PLoS ONE: Semaphorin7A Fremme af tumorvækst og metastase i Human Oral Cancer ved forordning af G1 Cell Cycle og matrixmetalloproteaser: Mulig Bidrag til tumor Angiogenesis

Abstrakt

Baggrund

Semaphorins (Semaer) bestå af en stor familie af udskilte og membranforankrede proteiner, der er vigtige i neuronal stifinding og Axon vejledning i udvalgte områder af det udviklende nervesystem. Af dem har SEMA7A blevet rapporteret at have en kemotaktisk aktivitet i neurogenese og være en immunmodulator; dog lidt om relevansen af ​​SEMA7A i adfærd af oral pladecellekræft (OSCC).

Metoder

Vi evaluerede SEMA7A udtryk i OSCC-afledte cellelinjer og primære OSCC prøver ved anvendelse af kvantitativ revers transkriptase-polymerasekædereaktion, immunoblotting, og semikvantitativ immunhistokemisk (sq-IHC). Desuden blev SEMA7A Knockdown celler (shSEMA7A celler) anvendes til funktionelle eksperimenter, herunder cellulær proliferation, invasionsevne, og migration assays. Vi analyserede også den kliniske korrelation mellem SEMA7A status og kliniske adfærd hos patienter med OSCC Salg

Resultater Salg

SEMA7A mRNA og protein blev opreguleret signifikant (P 0,05). I OSCC-afledte cellelinier sammenlignet med humane normale orale keratinocytter. De shSEMA7A celler viste nedsat cellulær vækst ved celle-cellecyklusstandsnings ved G1 fasen, der følger af opregulering af cyclinafhængige kinaseinhibitorer (p21

Cip1 og p27

Kip1) og nedregulering af cykliner (cyclin D1 , cyclin E) og cyclin-afhængige kinaser (CDK2, CDK4 og CDK6); og nedsat invasionsevne og migrationen af ​​reduceret sekretion af matrix-metalloproteaser (MMP’er) (MMP-2, proMMP-2, pro-MMP-9), og ekspression af membrantype 1- MMP (MT1-MMP). Vi fandt også inaktivering af ekstracellulære regulerede kinase 1/2 og AKT pathways, en opstrøms molekyle af celle-cellecyklusstandsnings ved G1 fasen, og reduceret sekretion af MMP’er i shSEMA7A celler. sq-IHC viste, at SEMA7A ekspression i de primære OSCCs var signifikant (P = 0,001) højere end i normale modstykker og er korreleret med primær tumor size (P = 0,0254) og regional lymfeknude metastaser (P = 0,0002).

Konklusion

Vores data giver evidens for en væsentlig rolle SEMA7A i tumorvækst og metastase i OSCC og oplyste, at SEMA7A kan spille en potentiel diagnostisk /terapeutisk mål til patienter med OSCC.

Henvisning: Saito T, Kasamatsu A, Ogawara K, Miyamoto I, Saito K, Iyoda M, et al. (2015) Semaphorin7A Fremme af tumorvækst og metastase i Human Oral Cancer ved forordning af G1 Cell Cycle og matrixmetalloproteaser: Mulig Bidrag til tumor angiogenese. PLoS ONE 10 (9): e0137923. doi: 10,1371 /journal.pone.0137923

Redaktør: Chih-Hsin Tang, Kina Medical University, TAIWAN

Modtaget: Juni 1, 2015; Accepteret: August 23, 2015; Udgivet: 17 September, 2015

Copyright: © 2015 Saito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

finansiering:.. forfatterne modtaget nogen specifik finansiering til dette arbejde

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Semaphorins (Semaer), udskilles og membran-associerede proteiner, giver miljømæssige stikord til at mægle diverse udviklingsprocesser herunder neuronal cellulære migration, axon vejledning, vaskulogenese forgrening morfogenese, og hjerte-organogenese [1]. SEMA abnormiteter er blevet impliceret i patogenesen af ​​neurologiske lidelser, såsom Alzheimers sygdom og motorisk neuron degeneration. Semaer også udtrykkes i immunresponset, herunder B-celler, T-celler, naturlige dræberceller og makrofager, og har været impliceret i reguleringen af ​​organogenese, angiogenese, apoptose, og neoplasi [2].

