PLoS ONE: Den C-terminale region Mesd peptid Efterligner Full-Length Mesd og virker som hæmmer af Wnt /β-Catenin Signaling i Cancer Cells

Abstrakt

Mens Mesd blev opdaget som en specialiseret molekylær endoplasmatiske reticulum chaperone for Wnt coreceptorer LRP5 og LRP6, rekombinant Mesd protein er i stand til at binde til modne LRP5 og LRP6 på celleoverfladen og virker som en universel antagonist af LRP5 /6 modulatorer. I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at den C-terminale region af Mesd, som er fraværende i sekvenser fra hvirvelløse dyr, er nødvendig og tilstrækkelig for binding til modne LRP6 på celleoverfladen. I de foreliggende undersøgelser, vi yderligere kendetegnet interaktionen mellem den C-terminale region Mesd peptid og LRP5 /6. Vi fandt, at Mesd C-terminale region-afledte peptider blokere Mesd binding til LRP5 ved celleoverfladen også. Vi viste også, at der er to LRP5 /6 bindingssites inden Mesd C-terminale region, som indeholder flere positivt ladede rester. Desuden har vi påvist, at Mesd C-terminale region-peptid, som fuldlængde Mesd protein, blokerede Wnt 3a- og Rspodin1-induceret Wnt /β-catenin signalering i LRP5- og LRP6- udtrykkende celler, undertrykte Wnt /β-catenin signalering i humane bryst Hs578T celler og prostatakræft PC-3-celler og inhiberede cancercelleproliferation, selv om den fulde længde Mesd protein er mere potent end dets peptid. Endelig fandt vi, at behandling af fuldlængde Mesd protein og dets C-terminale region-peptid signifikant øget kemoterapimiddel Adriamycin-induceret cytotoksicitet i Hs578T og PC-3-celler. Sammen vore resultater antyder, at Mesd C-terminale region udgør den største LRP5 /6-bindende domæne, og at Mesd protein og dets C-terminale region-peptid har en potentiel terapeutisk værdi i cancer

Henvisning: Lin C. Lu W, Zhang W, Londoño-Joshi AI, Buchsbaum DJ, Bu G, et al. (2013) C-terminal Region Mesd peptid Efterligner Full-Length Mesd og virker som hæmmer af Wnt /β-Catenin Signaling i kræftceller. PLoS ONE 8 (2): e58102. doi: 10,1371 /journal.pone.0058102

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: 8. maj 2012; Accepteret: 3 Feb 2013; Publiceret: 28 feb 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra National Institutes of Health RO1CA124531 (til YL) og National Cancer Institute giver CA 13148 (til UAB Comprehensive Cancer center). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Yonghe Li og Guojun Bu er opført som opfindere på et patent for brugen af ​​Mesd i knoglesygdom og kræft, og Guojun Bu fungerer som konsulent for Raptor Pharmaceutical, som har licens til dette patent fra Washington University i St. Louis. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

lav densitet lipoprotein receptor-relateret protein-5 (LRP5) og LRP6 er to medlemmer af den ekspanderende lavdensitetslipoprotein receptor (LDLR) familie. De Frizzled (FZD) receptorer kan reagere på Wnt proteiner kun i nærværelse af den Wnt coreceptor LRP5 eller LRP6 at aktivere kanoniske β-catenin pathway. I fravær af Wnts, er β-catenin afsondret i et kompleks, der består af den adenomatøs polypose coli (APC) tumorsuppressor, Axin, glycogensyntasekinase-3β (GSK3p), og casein kinase 1 (CK1). Denne kompleksdannelse inducerer phosphorylering af β-catenin med CK1 og GSK3p, hvilket resulterer i ubiquitinering og efterfølgende nedbrydning af β-catenin med 26S proteasomet. Virkningen af ​​dette kompleks inhiberes ved binding af Wnt til dets celleoverfladereceptorer FZD og LRP. LRP-Wnt-FZD bindende resulterer i stabilisering af cytosolisk β-catenin, som derefter trænger ind i kernen til at danne et kompleks med transkriptionsfaktorer af T-celle-faktor /lymfoid øge faktor (TCF /LEF) familie at aktivere transkription af Wnt mål gener, der regulerer cellecyklus, vækst og progression [1] – [3].

