecancerceller med fire forskellige inhibitorer af NF-KB, 5 nM 6-Amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolin [53], 50 uM Isohelenin [54], 50 uM IKK-2-inhibitor SC-514 [55], og 200 uM IKK inhibitor II Wedelolactone (7-methoxy-5,11,12-trihydroxy-coumestan) [56] eller DMSO (kontrol). 6-Amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolin var en effektiv inducer af apoptose i alle tre cellelinier, og IKK inhibitor II Wedelolactone (7-methoxy-5,11,12-trihydroxy-coumestan) inducerede apoptose i to af de tre cellelinier. Behandling med Isohelenin eller IKK-2-hæmmer SC-514 resulterede kun i marginal eller ingen apoptose induktion (figur 5a). Derudover Real-time PCR-analyse viser, at Wedelolactone (7-methoxy-5,11,12-trihydroxy-coumestan) inducerer stærk aktivering af GADD45 α og γ-genekspression (fig s4b), og fremmer JNK phosphorylering (fig S4C) og spaltning af PARP (Figur S4A).

(A) Farmakologisk NF-KB-hæmmere inducere apoptose i æggestokkene cancerceller. SW626, CAOV-3, og SKOV-3-celler efter behandling med 5 nM 6-Amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolin (6-amino), 50 uM Isohelenin, 50 uM IKK-2-inhibitor SC-514, og 200 uM IKK-inhibitor II Wedelolactone (7-methoxy-5,11,12-trihydroxy-coumestan) eller DMSO som kontrol. Data betyder ± s.d. af tredobbelte uafhængige eksperimenter for hver behandling. (B) Dosisafhængig induktion af apoptose med NF-KB-inhibitorer i ovariecancerceller. Apoptose-assay af SKOV-3 ovariecancerceller. Celler blev behandlet med 5, 2,5, 1 og 0,5 nM af 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolin (6-amino) 50, 25, 10 og 5 pM Isohelenin, 50, 25, 10 og 5 uM IKK-inhibitor II Wedelolactone (7-methoxy-5,11,12-trihydroxy-coumestan) (Wedelolactone), 50, 25, 10 og 5 uM IKK-2-inhibitor SC-514 eller DMSO. Apoptose blev målt 24 timer efter behandling. Data betyder ± s.d. af tredobbelte uafhængige eksperimenter for hver behandling. (C) Apoptose i ovariecancerceller efter NSAID-behandling i kombination med NF-KB-inhibitorer. SW626, CAOV-3, og SKOV-3-celler efter behandling med 10 pM Sulindac Sulfid, 40 uM Diclofenac, 25 uM ebselen, 40 uM Naproxen, 1 nM 6-Amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) quinazolin (6-amino), og 200 pM IKK inhibitor II Wedelolactone og en kombination deraf. Apoptose blev målt 24 timer efter behandling. Data betyder ± s.d. af tredobbelte uafhængige eksperimenter for hver behandling. (D) Normaliseret isobologram opnået ved software Compusyn. CAOV-3-celler behandlet med en kombination af 10 pM Sulindac sulfid og 2,5 nM 6-amino viser synergistisk virkning.

Som for NSAID udførte vi en dosis-respons analyse for 6-amino-4- ( 4-phenoxyphenylethylamino) quinazolin og Wedelolactone (7-methoxy-5,11,12-trihydroxy-coumestan) for at bestemme den laveste dosis, der stadig inducerer programmeret celledød af æggestokkene cancerceller. Reducere koncentrationen af ​​6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolin fra 5 nM til 1 nm stadig induceret apoptose, mens reducerede doser af Wedelolactone resulterede i tab af apoptose induktion (figur 5b).