SEMA1 -8 er karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​en bevaret stort SEMA domæne (~500 aminosyrer) ved N-terminale domæne og differentieret ved deres C-terminus [3]. SEMA1 og SEMA2 findes i invertebrater, er SEMA3-7 findes i hvirveldyr, og SEMA8 findes i virus [4]. SEMA4-7 eksisterer primært som membranbundne former, hvorimod SEMA3 udskilles som et opløseligt molekyle. Diffusible Semaer kan fremkalde autokrin /parakrin signalering, mens membranbundne familiemedlemmer kan mægle kortrækkende juxtacrine signaler.

Selvom kræftceller typisk udtrykker unormale niveauer af Semaer, rolle SEMA7A i kræft progression er stort set ukendt. SEMA7A, en hidtil ukendt transmembran glycosylphosphatidylinisotol-forankret protein, blev først identificeret i immunsystemet i myeloide og lymfoid-afstamningsceller [5-7] og funktioner ved p-integriner i flere systemer [8]. Vi præsenterer resultaterne af en omfattende analyse af molekylære /cellulære undertyper af SEMA7A i oral pladecellekræft (OSCC), der er forbundet funktionelt og bidrage klinisk til tumoral progression og prognose i OSCCs.

Materialer og metoder

Etisk erklæring

Etisk Komité Graduate School of Medicine, Chiba University (godkendelsesnummer, 236) godkendte forsøgsprotokollen, der blev udført i overensstemmelse med de principper for Helsinki-deklarationen. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke.

OSCC-afledte cellelinjer og vævsprøver

Menneskelig OSCC-afledte cellelinier (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Sa3, Ca9- 22, SAS, KOSC-2, Ho-1-u-1, og Ho-1-N-1) blev opnået fra human Science Research Resources Bank (Osaka, Japan) eller Riken Bioresource center (Ibaraki, Japan) gennem National Bio-Resource Project for Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi i Japan. Kort tandemgentagelse profiler bekræftet cellulær identitet. Primære dyrkede humane normale orale keratinocytter (HNOKs) blev opnået fra sunde orale slimhinde epitel prøver indsamlet fra unge patienter på Chiba Universitetshospital. Tre uafhængige HNOKs var primær dyrket og opretholdt i oral keratinocyt medium (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA, USA) bestående af 5 ml oral keratinocytvækstfaktor supplement (ScienCell Research Laboratories) og 5 ml penicillin /streptomycin-opløsning (ScienCell Research Laboratories) [9-12]. Alle OSCC-afledte celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Sigma-Aldrich) og 50 enheder /ml penicillin og streptomycin (Sigma-Aldrich).

Et hundrede og halvtreds primære OSCC prøver og patient-matchede normale epitel blev opnået under indgreb udføres på Chiba Universitetshospital. De operativt fjernede væv blev fikseret i 20% pufret formaldehydopløsning for patologisk diagnose og immunhistokemi (IHC) farvning. Vi udførte histopatologisk diagnose af hver OSCC prøve i henhold til World Health Organization kriterier på Patologisk Institut for Chiba Universitetshospital [13]. De klinisk-patologiske stadier blev bestemt på grundlag af TNM klassifikationen af ​​Den Internationale Union mod Kræft [14].

mRNA ekspressionsanalyse

Samlet RNA blev isoleret ved hjælp Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ), ifølge producentens instruktioner. cDNA blev genereret ved hjælp af ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo Life Science, Osaka, Japan) i overensstemmelse med producentens anvisninger. Real-time kvantitativ revers transkriptase-polymerasekædereaktion (QRT-PCR) blev udført i en 20-pi reaktionsvolumen ved anvendelse af Thunderbird SYBR qPCR Mix (Toyobo) på LightCycler 480 apparat (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland) i overensstemmelse med den producentens protokol. De generelle amplifikationsbetingelser blev udført som tidligere [15-18] beskrevet. Primere blev designet ved hjælp Primer 3Plus (on-line gratis software, https://primer3plus.com/~~number=plural), som angiver den mest passende sæt. Primersekvenserne anvendt til QRT-PCR var:

SEMA7A

, fremad, 5′-TGTGTATTCCCTCGGTGACA-3 ‘; omvendt, 5’-GAGTGGAACAATGGCGTCTT-3 ‘; og

glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase

(

GAPDH

), frem, 5′-AACATCATCCCTGCCTCTACTGG-3 ‘; omvendt, 5’-TTGAAGTCAGAGGAGACCACTG-3 ‘; og

