PLoS ONE: KIAA0101 overudtrykkes, og fremmer vækst og invasion i adrenal kræft

Abstrakt

Baggrund

KIAA0101 er en prolifererende celle nuklear antigen-associeret faktor, er overudtrykt i nogle humane maligniteter. Adrenokortikalt neoplasme er en af ​​de mest almindelige humane neoplasmer, for hvilke de molekylære årsager er dårligt forståede. Desuden er det vanskeligt at skelne mellem lokaliserede godartede og ondartede adrenocorticale tumorer. Af disse grunde, vi studerede udtrykket, funktion og mulig mekanisme af dysregulering af KIAA0101 i human binyrebark neoplasma.

Metode /vigtigste resultater

KIAA0101 mRNA og protein udtryk niveauer blev bestemt i 112 binyrebark væv prøver (21 normal adrenal cortex, 80 godartede adrenocorticale tumorer og 11 binyrebark carcinoma (ACC). SiRNA knockdown blev anvendt til at bestemme den funktionelle rolle af KIAA0101 på celleproliferation, cellecyklus, apoptose, blød agar forankringsuafhængig vækst og invasion i ACC . cellelinje, NCI-H295R Derudover undersøgte vi den mekanisme af KIAA0101 dysregulering ved at undersøge mutationsstatus KIAA0101-mRNA (9,7 gange) og proteinekspression var signifikant højere i ACC (p 0,0001).. KIAA0101 havde sparse proteinekspression i kun et par normale adrenal cortex prøver, som blev begrænset til adrenokortikale stamceller. KIAA0101 ekspressionsniveauerne var 84% nøjagtige til at skelne mellem ACC og normale og godartede adrenocorticale tumorprøver. Knockdown af KIAA0101 genekspression faldt betydeligt forankringsuafhængig vækst med 80% og invasion med 60% (p = 0,001; p = 0,006). Vi fandt ingen mutationer i KIAA0101 i ACC.

Konklusioner /Betydning

KIAA0101 er overudtrykt i ACC. Vores data understøtter, at KIAA0101 er en markør for celleproliferation, fremmer vækst og invasion, og er en god diagnostisk markør til at skelne benigne fra maligne binyrebark neoplasme

Henvisning:. Jain M, Zhang L, Patterson EE, Kebebew E (2011) KIAA0101 er overudtrykt, og fremmer vækst og invasion i adrenal kræft. PLoS ONE 6 (11): e26866. doi: 10,1371 /journal.pone.0026866

Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA

Modtaget: 10 juni, 2011; Accepteret: 5 oktober 2011; Udgivet: 11. november 2011

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Adrenal neoplasmer er en af ​​de mest almindelige menneskelige neoplasmer, ofte opdages øvrigt [1]. De fleste adrenale neoplasmer er godartede, men det er ofte vanskeligt at udelukke en ondartet tumor, såsom adrenocortical carcinoma. Binyrebark carcinoma (ACC) er en sjælden malignitet af binyrebarken med en dårligt forstået mekanisme af udvikling, og en trist patientresultatet grund af en mangel på effektiv terapi [2]. Den årlige forekomst af ACC er ca. 1-2 tilfælde pr million [3], [4], [5]. Komplet kirurgisk resektion er den eneste mulige helbredende behandling, men over to tredjedele af patienter til stede med metastatisk sygdom og selv de patienter, der har fuldstændig resektion udvikle tilbagevendende sygdom i over 50% af tilfældene [2], [6]. Patienter med metastatisk sygdom har en fem-års overlevelse på mindre end 10%, og dem med tilbagevendende sygdom har en overlevelse fem år på kun 50% [2], [6].

ACC kan være forbundet med arvelige cancer syndromer såsom Beckwith-Wiedemann syndrom (forbundet med kimcellelinje 11p15 kromosomale ændringer, der fører til

IGF2

overekspression, OMIM # 130.650), Li-Fraumeni syndrom (

TP53

mutation, OMIM # 151.623) , multipel endokrin neoplasi type 1 (mutationer i Menin tumorsuppressorgen, OMIM # 131.100), og Gardner syndrom (

APC

mutation, OMIM # 175.100). De genetiske ændringer i forbindelse med arvelige kræft syndromer har givet vigtige oplysninger om de mulige molekylære mekanismer involveret i ACC. Men de fleste tilfælde af ACC er sporadiske, og de molekylære begivenheder, der fører til indvielse og progression af adrenocorticale tumorer fortsat uklare.