LRP5 og LRP6 underkastes modulation af flere udskilte proteiner, som binder til de ekstracellulære β-propel EGF repeat /moduler af LRP5 /6 [3]. Wnt og Rspondin (RSPO) proteiner er to grupper af Wnt /β-catenin signalering agonister. Svarende til Wnt ligander, virkningen af ​​RSPO proteiner på Wnt /β-catenin signalering kræver Wnt receptorer FZD og LRP5 /6, selvom den direkte binding mellem RSPO og LRP5 /6 er kontroversiel [4] – [8]. Endvidere RSPO proteiner er i stand til at virke synergistisk med Wnt ligander til at aktivere Wnt /β-catenin signalering [5], [8], [9].

Mens Mesd blev opdaget som en specialiseret molekylær endoplasmatiske reticulum (ER) chaperone for Wnt coreceptorer LRP5 og LRP6 [10], [11], rekombinant Mesd protein er i stand til at binde til modne LRP5 og LRP6 på celleoverfladen, virker som en universel inhibitor af forskellige LRP5 /6 modulatorer, og undertrykker Wnt /β-catenin signalering i Wnt-afhængige cancerceller [8], [12] – [14]. I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at den C-terminale region af Mesd, som er fraværende i sekvenser fra hvirvelløse dyr, er nødvendig og tilstrækkelig for binding til modne LRP6 på celleoverfladen [12]. I de foreliggende undersøgelser, vi kendetegnet interaktionen mellem den C-terminale region Mesd peptid og LRP5 /6. Vi studerede også den rolle af C-terminale region Mesd peptid i Wnt /β-catenin signalering i kræftceller.

Materialer og metoder

Materialer

Plasmid pcDNA3.1C myc-hLRP5 indeholdende fuldlængde humant LRP5 cDNA og plasmid pcs-Myc-hLRP6 indeholdende fuldlængde humant LRP6 cDNA var fra Dr. Cindy Bartels (Case Western Reserve University, Cleveland) og Dr. Christof Niehrs (Deutsches Krebsforschungszentrum, Heidelberg, Tyskland), henholdsvis. Plasmid pGST-E-cadherin blev leveret af Dr. Gail Johnson (University of Rochester, New York). Plasmid pUSEamp-Wnt1-HA indeholdende fuldlængde muse Wnt1 cDNA blev anskaffet fra Upstate. Plasmid BA-Wnt10b indeholder fuld længde mus Wnt10b var fra Addgene. Den TOPFlash luciferase konstruktion var fra Upstate Biotechnology, og Super8XTOPFlash luciferase konstruktionen blev leveret af Dr. Randall T. Moon (University of Washington, Seattle). En β-galactosidase-udtrykkende vektor var fra Promega. Fremstilling af rekombinant muse Mesd protein og muse Mesd C-terminale region-peptid, mMesd (50-195), er blevet beskrevet før [12]. Alle andre mus Mesd peptider, human Mesd C-terminale region peptid hMesd (160-197) (KGGGSKEKNKTKQDKGKKKKEGDLKSRSSKEENRAGNK) og dens kontrol peptid (KEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPRASKEGDRKPR) blev fremstillet af EZBiolab. Rekombinant humant Rspo1 protein blev tilvejebragt af Dr. Kyung-Ah Kim (Nuvelo Inc., California). Adriamycin blev indkøbt fra Sigma. Anti-osteoprotegerin (OPG) antistof blev opnået fra R 0,01 sammenlignet med LRP6 eller LRP5 celler i fravær af Mesd og dets peptider

Der er to LRP5 /6 bindingssteder inden Mesd C-terminal omegn

for yderligere at karakterisere Mesd binding til LRP5 /6, vi forberedt 6 Mesd peptider baseret på musen Mesd C-terminale region sekvens (figur 1A), og udførte

125I-Mesd bindende assay med LRP6- og LRP5-udtrykkende celler i nærvær eller fravær af disse peptider. Mens mMesd (155-164) og mMesd (165-182) var ude af stand til at blokere Mesd proteinbinding til LRP5 eller LRP6 på celleoverfladen, mMesd (160-169) viste et tilsvarende niveau for hæmning som mMesd (155-173) ( Figur 1C). Desuden mMesd (183-191) også udviste en lignende grad af inhibering som mMesd (174-191) og mMesd (160-169) (figur 1C). Tilsammen indikerer disse resultater, at der er to LRP5 /6 bindingssites inden Mesd C-terminale region. Desuden er det interessant at bemærke, at mMesd (160-169) og mMesd (183-191) viste deres inhibitoriske evne på koncentrationen af ​​50 uM, hvilket er 100 gange af dem, der kræves for mMesd (155-191), hvilket antyder, at to LRP5 /6 bindingssteder inden Mesd C-terminale region samarbejder med hinanden for at skabe en høj affinitet bindende domæne til LRP5 /6.