MMP2

, fremad, 5′-CCCCAAAACGGACAAAGAG-3 ‘; omvendt, 5’-CTTCAGCACAAACAGGTTGC-3 ‘; og

MMP9

, fremad, 5′-GAACCAATCTCACCGACAGG-3 ‘; omvendt, 5’-GCCACCCGAGTGTAACCATA-3 ‘; og

membran typen 1- MMP

(

MT1-MMP

), frem, 5′-GCCTTGGACTGTCAGGAATG-3 ‘; omvendt, 5’-AGGGGTCACTGGAATGCTC-3 ‘. Udskriften beløb for SEMA7A blev estimeret ud fra de respektive standard kurver og normaliseret til de

GAPDH

udskrift fastsatte beløb i tilsvarende prøver.

Immunoblotting analyse

Cellerne blev vasket tre gange med koldt phosphatbufret saltvand (PBS) og forsigtigt og kortvarigt centrifugeret. De cellulære pellets blev inkuberet ved 4 ° C i 30 minutter i en lysepuffer (7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 4% vægt /volumen CHAPS, og 10 mM Tris, pH 7,4) med en proteinaseinhibitor cocktail (Roche Diagnostics). Den samlede proteinkoncentration blev målt under anvendelse af et farvestof-bindende fremgangsmåde baseret på Bradford assay med Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent koncentrat (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Salg

Protein ekstrakter blev underkastet elektroforese på 4-12% Bis-Tris-gel og overført til nitrocellulosemembraner (Invitrogen) og blokeret i 1 time ved stuetemperatur med Blokering One (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan). Membranerne blev vasket tre gange med 0,1% Tween-20 i Tris-bufret saltvand (TBS-T) og inkuberet med affinitetsoprenset anti-muse SEMA7A monoklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), kanin-anti- GAPDH polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-cyclin D1 polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-cyclin E1 polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-p21

Cip1 polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology) , kanin-anti-AKT polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti-phosphoryleret-AKT (Pakt) polyklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology), kanin-anti membrantype-1 matrixmetalloproteinase (MT1-MMP) monoklonalt antistof (Cell Signaling Technology , Danvers, MA, USA), kanin-anti-ekstracellulært signal-reguleret kinase (ERK) 1/2 (Cell Signaling Technology), kanin-anti-phosphoryleret-ERK1 /2 (pErk1 /2) (Cell Signaling Technology), kanin-anti- p27

Kip1 polyklonalt antistof (Cell Signaling Technology), kanin-anti-cyclin-afhængig kinase (CDK) 2 monoklonalt antistof (Cell Signaling Technology), kanin-anti-CDK4 monoklonalt antistof (Cell Signaling Technology), og kanin-anti-CDK6 monoklonalt antistof (Cell Signaling Technology) natten over ved 4 ° C. Membranen blev vasket med TBS-T og inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin eller anti-mus IgG som sekundært antistof (Promega, Madison, WI, USA), i 1 time ved stuetemperatur. Endelig blev detekteret membranerne under anvendelse Super-Signal West Pico Chemiluminescent substrat (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA), og immunoblotting blev visualiseret ved at udsætte membranerne til ChemiDoc XRS Plus-systemet (Bio-Rad Laboratories). Signalintensiteterne blev kvantificeret under anvendelse Image Lab-systemet (Bio-Rad Laboratories). Densitometrisk SEMA7A protein data blev normaliseret til GAPDH protein niveauer.

Transfektion med shRNA plasmid

OSCC-afledte celler (SAS og KOSC-2) blev transficeret med SEMA7A shRNA (shSEMA7A) eller kontrol shRNA ( shMock) vektorer (Santa Cruz Biotechnology) med Lipofectamine 3000 og Plus Reagenser (Invitrogen), i henhold til producentens anvisninger. Efter transfektion blev cellerne isoleret ved dyrkningsmediet indeholdende 1 pg /ml puromycin (Invitrogen). Flere uger efter transfektion, en lille koloni var levedygtige. De cellekolonier blev opsamlet, overført til seks-brønds plader, og udvide gradvist til 10 cm skåle. For at vurdere effektiviteten af ​​SEMA7A knockdown, vi udførte QRT-PCR og immunblotting.