Genom-dækkende genekspression profilering giver vigtig indsigt i de molekylære veje, der er dysreguleret i kræft og kan være involveret i tumor initiering og progression. Da den molekylære mekanisme af adrenokortikal carcinogenese er dårligt forstået, har cDNA microarray analyse af adrenocorticale tumorer blevet anvendt til at afsløre gener, hvis misexpression er associeret med ACC [7], [8], [9], [10], [11]. Blandt de gener, der blev anset for at være opreguleret i ACC, KIAA0101 (også kendt som L5, PAF, OEATC1; NS5ATP9, OEATC-1, p15) er en ny potentiel diagnostisk og prognostisk markør, og målet for ACC terapi. KIAA0101 koder for et prolifererende cellekerneantigen (PCNA) associeret faktor med en ukendt funktion. KIAA0101 er overudtrykt i humane maligniteter såsom hepatocellulært og pancreas carcinom [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21 ], [22]. Men den rolle KIAA0101 i kræft og mekanismen fører til dysreguleret udtryk for KIAA0101 er uklar.

I denne undersøgelse har vi behandlet disse spørgsmål og viste, at KIAA0101 er overudtrykt i ACC og en markør for celleproliferation. Desuden reducerer KIAA0101 udtryk i ACC resulterede i vækst undertrykkelse og invasion tyder på, at KIAA0101 spiller en onkogen rolle i ACC.

Metoder

Vævsprøver

The National Cancer Institute Review Board godkendt denne forsøgsprotokol efter informeret skriftligt samtykke blev opnået fra alle deltagere. Adrenal væv blev lynfrosset på tidspunktet for kirurgi og opbevaret ved -80 ° C. I denne undersøgelse blev 112 humane adrenocorticale vævsprøver analyseret herunder 21 normale adrenocorticale væv, 80 godartede adrenocorticale tumorer og 11 primære adrenokortikale carcinomer (78 af de godartede adrenocorticale tumorer og 11 af de primære adrenokortikale carcinomer blev tidligere analyseret) [11]. En uafhængig sæt ACC metastaser (n = 29) og gentagelser (n = 2) blev også anvendt til validering. Diagnosen entydig ACC og godartet binyrebark tumor blev bekræftet i alle tilfælde ved histologisk undersøgelse og klinisk opfølgning. Den gennemsnitlige opfølgningstid var 26,3 måneder for patienter med benigne adrenocortikale tumorer og 44,4 måneder for patienter med ACC.

Cell kultur

NCI-H295R ACC cellelinje (ATCC, Rockville, MD ) blev dyrket og opretholdt i DMEM suppleret med 1% ITS + Premix (BD Biosciences, San Jose, CA), 2,5% Nu-Serum i (BD Biosciences), og 10.000 U /ml penicillin /streptomycin i en standard befugtet inkubator ved 37 ° C i en CO 5%

2 atmosfære. Fireogtyve timer efter celler blev podet i 24 og 6 brønds plader (4 × 10

^ 4 celler i 0,5 ml og 1,6 × 10

^ 5-celler i 2 ml), blev celler transficeret med en ikke-specifik negativ kontrol siRNA og med en KIAA0101 specifik siRNA i en endelig koncentration på 40 og 80 nM (AM4636 og AM46235 henholdsvis Applied Biosystems, Foster City, CA). Transit siQuest reagens (Mirus Bio, LLC) blev anvendt til at levere siRNA til cellerne i henhold til producentens anvisninger. Den knockdown effektivitet var ens for 40 og 80 nM. Alle in vitro-assays blev udført med både 40 og 80 nM koncentration af KIAA0101 specifikke siRNA’er og ikke-specifik negativ kontrol.

RNA og proteinpræparat

RNA blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens efter producentens anvisninger ( Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). RNA mængde og kvalitet blev vurderet ved anvendelse af NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fischer) og Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), henholdsvis.