Isolerede C-terminale peptider opretholde strukturelle karakteristika fuld længde Mesd

Vores resultater af bindingsanalyser er i overensstemmelse med nylige NMR undersøgelse af fuld længde Mesd [24], hvilket viser, at det C-terminale fleksibel spiralformet domæne (156-195) er strukturelt forskellige fra kernen domæne (1- 155), og er ansvarlig for escort funktion Mesd ved binding til LRP5 /6. Ikke desto mindre kan peptider har betydelige strukturelle ændringer, når isoleret fra proteiner. For yderligere at udforske de strukturelle indsigter, vi udførte molekylære simuleringer på alle tre peptider [mMesd (155-191), mMesd (160-169) og mMesd (183-191)] og sammenlignede dem med NMR-strukturen i fuld længde Mesd protein. Clustering analyse af simulation resultater viste, at alle tre peptider vedtaget relativ stabil kropsbygning. De mest befolkede konformationer af de tre peptider blev illustreret i figur 2C-2E. I stedet for den udvidede løkke-lignende form af C-terminale domæne i fuld længde Mesd (figur 2A), mMesd (155-191) kan foldes til en mere kompakt struktur med både dens C- og N-terminale ender bøjning mod midten ( Figur 2B). Trods for den tilsyneladende strukturelle forskelle, begge strukturer opretholdt en positiv overflade bestod af positivt ladede rester med deres sidekæder finde på den samme side og fuldt eksponeret for opløsningsmiddel (figur 2A og 2B). En sådan positiv overflade er afgørende for Mesd s binde kapacitet til at modne LRP5 /6. Interessant nok kan denne positive overfladen rumligt delt i to regioner, der hovedsagelig består af de positivt ladede rester fra mMesd (160-169) og mMesd (183-190), (figur 2a og 2b). Simulation resultater viser, at ~45% og ~58% af alle simulation snapshots af mMesd (160-169) og Mesd (182-190), henholdsvis vedtaget lignende konformationer som deres tilsvarende dem i fuld længde Mesd struktur (figur 2D og 2E). De samme strukturelle karakteristika og positiv overfladeladning forklarer, at de to kortere peptider vise en lignende funktion ved binding til LRP5 /6.

(A) NMR-struktur af muse Mesd C-terminale domæne (155-191) baseret på studiet af Chen et al. (24). (B) Den mest repræsentative øjebliksbillede af peptidet mMesd (155-191). Segmenterne af 160-169 og 183-191 blev fremhævet i appelsin og grønne farver. Rester, der danner den positive overflade blev vist med fuldt optrukne pinde. De to overflade regioner, der består af rester 160-169 segment eller fra 183-191segment blev markeret med blå og røde stiplede cirkler. Rester, der er unikke i den positive overflade A) eller B) blev mærket med rød farve. (C-E) De mest befolkede konformationer baseret på klyngedannelse analyse af simulation snapshots af tre C-terminale peptider mMesd (155-191) (C), mMesd (160-169) (D) og mMesd (183-191) ( E).

Den Mesd C-terminale region peptid blokerer Wnt /β-catenin signalering induceret af Wnt3a og Rspo1 i LRP5- eller LRP6 udtrykker HEK293 celler

Wnt3a er en af de 19 vertebrate medlemmer af Wnt familien. Der er fire medlemmer i RSPO familien. Både Wnt3a og Rspo1 kan aktivere Wnt /β-catenin signalering gennem LRP5 eller LRP6 [5], [8], [9]. Derfor udførte vi Wnt /β-catenin signalering reporter assay for at teste, om Mesd C-terminale region peptidefterligninger Mesd protein til at fungere som en inhibitor af Wnt /β-catenin signalering induceret af Wnt3a og Rspo1 i LRP5- eller LRP6-udtrykkende celler . HEK293-celler blev transient transficeret med LRP5 eller LRP6 sammen med Wnt /β-catenin signalering reporter TOPFLash og behandlet med Wnt3a CM eller Rspo1 protein i nærvær eller fravær af muse Mesd protein eller dets C-terminale område peptid mMesd (155-191) . Som forventet blev TOPFlash aktivitet stærkt forøget efter HEK293 celler blev forbigående transficeret med LRP5 eller LRP6 og behandles med Wnt3a eller Rspo1 (figur 3). Vigtigt er det, blev den øgede TOPFlash aktivitet induceret af LRP5, LRP6, LRP5 plus Wnt3a, LRP6 plus Wnt3a, LRP5 plus Rspo1 eller LRP6 plus Rspo1 blokeret ikke kun af Mesd protein, men også ved sin peptid mMesd (155-191) på en dosisafhængig måde (figur 3).