Cellular vækst

For at vurdere effekten af ​​SEMA7A knockdown på cellulær proliferation, analyserede vi cellevækst i shSEMA7A og shMock celler . Disse celler blev podet i 6 cm skåle med en densitet på 1 x 10

4 levedygtige celler. Ved de angivne tidspunkter blev cellerne trypsiniseret og talt i tre eksemplarer ved anvendelse af et hæmocytometer.

invasivitet assay

For at vurdere virkningen af ​​SEMA7A knockdown på invasivitet, i alt 2,5 x 10

5-celler resuspenderet i serum-frit medium blev podet på Matrigel

®-belagt Transwell

® skær (8 um porer) (Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). I det nedre kammer, blev 2 ml DMEM med 10% FBS tilsat som en kemoattraktant. Efter at cellerne var inkuberet i 48 timer ved 37 ° C blev insertet vasket med PBS, og cellerne på den øvre overflade af indsatsen blev fjernet med vatpinde. Celler klæber til den nedre overflade af membranen blev fikseret med methanol og farvet med krystalviolet. Antallet af celler, der invaderede gennem porerne i fem tilfældige felter blev talt under anvendelse af et lysmikroskop ved × 100 forstørrelse.

Migration assay

Cellerne blev podet i seks-brønds plader med 10% FBS /DMEM indtil et konfluent monolag dannet. Med en mikropipette spids, blev ét sår oprettet i midten af ​​hver plade. Vi inkuberede plader ved 37 ° C ved 5% carbondioxid med fri-serum medium. Resultaterne blev visualiseret ved at måle såret område, der var fri for celler under anvendelse af Lenaraf220b software (https://www.vector.co.jp/soft/dl/win95/art/se312811.html). Den gennemsnitlige værdi blev beregnet ud fra data fra seks brønde.

Cell-cyklus analyse

De transmutants blev behandlet med 200 ng /ml nocodazol (Sigma-Aldrich) i 16 timer for at synkronisere celler på G2 /M overgang [19-21]. Seksten timer efter behandling med nocodazol, blev cellerne høstet, vasket med PBS, og probet med CycleTEST Plus DNA reagenskittet (Becton-Dickinson). Flowcytometrisk bestemmelse af DNA-indholdet blev analyseret ved hjælp af BD Accuri

TM C6 flowcytometer (Becton-Dickinson).

Zymografi

At påvise udskilte MMP’er fra shSEMA7A og shMock celler, vi gennemført en gelatinezymografi assay (Primary Cell, Sapporo, Japan), i henhold til producentens anvisninger med mindre modifikationer. De konditionerede medier blev blandet med en SDS-prøvebuffer og separeret på gelatinegeler. Efter vask blev gelerne inkuberet i 32 timer ved 37 ° C i den enzymatiske reaktion buffer. Gelerne blev derefter farvet med Coomassie brilliant blå og affarvet i en methanol /eddikesyre-opløsning med forsigtig omrøring på en ryster plade. De MMP’er blev identificeret ved tilstedeværelsen af ​​klare bånd i en baggrund med ensartet farvning.

cycloheximid (CHX) behandling

CHX, en fælles reagens til inhibering af proteinsyntese, er blevet rapporteret til inaktive MMP’erne funktioner. Da flere undersøgelser har vist, at Ki på CHX varierer fra 1 til 50 ug /ml [22-27] anvendte vi CHX (Wako, Osaka, Japan) ved en koncentration på 1 ug /ml i 48 timer. Efter behandling blev udført immunoblotting analyse og zymografi

Forbigående opregulering i SEMA7A knockdown celler

Seneste undersøgelse er blevet rapporteret, at TGF-β

1 (R . D Systems, Minneapolis , MN, USA) øger ekspressionsniveauet af SEMA7A gennem en SMAD2 /3-uafhængige vej [28]. Da har vi behandlet shSEMA celler med TGF-β

1 ved en koncentration på 1 ng /ml i 12 timer. Efter behandling blev mRNA-ekspression og immunoblotting analyser udført.