For at bestemme hvorvidt NF-KB-inhibitorer 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) quinazolin og Wedelolactone (7-methoxy-5,11,12-trihydroxy-coumestan) forbedre de pro-apoptotiske aktiviteter af NSAID’er vi kombineret de laveste doser af hvert af de fire NSAID’er, Sulindac Sulfid, Diclofenac, ebselen, og Naproxen med de laveste doser af de to NF-KB-inhibitorer, der stadig inducerer apoptose (figur 1b og 5b, henholdsvis). De NSAID’er og NF-KB-inhibitorer blev testet for deres evne til at inducere apoptose alene og i kombination. SKOV-3, CAOV-3, og SW626 ovariecancerceller blev behandlet med 10 pM Sulindac Sulfid, 40 uM Diclofenac, 25 uM ebselen, 40 uM Naproxen, 1 nM 6-Amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) quinazolin og 200 uM Wedelolactone . Apoptose blev målt 24 timer efter behandling afslørede, at kombinationer af NSAID’er med NF-KB inhibitor 6-Amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) signifikant quinazolin forøget apoptose i ovariecancerceller sammenlignet med en af ​​lægemidlerne alene (figur 5c). I modsætning hertil Wedelolactone forbedret de pro-apoptotiske virkninger kun på nogle af de NSAID’er og mindre effektivt i SKOV-3-celler (figur 5c). Isobologram analyse viser, at kombinationen af ​​6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) quinazolin med Sulindac Sulfid resulterer i en synergistisk virkning (figur 5d).

Discussion

NSAID’er har vist sig som potentielle lægemidler for chemoprevention i kræft, men deres fordele er stadig pågældende. Nogle traditionelle NSAID såsom Sulindac bliver i øjeblikket testet i kliniske forsøg for forskellige kræftformer. Faktisk prækliniske studier giver samstemmende beviser, at NSAID effektivt kan hæmme tumorigenese navnlig gennem hæmning af cyclooxygenase-2 (COX-2). Vigtigere, er aspirin brug blevet forbundet med en nedsat risiko for fjernt brystkræft tilbagefald og brystkræft død [57].

Epidemiologiske undersøgelser tyder inverse associationer mellem brug af non-steroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID) og forekomsten af ovariecancer [5], [6], [7]. Adskillige rapporter tyder på, at visse NSAID’er inducere apoptose og standsning af cellecyklus i humane ovariecancerceller men den nøjagtige molekylære mekanisme, hvormed NSAID’er inducerer antitumorigenic aktivitet er ikke klart. Tidligere vores grupper beskrevet en hidtil ukendt vej, ad hvilken NSAID inducere apoptose og vækststandsning i cancerceller. Vi viste, at induktion af pro-apoptotiske cytokin MDA-7 /IL-24 af NSAID er afgørende for programmeret celledød induceret af NSAID [23]. Men denne undersøgelse ikke omfatter æggestokkene cancerceller.

Flere rapporter ved hjælp af en adenovirus, der koder for

mda

-7 /IL-24-genet (Ad-

mda

-7 ) viser sin dybe og selektiv anticanceraktivitet i dyremodeller [26], [27], [50], [58], [59], [60] med en rapport til selektivt induceret celledød af ovariecancerceller som resulterer i suppression af tumorvækst

in vivo

[58]. Imidlertid forbigående ekspression, potentielt uønskede immunreaktioner (medieret af adenovirus) og problemer med systemisk afgivelse begrænse den generelle anvendelse af adenoviral levering af

MDA

-7 /IL-24, især når de indgives systemisk som et ikke-replikerende adenovirus.