HEK293 celler i plader med 24 brønde blev transient transficeret med LRP5 plasmid (A), den LRP6 plasmid (B) eller den tilsvarende kontrol vektor, sammen med TOPFlash luciferase-konstruktion og β-galactosidase-udtrykkende vektor i hver brønd. Efter 24 timers inkubation blev celler behandlet med Wnt3a CM (5%), Rspo1 (40 ng /ml), muse Mesd (mMesd) (2 uM) eller muse Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191) på angivne koncentrationer. Luciferaseaktiviteten blev derefter målt 24 timer senere med normalisering til aktiviteten af ​​β-galactosidase. Værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med s.d. indikeret ved fejlsøjler. * P 0,05, ** P 0,01 sammenlignet med kontrol celler uden Mesd og dens peptid behandling

Den Mesd C-terminale region peptid blokerer LRP6 phosphorylering og OPG expressioninduced af Wnt3a og Rspo1 i C2C12. celler

C2C12 celler er uudnyttede muse mesenchymale progenitorceller, der kan differentieres til osteoblaster ved aktivering af Wnt /β-catenin signalering [9], [25], [26]. Vi beskæftigede C2C12 celler til yderligere at undersøge effekten af ​​Mesd peptid på Wnt3a-induceret Wnt /β-catenin signalering. LRP6 phosphorylering er kritisk for Wnt /β-catenin signalering induceret af Wnt proteiner [3], og OPG er en direkte målgen af ​​Wnt /β-catenin signalering i osteoblaster [27], [28]. Vi fandt, at muse Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191), som Mesd protein, var i stand til at undertrykke Wnt3a-induceret endogene LRP6 phosphorylering og OPG-ekspression i C2C12-celler (figur 4A og 4B).

(A) C2C12 celler i 6-brønds plader blev behandlet med Wnt3a CM (5%) i fravær eller nærvær af muse Mesd (mMesd) (0,5 uM) eller muse Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191) på angivne koncentrationer i 6 timer. Niveauet af phosphoryleret LRP6 blev analyseret. (B) C2C12-celler i plader med 6 brønde blev inkuberet med Wnt3a CM (5%) i nærvær eller fravær af mMesd (0,5 uM) eller mMesd (155-191) i de angivne koncentrationer i 48 timer. Niveauerne af totalt cellulært OPG blev analyseret ved Western blotting. (C) C2C12 celler i plader med 6 brønde blev inkuberet med Rspo1 (20 ng /ml) og /eller Wnt3a CM (2%) i fravær eller nærvær af mMesd (0,5 uM) eller mMesd (155-191) (2 um ) i 48 timer. Niveauerne af totalt cellulært OPG blev analyseret ved Western blotting. Alle prøverne blev også probet med anti-actin-antistof til at kontrollere lig belastning.

Rspo1 kan synergistisk med Wnt3a i inducere OPG-ekspression i C2C12-celler, selv om Rspo1 selv har en mindre indvirkning [9] . Vi fandt, at muse Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191), svarende til Mesd protein, undertrykt OPG-ekspression induceret af Rspo1 plus Wnt3a i C2C12-celler (figur 4C).

The Mesd C-terminale område peptid dæmper Wnt /β-catenin signalering i prostatacancer PC-3-celler og brystkræft Hs578T celler

mere tyder, at Wnt coreceptor LRP6 spiller en kritisk rolle i Wnt /β-catenin signalering aktivering i human prostata og brystkræft celler og er vigtig i udviklingen og progressionen af ​​disse to typer af kræft [8], [13], [14], [29] – [33]. For at teste, om Mesd C-terminale område peptidet er i stand til at undertrykke Wnt /β-catenin signalering i human prostata og brystcancerceller fremstillede vi et humant Mesd C-terminale område peptid hMesd (160-197), som er svarende til muse Mesd C-terminale område peptid mMesd (155-191). Vi forberedt også en negativ kontrol peptid baseret på sekvensen af ​​mMesd (155-164). Svarende til mMesd (155-191), hMesd (160-197), der vises hæmmende effekt på Wnt /β-catenin signalering induceret af LRP6, Wnt3a, Rspo1, Wnt1 og Wnt10b (figur S1 og S2). Vi fandt, at hMesd (160-197), men ikke kontrol-peptidet, efterlignes Mesd protein og væsentligt undertrykt Wnt reporter luciferaseaktiviteten i prostata cancer PC3-celler og brystkræft Hs578T celler (figur 5A). Følgelig hMesd (160-197) stærkt formindsket niveauerne af cytosolisk frit β-catenin, LRP6 phosphorylering og Wnt /β-catenin signaling mål Axin2 og cyclin D1-ekspression i PC-3 og Hs578T celler (figur 5B).