Semikvantitativ IHC

Semikvantitativ IHC (sq-IHC) af de 4-um sektioner af paraffinindlejrede OSCC kliniske prøver blev udført. Kort fortalt, efter paraffinization, hydratisering, aktivering af antigen, hydrogenperoxid quenching og blokering blev kliniske sektioner inkuberet med muse-anti-SEMA7A monoklonalt antistof (Santa Cruz Biotechnology) ved 4 ° C i et fugtigt kammer natten over. Efter inkubation med det primære antistof blev prøverne vasket tre gange med PBS og behandlet med Envision reagens (DAKO, Carpinteria, CA, USA) efterfulgt af farveudvikling i 3,3′-diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAKO). Objektglassene blev derefter modfarvet let med hematoxylin, dehydreret med ethanol, renset med xylen og monteret. For at kvantificere status for SEMA7A proteinekspression i kliniske prøver, vi brugte sq-IHC pointsystemer tidligere [19, 29-33], der er beskrevet. De gennemsnitlige procentdele af positive tumorceller blev bestemt i mindst tre tilfældige felter i hver sektion, og intensiteten af ​​SEMA7A-immunreaktion blev scoret som følger: 0+, ingen; 1+, svag; 2+, moderat; og 3+, intens. Farvningen intensitet og de cellulære numre blev ganget at producere en SEMA7A sq-IHC score. For at bestemme cutoff punkter i SEMA7A sq-IHC scoringer, vi analyserede sq-IHC score på 150 patienter ved hjælp af receiver opererer karakteristiske (ROC) kurver og den Youden indekset. Sager med en score over 69,5 blev defineret som SEMA7A-positive. To uafhængige patologer fra Chiba Universitetshospital, ingen af ​​dem havde kendskab til patienternes kliniske status, gjorde disse domme. For at beregne den 5-årige overlevelsesrate, vi undersøgte hver patients liv og måned for døden.

Statistisk analyse

For at sammenligne SEMA7A ekspressionsniveauerne blev statistisk signifikans evalueret ved brug af Mann-Whitney U test . Forholdet mellem SEMA7A sq-IHC farvning scores og klinisk-patologiske profiler blev evalueret ved hjælp af χ

2 test, Fishers eksakte test, t-test, og Mann-Whitney U test. Den 5-årige overlevelsesrate blev evalueret ved brug af log-rank test. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Dataene er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelsen på middelværdien (SEM).

Resultater

Evaluering af SEMA7A udtryk i OSCC-afledte cellelinjer

For at undersøge udtryk status SEMA7A, vi udførte QRT-PCR og immunoblotting analyser bruger ni OSCC-afledte cellelinier (HSC-2, HSC-3, HSC-4, SA3, Ca9-22, SAS, KOSC-2, Ho-1-u -1, og Ho-1-N-1) og HNOKs.

SEMA7A

mRNA blev opreguleret signifikant (P 0,05) i alle OSCC-afledte cellelinjer sammenlignet med HNOKs (Fig 1A). Vi udførte også immunoblotting analyse for at undersøge SEMA7A proteinekspression i de OSCC-afledte cellelinier og de HNOKs (Fig 1B). En betydelig stigning i SEMA7A proteinekspression blev set i alle OSCC-afledte cellelinier sammenlignet med HNOKs.

(A) Kvantificering af

SEMA7A

mRNA-ekspression i OSCC-afledte cellelinjer ved qRT- PCR-analyse. Signifikant (

✽P 0,05, t-test) opregulering af

SEMA7A

mRNA ses i syv OSCC-afledte cellelinjer sammenlignet med de HNOKs. Data udtrykkes som middelværdien ± SEM af tredobbelte resultater. (B) Immunblotting analyse af SEMA7A protein i OSCC-afledte cellelinier og HNOKs. SEMA7A proteinekspression opreguleres i OSCC-afledte cellelinier sammenlignet med den i HNOKs. Densitometriske SEMA7A protein data er normaliseret til GAPDH protein niveauer. Værdierne er udtrykt som en procentdel af de HNOKs.

Etablering af SEMA7A knockdown celler

Siden blev observeret hyppigere opregulering af SEMA7A i OSCC-afledte celler (Fig 1), transficerede vi SEMA7A shRNA eller shMock i OSCC-afledte celler (SAS og KOSC-2). For at undersøge SEMA7A mRNA og protein udtryk i shSEMA7A celler, QRT-PCR og immunoblotting blev udført (fig 2A og 2B).