RIPA puffer blev anvendt til fremstilling væv lysater og helcellelysat blev fremstillet med 1% SDS plus 10 mM Tris [pH 7,5] puffer. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved anvendelse af BioRad RC DC-proteinassay (Hercules, CA).

Real time kvantitativ revers-transkription-polymerase-kædereaktion (RT-PCR)

Totalt RNA (125 ng) blev revers transkriberet under anvendelse af RT script cDNA syntesekit (USB Corporation, Cleveland, OH). Real time kvantitativ PCR blev anvendt til måling mRNA ekspressionsniveauer i forhold til glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) mRNA-ekspression. Normaliseret genekspression niveau = 2

– (Ct

af gen af ​​interesse – Ct

af GAPDH) × 100%, hvor C

t er PCR cyklus tærskel. PCR primerne og prober for KIAA0101 (Hs00207134_m1) og GAPDH (Hs99999905_m1) blev opnået fra Applied Biosystems (Assay-on-Demand kit®, Foster City, CA). Alle PCR-reaktioner blev udført i et slutvolumen på 20 pi med 1 pi cDNA skabelon på en ABI PRISM®7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). PCR thermal cycler tilstand var 95 ° C i 12 minutter efterfulgt af 40 cykler af 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minut. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt og gentaget tre gange.

Western blot-analyse

Proteinprøver (40 ug) blev separeret i 4% til 20% SDS-PAGE-gel og overført til en nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Western blotting udførtes ifølge standardprocedurer under anvendelse primære muse monoklonale antistoffer, anti-KIAA0101 (Abcam; ab56773) ved 1:100 fortynding og anti-β-actin (SC-81.178, Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA) ved 1: 2.000 fortynding. Signalpåvisning blev udført under anvendelse HRP konjugeret sekundært antistof og et forøget kemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotech).

immunhistokemisk (IHC) og Immuunofluoroscence farvning

tumorvæv blev fikseret i formalin, indlejret i paraffin, og 5 mikron tykke sektioner blev skåret til immunfarvning. Snit blev inkuberet med det primære anti-KIAA0101 monoklonalt muse antistof ved 1:300 fortynding natten over ved 4 ° C (Abcam; ab56773) efterfulgt af biotinyleret sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur (1:150; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Sektioner blev udviklet ved anvendelse 3,3′-diaminobenzidin DAB som kromogenet (ABC elite kit, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) og hematoxylin som kontrastfarve. Snittene blev rehydreret og monteret med vectamount monteringsmedium (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Glassene blev scannet under Olympus lysmikroskop (Nikon, Tokyo, Japan) og billeder blev taget ved 20X og 40X forstørrelser. En semikvantitativ pointsystem blev anvendt til at analysere KIAA0101 ekspression; ekspressionsniveau blev klassificeret som ingen farvning (0), 30% af cellerne farvning (1), 30-50% celler (2) og 50% af cellerne. To observatører, der var blindet til svulsten typen, uafhængigt scoret hver prøve. Scorerne blev beregnet til at opnå den endelige KIAA0101 udtrykket score

Immuunofluoroscence farvning blev udført under anvendelse primære anti-KIAA0101mouse monoklonalt antistof ved 1:300 fortynding natten over. (Abcam; ab 56.773) og kanin-anti-SF-1 (Millipore ; 07-618, 2 ug /ml) ved 4 ° C. De primære antistoffer blev påvist med fluorofor konjugeret med RedTX anti-kanin IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA) og FITC anti-muse IgG sekundære antistoffer (Vector Laboratories). Objektglassene blev derefter skyllet og monteret med DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindol) monterings opløsning. Billeder blev analyseret med et Zeiss Axioskop-2 mikroskop ved 20X og 40X forstørrelse.

DNA Purification

Genomisk DNA blev isoleret fra 1 mg tumor og normale prøver under anvendelse af QIAamp DNA Blood Mini Kit ( Qiagen, Hilden, Tyskland), elueres i et samlet volumen på 200 pi og opbevaret ved -20 ° C. DNA-koncentrationer blev målt ved UV-absorbans hjælp NanoDrop (NanoDrop Technologies, Inc., Thermo Fischer).