(A) PC-3 og HT578T celler i plader med 24 brønde blev transient transficeret med Super8XTOPFlash luciferase-konstruktion og β-galactosidase-udtrykkende vektor i hver brønd. Efter 24 timers inkubation blev celler behandlet med muse Mesd (mMesd), human Mesd peptid hMesd (160-197) eller kontrol-peptid i de angivne koncentrationer. Luciferaseaktiviteten blev derefter målt 24 timer senere med normalisering til aktiviteten af ​​β-galactosidase. Værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med s.d. indikeret ved fejlsøjler.

** P

0,01 sammenlignet med kontrol celler uden Mesd eller Mesd peptid behandling. (B) PC-3 og Hs578T celler i 6-brønds plader blev behandlet med mMesd, hMesd (160-197) eller kontrol-peptid i de angivne koncentrationer i 24 timer. Niveauerne af cytosolisk frit β-catenin, og totalt cellulært β-catenin, LRP6, Axin2, cyclin D1 og phosphoryleret LRP6 blev derefter analyseret ved Western blotting. Prøver blev også probet med anti-actin-antistof til at kontrollere lig belastning.

Wnt1 regulerer cellulær differentiering og proliferation af brystepiteliet, og Wnt1 opregulering i mælkekirtlen er blevet vist at inducere mammary hyperplasi og adenocarcinom [34], [35]. Overekspression af Wnt1 blev fundet i de fleste af prostatacarcinom enheder [36]. For yderligere at karakterisere den inhiberende virkning af Mesd C-terminale region peptid i prostata- og brystcancerceller, vi transient transficeret PC-3 og Hs578T celler med Wnt1 og Wnt reporterplasmider og behandlet med Mesd protein eller humant Mesd peptid hMesd (160-197 ). Vi fandt igen at hMesd (160-197), men ikke kontrol-peptidet, efterlignede Mesd protein til signifikant undertrykke Wnt reporter luciferaseaktivitet fremkaldt af Wnt1 i PC3 og Hs578T celler (figur 6A). Desuden hMesd (160-197) stærkt formindsket niveauerne af cytosolisk frit β-catenin, LRP6 phosphorylering og Wnt /β-catenin signaling mål Axin2 og cyclin D1 i Wnt1-udtrykkende PC-3 og Hs578T celler (figur 6B).

(A) PC-3 og HT578T celler i plader med 24 brønde blev transient transficeret med Wnt1 plasmid sammen med Super8XTOPFlash luciferase-konstruktion og β-galactosidase-udtrykkende vektor i hver brønd. Efter 24 timers inkubation blev celler behandlet med muse Mesd (mMesd), human Mesd peptid hMesd (160-197) eller kontrol-peptid i de angivne koncentrationer. Luciferaseaktiviteten blev derefter målt 24 timer senere med normalisering til aktiviteten af ​​β-galactosidase. Værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med s.d. indikeret ved fejlsøjler.

** P

0,01 sammenlignet med kontrol celler uden Mesd eller Mesd peptid behandling. (B) PC-3 og Hs578T celler i 6-brønds plader blev transient transficeret med Wnt1 plasmid eller den tilsvarende kontrol vektoren. Efter at være blevet inkuberet i 24 timer blev celler behandlet med mMesd, hMesd (160-197) eller kontrol-peptid i de angivne koncentrationer i 24 timer. Niveauerne af cytosolisk frit β-catenin, og totalt cellulært Wnt1, β-catenin, LRP6, Axin2, cyclin D1 og phosphoryleret LRP6 blev derefter analyseret ved Western blotting. Prøver blev også probet med anti-actin-antistof til at kontrollere lig belastning.