SEMA7A

mRNA-ekspression i shSEMA7A celler var signifikant (P 0,05) lavere end i shMock celler (Fig 2A). Den SEMA7A proteinniveau i shSEMA7A celler også var faldet i forhold til shMock celler (Fig 2B).

(A) Angivelse af

SEMA7A

mRNA i shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2 -afledte transfektanter).

SEMA7A

mRNA-ekspression i shSEMA7A celler er signifikant (

✽P 0,05, t-test) lavere end i shMock celler. (B) Immunoblotting analyse viser, at SEMA7A protein niveauer i shSEMA7A cellerne også faldet markant i forhold til de shMock celler.

Funktionelle analyser af SEMA7A knockdown celler

For at undersøge effekten af SEMA7A knockdown på cellulær proliferation, overvåget vi cellulær vækst i 168 timer. Cellulær vækst i shSEMA7A celler faldt betydeligt (P 0,05) sammenlignet med de shMock celler (Fig 3A). Vi udførte også cellulære invasionsevne og migration analyser for at vurdere de biologiske effekter af SEMA7A Knockdown celler. I en invasionsevne assay antallet af gennemtrængende shSEMA7A celler signifikant (P 0,05) faldt sammenlignet med de shMock celler (Fig 3B). I migration assay når vi overvåges visuelt området af ensartede sår i konfluent cellekultur sårene i shSEMA7A cellerne lukket signifikant (P 0,05) senere end i de shMock celler (Fig 3C). Derfor shSEMA7A celler viste ikke kun faldet celleproliferation men også faldet invasionsevne og vandrende evner.

(A) Cellulær proliferation assay af shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2-afledte transfektanter). For at bestemme virkningen af ​​shSEMA7A på cellulær proliferation blev shMock og shSEMA7A celler udsået i 6 cm skåle med en densitet på 1 x 10

4 levedygtige celler /brønd. Den cellulære vækst shSEMA7A celler inhiberes væsentligt i forhold til de shMock celler efter 4 dage (96 timer). Resultaterne er udtrykt som middel ± SEM af værdier fra tre assays (

✽P 0,05, t-test). (B) invasivitet assay af shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2-afledte transfektanter). For at evaluere effekten af ​​SEMA7A knockdown på invasivitet, vi podet 2,5 × 10

5 celler i serumfrit medium af Matrigel

®-belagt Transwell

® skær (8 um porer) og tilsat serum-suppleret medium i det nedre kammer som en kemoattraktant. Efter inkubation ved 37 ° C i 48 timer, celler, der trængte gennem porerne blev fikseret, farvet og talt ved anvendelse af et lysmikroskop ved × 100 forstørrelse. Antallet af shSEMA7A celler trænger gennem porerne er faldet væsentligt (

✽P 0,05, t-test) sammenlignet med shMock celler. Gennemsnitsværdien blev beregnet ud fra data opnået fra tre separate kamre. (C) Migration assay af shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2-afledte transfektanter). For at vurdere effekten af ​​SEMA7A knockdown om migration, blev ensartede sår foretaget i sammenflydende kulturer af shSEMA7A og shMock celler og omfanget af lukningen blev overvåget visuelt hver 6. time i 12 timer. Gennemsnitsværdien blev beregnet ud fra data opnået fra tre separate kamre. Såret område er faldet væsentligt (

✽P 0,05, t-test). I kulturen i shMock celler efter 12 timer, mens et hul forblev i shSEMA7A celler

celle- cyklus analyse af shSEMA7A celler

Siden den cellulære vækst i SEMA7A knockdown celler faldt (fig 3A), vi undersøgte de celle-cyklus distributioner anvendelse af flowcytometri. Procentdelen af ​​cellerne i G1-fasen i shSEMA7A celler var signifikant (P 0,05) højere end i shMock celler (Fig 4A) .Vi vurderes også ekspressionsniveauerne af de G1 anholdelse-relaterede proteiner, såsom CDKIs (p21

Cip1 og p27

Kip1), cycliner og CDK’er. Som forventet CDKIs opreguleret, og cyclin D1, cyclin E, CDK2, CDK4 og CDK6 blev nedreguleret signifikant (P 0,05) i shSEMA7A celler (Fig 4B). Disse resultater indikerede, at shSEMA7A celler inhiberes cellulær proliferation ved celle-cellecyklusstandsnings ved G1 fasen.