Sequencing KIAA0101 kodende region

KIAA0101 exon 1, 2, 3 og 4 blev sekventeret. PCR-primere blev udformet til kodende område ved anvendelse UCSC genom browser, Primer 3 integreret software. Primersekvenserne er anført i tabel 1. Primere blev foretaget af IDT, Inc. (Coralville, IA). Exon 1, 2, 3 og 4 blev amplificeret som tre separate reaktioner i 50 pi anvendelse af PCR Master Mix (Fermentas Inc. USA). Standard PCR-betingelserne var indledende denaturering ved 95 ° C i 5 minutter efterfulgt af 30 cykler af denaturering ved 95 ° C i 5 min, annealing ved 50 ° C i 1 min, forlængelse ved 72 ° C i 1 min og endelig forlængelse ved 72 ° C i 10 minutter. PCR-produkter blev visualiseret på 2% agarosegel. Produkterne blev oprenset under anvendelse af standard Exo-nuklease I og FastAP (Fermentas Inc.). Oprensede PCR-produkter blev sekventeret under anvendelse ABI sequencer 3730xl med store farvestof metode (DNA Sequencing Kit, store farvestof terminator cyklus sekventering; Applied Biosystems). Mutationer blev analyseret af Mutation Surveyor V 3.3 Program (Soft Genetics, www.softgenetics.com). Alle de sekventering data er blevet deponeret i GenBank.

Celleproliferation

Celler blev podet i en 96-brønds plade ved en koncentration på 5 × 10

^ 3 celler pr 100 pi kulturmedium i seks replikater. Ved hvert tidspunkt blev mediet aspireret fra brønden, og cellerne blev straks frosset ved -80 ° C i 24 timer. Pladerne blev optøet ved stuetemperatur, og forberedt til celleantal kvantificering under anvendelse af CyQUANT ™ assay-kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Den CyQuant assay blev udført ifølge producentens anvisninger, og analyseret på en fluorometrisk mikropladelæser (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) ved 480 nm /520 nm.

Flowcytometri og apoptose analyser

KIAA0101 og negativ kontrol siRNA behandlede celler blev høstet, ethanol-fikseret natten over ved 4 ° C og resuspenderet i 1 x PBS til en koncentration på 1 x 10

^ 6 celler /ml. Celler blev behandlet med DNase-frit RNase (100 ug /ml) i 20 minutter ved 37 ° C. Cellerne blev farvet med propidiumiodid ved en koncentration på 50 ug /ml, og prøver blev opbevaret ved 4 ° C. Flowcytometrisk analyse blev udført på et Becton Dickinson FACScan (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Datafiler blev genereret for 20.000 hændelser (celler) ved hjælp af CellQuest software. Den del af den totale cellepopulation til stede i hver af G1, S og G2 /M cellecyklusfaser blev opnået fra ModFit LT software (Verity Software House, Inc.). Apoptose analyse blev udført ved hjælp af Annexin V-farvning (ApoAlert® Annexin V Apoptose Kit) i henhold til producentens anvisninger (Clontech, Mountain View, CA).

Soft agar forankring uafhængig vækst assay

To- lagdelte blød agar-assays blev udført i seks-brønds plader. Det nederste lag af agar (2 ml /brønd) indeholdt 0,5% agar (Difco Noble Agar, Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD) i vedligeholdelsesmedium. Fem dage efter siRNA transfektion blev cellerne trypsiniseret, talt, og 50.000 celler blev blandet med 1,3 ml topagar opløsning suppleret med 10% Nu-serum (0,3% agar i dyrkningsmedier). Størknede agar blev overlagt med 1 ml dyrkningsmedier indeholdende 10% Nu-serum. Pladerne blev dyrket ved 37 ° C i 5% CO

2, og medierne blev udskiftet to gange om ugen. Efter 16 dages dyrkning, blev cellekolonier farvet med 0,2% krystalviolet opløsning og undersøgt ved mikroskopi. Kolonier blev talt i 5 forskellige felter pr godt og bekræftet af TotalLab Quant v11 software (https://www.totallab.com/).