i den forbindelse vores resultater, at NSAID med anti-cancer aktivitet inducerer høje niveauer af

mda

-7 /IL-24 i æggestokkene cancerceller giver en ny terapeutisk strategi at styrke

mda

-7 /IL-24 niveauer på et systemisk niveau. Faktisk har vi fået et samlet overblik over konsekvenserne af en hel panel af NSAID på kræft i æggestokkene celleoverlevelse ved at sammenligne deres effektiviteter at inducere apoptose og

mda

-7 /IL-24-ekspression. De mest potente inducere af

mda

-7 /IL-24 genekspression omfatter Sulindac sulfid og Diclofenac. Vores konklusion svarer med tidligere rapporter, der påviste, at behandling af humane lunge tumorxenoplantater i nøgne mus med Ad-

mda

-7 foruden Sulindac reducerede tumorvækst mere effektivt end Ad-

mda

– 7 [50]. Desuden disse resultater bekræfter vores tidligere resultater, som apoptose induktion af pro-apoptotiske cytokin

mda

-7 /IL-24 medierer induktion af GADD45 α og γ udtryk og JNK aktivitet i andre typer af kræft [23]. Mens Sulindac Sulfid og Diclofenac selv ikke kan være den ideelle medicin til at fremkalde

mda

-7 /IL-24 og apoptose i æggestokkene cancerceller, og især Diclofenac fremkalder mange bivirkninger hos patienter, der begrænser dens anvendelse i kræftpatienter bør det være muligt at generere modificerede versioner af disse lægemidler, som er mere potente i deres anti-cancer aktiviteterne og med reducerede negative og ikke-tilsigtede virkninger. Faktisk en modificeret version af Sulindac er for nylig blevet rapporteret at være mere aktive mod cancerceller uden at inhibere COX 1 og 2 [61].

Diclofenac er tidligere blevet vist at inducere apoptose i colon og pladecellecarcinom og at inhibere pankreatisk tumorvækst [62], [63]. Der er imidlertid ingen rapporter om dens anvendelse i ovariecancer. Her viser vi, at Diclofenac samt Sulindac Sulfid inducere apoptose og inhibere tumorvækst af ovariecancer. Disse overbevisende data styrker forestillingen om de potentielle fordele ved NSAID-behandling for kræft i æggestokkene.

Vi identificerede også Naproxen og ebselen som moderate inducere af apoptose og

mda

-7 /IL-24-ekspression i ovariecancerceller. Mens Naproxen med til at forhindre urinblæren og kolon carcinogenese [64], har Ebselen vist sig at reducere cisplatin behandling toksicitet hos rotter kræft i æggestokkene modeller, øge anti-tumor aktivitet og forbedre dødelighed, sygelighed og resultatet [65]. Som nævnt før, har vi rapporteret, at induktion af

mda

-7 /IL-24 ved strukturelt forskellige NSAID er afgørende for apoptose induktion af bryst-, prostata-, nyre- og mave kræftceller [23]. Men i denne tidligere undersøgelse, naproxen og Ebselen havde kun marginal virkning på apoptose induktion. I denne rapport, observerede vi forskellige narkotika aktiviteter for Naproxen og ebselen. Ebselen og Naproxen induceret apoptose og

mda

-7 /IL-24-ekspression i æggestokkene cancerceller og også synergieffekt med de mere potente NSAID’er, Diclofenac og Sulindac sulfid, tyder potentiel klinisk anvendelighed i æggestokkene kræftbehandling.

Vi har tidligere vist, at hæmning af NF-KB i cancerceller øger apoptose uden at fremme

mda

-7 /IL-24 produktion [23]. En af de store transskriptionelle kredsløb impliceret i inflammation er NF-KB /IKB-vejen [66]. Desuden har NF-KB blevet impliceret i cancer celleoverlevelse og flygte fra programmeret celledød og aktiveres ved kemoterapeutiske midler i cancerceller [30], [31], [33]. Mutationer i forskellige gener af NF-KB-vejen og konstitutivt aktiv NF-KB ofte observeres i forskellige former for kræft [33]. Faktisk ovariecancer celler ofte indeholder aktiveret NF-KB før behandling og forventes derfor at være resistente over for kemoterapi

a priori

. 5′CTGTCTAGACAAAAACTTTGTTCTCATCGTGTCATCTCTTGAATGACACGATGAGAACAAAGGGGGATCTGTGGTCTCATACA-3′.

Animal