(A) Flowcytometrisk analyse blev udført for at undersøge cellecyklusfremadskriden i shSEMA7A og shMock celler (SAS og KOSC- 2-afledte transfektanter) efter synkronisering ved G2 /M fase til hjælp nocodazol. Procentdelen af ​​celler i G1-fasen i shSEMA7A celler forøges markant sammenlignet med de shMock celler. (B) Immunobloting analyse viser opregulering af p21

CIP1 og P27

Kip1 og nedregulering af cyklin D1, cyklin E, CDK2, CDK4 og CDK6 i shSEMA7Acells (SAS og KOSC-2-afledte transfektanter ) sammenlignet med de shMock celler.

reduceret sekretion af MMP og expressin af MT1-MMP i SEMA7A knockdown celler

Da invasiv og migrerende evner i SEMA7A knockdown celler faldt (fig 3B og 3C), vurderede vi MMP’er-medieret matrix proteolyse ved QRT-PCR og en MMP zymografi assay.

MMP2

MMP9

mRNA udtryk i shSEMA7A cellerne var signifikant (p 0,05) lavere end i shMock celler (Fig 5A). I shSEMA7A celler, sekretion af MMP2, proMMP-2, og proMMP-9 klart faldt sammenlignet med shMock celler. CHX behandlede shMock celler inhiberede sekretionen af ​​MMP-2, proMMP-2, og pro-MMP-9. Niveauerne af udskilt MMP var repræsenteret det normaliserede sekretion indeks, der blev beregnet som procentdelen af ​​udskilt MMP forhold til den for de shMock celler (Fig 5B). Vi vurderede også MT1-MMP ved QRT-PCR og immunoblotting analyser (Fig 6A og 6B, henholdsvis).

MT1-MMP

mRNA-ekspression i shSEMA7A celler var signifikant (P 0,05) lavere end i shMock celler (Fig 6A). Den MT1-MMP proteinniveauet i shSEMA7A celler også var faldet i forhold til shMock celler (Fig 6B). CHX behandlede shMock celler også inihibited ekspression af MT1-MMP udtryk. Disse resultater kraftigt antydet, at SEMA7A var et vigtigt molekyle for MMP ‘sekretion og udtryk.

(A) Udtryk af MMP-2 og MMP9 mRNA i shMock og shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2-afledte transfektanter). MMP-2 og MMP9 mRNA udtryk i shSEMA7A celler er signifikant (✽p 0,05, t-test) lavere end i shMock celler. (B) sekreter af MMP-2, proMMP-2, og proMMP-9 i shMock og shSEMA7A celler blev analyseret ved gelatinezymografi. I shSEMA7A celler, sekretion af MMP2, proMMP-2, og proMMP-9 klart faldt sammenlignet med shMock celler. Desuden CHX behandlede shMock celler inhiberede sekretionen af ​​MMP-2, proMMP-2, og pro-MMP-9. Densitometrisk MMP-2, proMMP-2, og proMMP-9 niveauer normaliseres til shMock niveauer.

(A) Angivelse af

MT1-MMP

mRNA i shMock og shSEMA7A celler ( SAS og KOSC-2-afledte transfektanter).

MT1-MMP

mRNA-ekspression i shSEMA7A celler er signifikant (

✽P 0,05, t-test) lavere end i shMock celler. (B) Immunoblotting analyse viser, at MT1-MMP-proteinniveauer i shSEMA7A celler også faldet markant sammenlignet med de shMock celler. CHX behandlede shMock celler også inihibited ekspression af MT1-MMP udtryk. Densitometrisk MT1-MMP protein data er normaliseret til GAPDH protein niveauer.

inaktivering af ERK1 /2-og AKT veje i SEMA7A knockdown celler

Vi vurderede phosphoryleringsniveauerne af ERK1 /2 og AKT i shSEMA7A ved immunblotting analyse. Niveauerne af pErk1 /2 og Pakt protein faldt signifikant (p 0,05) i shSEMA7A celler sammenlignet med shMock celler (Fig 7A og 7B). Disse resultater antydede, at ERK1 /2-og AKT signalveje blev svækket hyppigt i shSEMA7A celler.