Cell invasion assay

Omfanget af celle invasion var vurderet ved hjælp af BD BioCoat ™ Matrigel ™ invasion Chamber (BD Biosciences, Bedford, MA) ifølge fabrikantens protokol. I alt 1 × 10

^ 5-celler podedes på indsatsene (8-uM pore size polycarbonatmembran) belagt med et tyndt lag af Matrigel basalmembranmatrix (BD Biosciences). Indsatsene blev anbragt i en 24-brønds plade med 10% serumholdigt dyrkningsmedium eller medie uden serum. Pladerne blev inkuberet i 48 timer ved 37 ° C. Celler, som invaderede Matrigel matrix til den nedre overflade af membranen blev fikseret og farvet med Diff Quik Stain (Dade Behring, Newark, DE, USA) og talt under et lysmikroskop. Fire felter i fire separate kvadranter af hver membran blev talt og gennemsnit.

Statistiske Analyser

Den kontinuerlige data blev repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (standardafvigelse). To-halet ANOVA multi-sammenligning

t

-test blev anvendt til at vurdere forskellen mellem middelværdien ekspression blandt normale, benigne og maligne prøver. Pearson korrelation testen blev anvendt til løbende data. En

s

-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant. Analysen blev udført af Stat View 5.0 (Cary, NC) og SPSS v 16,0 (Chicago, IL) statistiske software.

Resultater

KIAA0101 mRNA og protein er højt udtrykt i binyrebark neoplasme

ekspressionen af ​​KIAA0101-mRNA var signifikant højere i ACC sammenlignet med normal adrenocortical væv og benigne adrenocorticale tumorer (12 gange højere end normalt, og 9 gange højere end i benigne tumorer, p 0,0001) (figur 1A). Desuden KIAA0101 mRNA-ekspression var lavere i metastatiske og tilbagevendende tumorer sammenlignet med primær ACC (p 0,001)

A) KIAA0101-mRNA-ekspression i normale binyrebarken (n = 21), benigne adrenocorticale tumorer (N = 80), ACC (N = 10), metastatisk og tilbagevendende ACC (n = 30) og NCI-H295R cellelinie. KIAA0101-mRNA-ekspression niveau blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR og normaliseret til GAPDH mRNA-ekspression. Kolonner repræsenterer middelværdier ± standardafvigelse replikater bestemmelser. Statistisk signifikant forskel er angivet med en asterisk (*) (p 0,05, Kruskal Wallis test). Primær ACC vs normal (p 0,0001), primære ACC vs godartede adrenocortikale tumorer (p 0,0001) og primær ACC vs. metastaser (p 0,0001). B) ROC-kurve analyse for KIAA0101-mRNA-ekspression. Modtageren opererer karakteristik (ROC) er afbildet på grafen anvendelse af RT-PCR udtryk data af KIAA0101 normaliseret til GAPDH ved normal adrenal cortex (n = 21), benigne adrenocorticale tumorer (n = 80), ACC (n = 10). Arealet under kurven (AUC) var 0,78. En perfekt diagnostisk markør uden falsk-negativer eller falsk-positive ville have en AUC på 1. C) KIAA0101 proteinekspression i ACC. KIAA0101-protein ekspressionsniveauer i normale binyrebarken (n = 5), godartede (n = 13), og maligne adrenocorticale tumorer (n = 3) som vist i det repræsentative Western blot med KIAA0101 specifikke og p-actin kontrol antistoffer. p-actin signal blev anvendt som en kontrol for protein loading. C = ACC, B = godartet adrenocortical tumor, og N = normal adrenal cortex. D) Scatter plot af KIAA0101-mRNA og proteinekspression niveau i normale, benigne og maligne adrenocorticale vævsprøver. Y-aksen viser normaliserede mRNA-ekspression ved kvantitativ RT-PCR og X-aksen viser protein ekspressionsniveau i den samme prøve baseret på band densitometri måling normaliseres til p actin ekspressionsniveau. Spearmen korrelationskoefficient (r) = 0,61, p 0,001. E) Immunhistokemi for KIAA0101 proteinekspression i normalt adrenocortical væv, godartede svulster og ACC. Repræsentative billeder vises for hver kategori på 20X forstørrelse. Pilen angiver positive nukleare farvning for KIAA0101. I normale vævsprøver, kun subcupsular regionen var positiv. F) KIAA0101 cellulære lokalisering blev analyseret ved immunoflouroscence. Kerner blev farvet med DAPI (blå), rød farve indikerer KIAA0101 ekspression. Repræsentative billeder fra ondartet ACC og normale prøver er vist ved 20X forstørrelse.