The Mesd C-terminale region peptid inhiberer prostatacancer PC-3 og brystkræft Hs578T celleproliferation

under fastslået, at Mesd C-terminale region peptid undertrykker Wnt /β-catenin signalering i PC-3 og Hs578T celler, vi derefter undersøgt effekten af ​​Mesd C-terminale region peptid på cancercelleproliferation. Som det ses i figur 7, hMesd (160-197), men ikke kontrol-peptidet, efterlignes Mesd protein og vises inhiberende virkning på PC-3 og Hs578T celleproliferation i en tidsafhængig måde (Figur 7A). For at bekræfte den inhiberende virkning af den Mesd peptid på cancercelleproliferation, udførte vi BrdU-inkorporering assay efter at cellerne blev behandlet med peptider. Det blev konstateret, at Mesd C-terminale region peptid faldt BrdU-inkorporering i PC-3 og Hs578T celler (figur 7B).

(A) kræftceller i 6-brønds plader blev behandlet med muse Mesd (mMesd, 2 uM), human Mesd peptid hMesd (160-197) (4 uM) eller kontrolpeptid (4 uM) i RPMI-1640-medium indeholdende 2% FBS for PC-3-celler eller DMEM-medium indeholdende 2% FBS for Hs578T i 10 dage . Medierne blev skiftet hver anden dag, og cellerne blev høstet og talt ved hjælp af trypanblåt-udelukkelse assay. Værdier er gennemsnit af tre bestemmelser med standardafvigelser indikeret ved fejlsøjler. **

P

0,01 sammenlignet med celler behandlet med PBS eller kontrol peptid. (B) kræftceller i T-25 kolber blev behandlet med humant Mesd peptid hMesd (160-197) (2 uM) eller kontrolpeptid (2 uM) i dyrkningsmediet indeholdende 2% FBS for 7 dage. Medierne blev ændret hver anden dag. Cellerne blev derefter høstet og podet i 96-brønds vævskulturplader med en densitet på 5000 celler /brønd med hMesd (160-197) (2 uM) eller kontrolpeptid (2 uM) i dyrkningsmedium indeholdende 10% FBS i 2 dage. Celleproliferation blev målt ved BrdU proliferation ELISA. Alle værdier er gennemsnittet af seks bestemmelser med s.d. indikeret ved fejlsøjler.

** P 0,01

sammenlignet med celler behandlet med kontrol peptid

Mesd protein og dets C-terminale region peptid potensere kemoterapi agent Adriamycin-induceret cytotoksicitet i PC-3 og Hs578T. celler

Adriamycin er en fælles kemoterapi agent. Vi derefter testet, hvorvidt Mesd protein og dets C-terminale region-peptid kan øge kemoterapimiddel Adriamycin-induceret cytotoksicitet i kræftceller. Som det ses i figur 8, kombinationsbehandlingen forårsagede mere cytotoksicitet i Hs578T og PC-3-celler end individuel agent behandling. For eksempel behandling af Hs578T celler med Mesd protein (2 uM) alene og Adriamycin (0,5 uM) alene resulterede i 25% og 69% inhibering af cellelevedygtighed hhv. Men når de behandles med Mesd protein plus Adriamycin blev cellen levedygtighed Hs578T celler reduceret, til 8% (figur 8).

(A) kræftceller i T-25 kolber blev behandlet med muse Mesd (2 uM ) i RPMI-1640-medium indeholdende 2% FBS for PC-3-celler eller DMEM-medium indeholdende 2% FBS for Hs578T i 4 dage. Medierne blev skiftet hver anden dag, og cellerne blev høstet og podet i 96-brønds vævskulturplader med en densitet på 5000 celler /brønd med Mesd (2 uM) og /eller Adriamycin (0,5 uM) i RPMI-1640 medium indeholdende 10% FBS for PC-3-celler eller DMEM-medium indeholdende 10% FBS for Hs578T i 2 dage. Cellelevedygtighed blev derefter målt ved celle Titer Glo Assay system. (B) kræftceller i T-25 kolber blev behandlet med humant Mesd peptid hMesd (160-197) (2 uM) eller kontrolpeptid (2 uM) i dyrkningsmediet indeholdende 2% FBS for 7 dage. indikeret ved fejlsøjler. Chen et al. Luciferaseaktiviteten blev derefter målt 24 timer senere med normalisering til aktiviteten af ​​β-galactosidase. Værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med s.d. indikeret ved fejlsøjler. Luciferaseaktiviteten blev derefter målt 24 timer senere med normalisering til aktiviteten af ​​β-galactosidase. Værdier er gennemsnittet af tredobbelte bestemmelser med s.d. indikeret ved fejlsøjler.