(A, B) Immunoblotting analyse viser, at SEMA7A knockdown resulterer i nedsat mængde pErk1 /2 og Pakt sammenlignet med den shMock celler (SAS og KOSC-2-afledte transfektanter). Densitometrisk pErk1 /2, ERK1 /2, Pakt, og AKT protein data er normaliseret til GAPDH protein niveauer.

SEMA7A udtryk i SEMA7A knockdown celler efter TGF-β

1 behandling

for at undersøge virkningen af ​​TGF-β

1 på SEMA7A ekspression behandlede vi transfektanterne med TGF-β

1.

SEMA7A

mRNA i TGF-β

1 behandlede shSEMA7A celler var signifikant opreguleret sammenlignet med TGF-β

1 ikke-behandlede shSEMA7A celler (Fig 8).

De mRNA niveauer af

SEMA7A

i TGF-β

1 rugede shSEMA7A celler (SAS og KOSC-2) er steget betydeligt (SAS, * P = 0,0022, ** P = 0,0021, † P = 0,0001, †† P = 0,0005, t-test) (KOSC-2, * P = 0,0003, ** P = 0,0003, † P = 0,0029, †† P = 0,0045, t-test) i forhold til, at der i TGF -β

1 unincubated shSEMA7A celler.

fosforylering niveauer af ERK1 /2 og AKT i SEMA7A knockdown celler med /uden TGF-β

1

Vi vurderede phosphorylering niveauer af ERK1 /2 og AKT samt SEMA7A udtryk i SEMA7A knockdown celler med /uden TGF-β

1 ved immunoblotanalyse. Den SEMA7A proteinniveau i TGF-β

1 behandlede shSEMA7A celler blev forøget sammenlignet med de ikke-behandlede shSEMA7A celler. Desuden TGF-β

1 behandlede shSEMA7A celler viste øget pERK og Pakt niveauer sammenlignet med ikke-behandlede shSEMA7A celler (Fig 9).

Immunoblotanalyse af phosphoryleringsniveauerne af SEMA7A, ERK1 /2, og AKT. SEMA7A knockdown resultater i nedsat mængde pErk1 /2 og Pakt sammenlignet med shMock celler (SAS og KOSC-2-afledte transfektanter). TGF-β

1 behandlede shSEMA7A celler udviser øget SEMA7A niveau sammenlignet med TGF-β

1 ikke-behandlede shSEMA7A celler. Den pErk1 /2 og Pakt niveau viser også steget i TGF-β

1 behandlede shSEMA7A celler.

Evaluering af SEMA7A udtryk i primær OSCCs

For at undersøge udtryk status SEMA7A i primære OSCCs og relationen til de klinisk-patologiske egenskaber, vi analyserede SEMA7A proteinekspression i primære OSCCs fra 150 patienter ved hjælp af en sq-IHC pointsystem. Den SEMA7A proteinekspression af primære OSCCs var signifikant (P 0,05) højere end i normalt væv (Fig 10A-10C). De SEMA7A sq-IHC scores i OSCCs og tilstødende normale orale væv varierede fra 36,7 til 203,8 (median, 109,3) og 13,5-87,5 (median, 37,9), (fig 10C). For at bestemme en optimal cutoff punkt af de identificerede sq-IHC scoringer, brugte vi ROC kurve analyse og Youden indekset. ROC-kurven analyse areal under kurven (AUC) var 0,91 (95% konfidensinterval [CI], fra 0,8749 til 0,9378, P 0,05) og Youden indeks (følsomhed, 70,5%; specificitet, 96,7%, P 0,05) viste, at cutoff-værdien var 69,5 (fig 10D og 10E). Korrelationerne mellem de klinisk-patologiske egenskaber ved patienter med OSCC og status for SEMA7A proteinekspression er vist i tabel 1. Blandt de kliniske klassificeringer blev SEMA7A-positive OSCCs korrelerede signifikant (P 0,05) med større tumorer, hyppig regionale lymfeknuder node metastase, og avancerede kliniske stadier. De 5-årige overlevelsesrater i SEMA7A-positive OSCCs (n = 106) og SEMA7A-negative OSCCs (n = 44) var 76,3% og 85,3%, hhv. Målestokke 50 uM.