I betragtning af den betydelige udtryk forskel i mRNA mellem godartede og ondartede tumorer, vi var interesserede i at vurdere, om KIAA0101 var en nøjagtig diagnose indikator for tumor type. KIAA0101 udtryk var 84% nøjagtige til at skelne mellem ACC og normale og godartede adrenocorticale tumorprøver (antal sande positive og negative resultater divideret med det samlede antal stikprøver ved hjælp af en cutoff niveau på 1,5). Arealet under modtageren operatøren karakteristik (ROC) kurven (AUC) var 0,78 for KIAA0101-mRNA-ekspression (figur 1B), 0,79 til tumorstørrelse og 0,85 for kombination af KIAA0101 ekspression og tumorstørrelse.

Udover høj-mRNA-ekspression, KIAA0101-protein-ekspression blev også forhøjet i ACC sammenlignet med normal adrenal cortex og benigne adrenocorticale tumorprøver. På Western blot, fandt vi højere ekspression i ACC (n = 3) end benigne adrenocorticale tumorer (n = 13), og som under normale adrenal cortex prøver (n = 5) (fig 1C). Der var god korrelation mellem KIAA0101-mRNA og protein-ekspressionsniveauer (figur 1D, r = 0,61, p 0,001). For yderligere at vurdere KIAA0101 ekspression, udførte vi semikvantitativ analyse af et væv array med mindre dele af benigne og maligne tumorer ved immunhistokemi for KIAA0101-protein. Denne analyse fandt ingen signifikant forskel i KIAA0101 proteinekspression mellem benigne og maligne tumorer (p = 0,31). Dette er ikke overraskende, da immunhistokemi er en semikvantitativ metode og kan ikke registrere mindre forskelle i proteinekspression. Men når KIAA0101 proteinekspression blev evalueret i individuelle benigne og maligne prøver på arrayet, blev signifikant overekspression observeret sammenlignet med normale prøver (figur 1E). KIAA0101-protein var til stede i cytoplasmaet og kernen, hvilket også blev bekræftet ved immunofluorescens (figur 1F).

Vi observerede kun sparsomme KIAA0101 farvning i et par normale adrenal cortex prøver, der var begrænset til subkapsulær cortex region ( Figur 2A). At afgøre, om dette fokusområde positiv for KIAA0101 repræsenterede adrenale stamceller, vi co-farvet de samme normale adrenal cortex prøver med steroidogene faktor 1 (SF-1) antistof, en markør for adrenale stamceller [23]. Interessant nok viste normale binyrebark prøver co-farvning af KIAA0101 og SF-1 sammen i subkapsulær eller stamfader region af binyrebarken (figur 2B).

A) Immunhistokemi farvning af normale binyrebarken til SF-1 og KIAA0101. I det første panel, er de zoner af binyrebarken angivet ved 10X, 1: Zona glomerulosa indeholdende progenitorceller, 2: Zona fasciculata, 3: Zona reticularis. Anden og tredje panel angiver SF-1 (20X med 40X indsat) og KIAA0101 positiv immunfarvning i Zona glomerulosa ved 20X forstørrelse. Røde pile viser de positive områder for SF-1 og KIAA0101-farvning. B) Immunofluoroscence for SF-1 og KIAA0101 i den normale binyrebarken. Kerner blev farvet af DAPI (blå), rød farve indikerer KIAA0101 udtryk og grøn farve indikerer SF-1-ekspression. Flettede Billeder (gul farve) ved 40X viser en lokalisering af de to proteiner, SF-1 og KIAA0101 i stamceller med normal binyrebarken.

Mekanisme KIAA0101 overekspression i ACC

Til afgøre, om KIAA0101 overekspression var en konsekvens af gen sekvensvariationer, udførte vi mutationsanalyse i KIAA0101. Vi fandt en de

novo

G En overgang mutation i stilling 186, som falder i ikke-kodende region af KIAA0101 i en godartet prøve. Vi observerede også en polymorfisme i 5 ‘UTR i exon 1-2 (88T C). Ca. 6,6% af godartet var heterozygote og 12,5% i den normale men ingen i maligne prøver (tabel 2). På baggrund af disse resultater er det usandsynligt, at KIAA0101 overekspression er et resultat af mutation.

Den funktionelle effekt af knockdown af KIAA0101 gen i en ACC cellelinje

I betragtning af den betydelige overekspression af KIAA0101 i ACC (figur 1) og den observation, at KIAA0101 ekspression er begrænset til prolifererende adrenale progentitor celler (figur 2B), vi den hypotese, at KIAA0101 spiller en rolle i adrenocortical cellevækst. For at løse dette, vi brugte siRNA til Knockdown KIAA0101 udtryk i ACC-cellelinje, NCI-H295R. Transient transfektion af KIAA0101 specifik siRNA resulterede i en 10-fold knockdown inden for 24 timer, og denne virkning blev opretholdt i op til 6 dage ved mRNA’et og 80% reduceret på proteinniveauer sammenlignet med en ikke målretning siRNA (negativ kontrol siRNA) ( figur 3). KIAA0101 knockdown resulterede i beskeden stigning i cellulær proliferation med en stigning i celleantal på op til 25% (p = 0,005) (figur 4A). Også cellelinien fordoblingstid og vækstrate var forskellige for siRNA knockdown sammenlignet med den negative kontrol (gennemsnitlig fordoblingstid på 4,7 og vækstrate på 0,14 sammenlignet med gennemsnittet fordoblingstid på 3,5 og vækstrate på 0,19 fra dag 1 til 5 , henholdsvis). Cellecyklusanalyse afslørede en beskeden stigning i antallet af celler i G1-fasen (p = 0,013) (figur 4B). I betragtning af disse modstridende resultater, vi også vurderet mRNA udtryk for G1 cellecyklus regulerende proteiner på G1 fasen efter KIAA0101 knockdown. KIAA0101 knockdown ændrede ikke signifikant mRNA ekspressionen af ​​p21 og cyclin D1, cellecyklus regulerende proteiner, i en ACC cellelinje. Desuden KIAA0101-gen knockdown havde ingen signifikant virkning på antallet af celler i apoptose (data ikke vist).

A) H295R celler blev transficeret med KIAA0101 siRNA og negativ kontrol og analyseret for KIAA0101-mRNA-ekspression efter 48 timer behandling. Søjler angiver KIAA0101 mRNA-ekspression procentdel i forhold til negativ kontrol ± standardafvigelse for fire eksperimenter. B) repræsentant Western-blot der viser protein ekspression af KIAA0101 efter 6 dages siRNA og negativ kontrol. C) Relativ intensitet western blot med billede J Software. Kolonner angiver forholdet mellem KIAA0101 og GAPDH intensitet målinger. NC40 = Negativ kontrol ved 40 nM; SI40 = siRNA ved 40 nM; NC80 = Negativ kontrol ved 80 nM; SI80 = siRNA på 80 nM.

A) Antallet af celler for KIAA0101 siRNA behandlede og negativ kontrol behandlede grupper er vist ved angivne tidspunkter (signifikante værdier er angivet med stjerne (*) (p = 0,005;. i forhold til negativ kontrol) fejl søjler repræsenterer ± standardafvigelse af middelværdi og er repræsentativ for fire eksperimenter NC80 = negativ kontrol ved 80 nM;. SI80 = siRNA på 80 nM B) KIAA0101 gen knockdown og cellecyklus-analyse er angivet. på forskellige tidspunkter. Repræsentant billede af cellecyklus profil fra siRNA og negative kontrol behandlingsgrupper. C) Hver søjle angiver fordelingen af ​​G0 /G1 population af celler i hver gruppe på forskellige tidspunkter. Fejl søjler repræsenterer ± standardafvigelse af middelværdi og er repræsentativ for fire eksperimenter * Dag 3 og 5, s. 0,05; i forhold til negativ kontrol.

I betragtning af de paradoksale virkninger, en beskeden stigning i cellulær proliferation og G1 anholdelse, vi brugte yderligere funktionelle assays til bedre at forstå de fænotypiske ændringer i forbindelse med KIAA0101 knockdown. Specifikt tumorogenicity og metastatiske potentiale blev evalueret. KIAA0101 knockdown i NCI-H295R celler reduceret antallet af kolonier, der var i stand til at vokse i blød agar med næsten 80% (p = 0,001) ved 16 dages dyrkning (figur 5A og 5B) med en 60% nedsættelse i celleinvasion i NCI-H295R cellelinje (p = 0,006) (figur 5C og 5D).

A) Celler dyrket i 15 dage i nærvær af angivne koncentrationer af siRNA og negativ kontrol. Repræsentative billeder vises på 12X og 40X forstørrelser. B) fordelingen og antallet af kolonier i gruppen behandlet med KIAA0101 siRNA og negativ kontrolgruppe på 80 nM (p = 0,001; i forhold til negativ kontrol; NC80 = Negativ kontrol ved 80 nM; SI80 = siRNA ved 80 nM). Fejl- søjler repræsenterer ± standardfejl på middelværdi og repræsenterer fire eksperimenter. C) indtrængende celler blev farvet med 0,2% krystalviolet og visualiseret ved mikroskopi. Repræsentative billeder ved 20X følgende invasion assay. D) Fordelingen af ​​antallet af celler i KIAA0101 siRNA og negativ kontrolgruppe. Kolonner repræsenterer middelværdi ± standardafvigelse (SD) af tre uafhængige forsøg udført in triplo. * P 0,05 KIAA0101 siRNA vs. negativ kontrol. H295R celler blev transficeret med negativ kontrol eller KIAA0101 siRNA på 80 nM i 120 h, efterfulgt af en invasion assay i 48 timer.

Diskussion

I denne undersøgelse undersøgte vi KIAA0101 udtryk og funktion i ACC. Vores resultater viser, at KIAA0101 overudtrykkes i ACC, er en god diagnostisk markør for ACC, og er en markør for cellulær proliferation. Undertrykkelse KIAA0101 udtryk i adrenocorticale carcinomceller resulterede i undertrykkelse af vækst og invasion, hvilket tyder på, at det spiller en vækstfremmende rolle i ACC.

Tidligere undersøgelser har vist, ændret udtryk for KIAA0101 i humane maligniteter og fraværende eller lav ekspression i normal væv [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22]. Men er opnået, modstridende resultater for KIAA0101 udtryk i hepatocellulært carcinom (HCC). I en undersøgelse blev KIAA0101 ekspression sig at være nedreguleret i HCC [13]. Omvendt i en separat undersøgelse, i en stor kohorte af patienter med HCC, KIAA0101 blev opreguleret [18]. Vores undersøgelse viste også den KIAA0101 overekspression i primær ACC, men interessant, KIAA0101 mRNA-ekspression var lavere i tumorer fra en kohorte af patienter med metastatisk og tilbagevendende ACC, der reagerede på systemisk kemoterapi og gennemgik resektion. Disse resultater antyder, KIAA0101 ekspression kan variere som følge af behandling og kunne muligvis anvendes som biomarkør for behandlingsrespons i ACC og andre kræftformer.

Selvom vi fundet, at KIAA0101 proteinekspression var højere i maligne og benigne tumorer i forhold til normale prøver, gjorde vi opdager KIAA0101 udtryk i en delmængde af normale prøver. Dets ekspression var begrænset til subcapular region binyrebarken og overlappede SF-1-positive farvning af celler. I denne region er SF-1-positive celler hypotese at være adrenal progenitorceller [24]. Progenitorceller besidder høj proliferativ kapacitet. KIAA0101 og SF-1 co-ekspression i stamfader region normal binyrebarken tyder på, at KIAA0101 kan være en markør for proliferation i adrenocorticale celler. I overensstemmelse med denne, en undersøgelse af Simpson et al., Har vist lokaliseringen af ​​KIAA0101 i basalcelle lag af huden og det proliferative zone i krypter i tyktarmen [15].

kun lidt om den funktion af KIAA0101-genet i tumor cellebiologi. Tidligere har undersøgelser antydet, at KIAA0101 er involveret i reguleringen af ​​DNA-replikation, cellecyklus, apoptose og cellulær proliferation [13], [14], [15], [18], [25], [26].