PLoS ONE: Tab af Let-7 opregulerer EZH2 i Prostata Cancer overensstemmelse med erhvervelse af Cancer Stem Cell signaturer, der dæmpes af BR-DIM

Abstrakt

Fremkomsten af ​​kastrationsniveau-resistent prostatacancer ( CRPC) bidrager til den høje dødelighed af patienter diagnosticeret med prostatakræft (PCA), der til dels kunne tilskrives eksistensen og fremkomsten af ​​cancer stamceller (CSCS). Nylige undersøgelser har vist, at dereguleret udtryk for microRNA (miRNA) bidrager til initiering og progression af PSA. Blandt flere kendte miRNA, lad-7 familien synes at spille en central rolle i tilbagefald og progression af PCa ved at regulere CSCS; imidlertid den mekanisme, hvormed Lad-7 familie bidrager til PCa aggressivitet er uklar. Forstærker af Zeste homolog 2 (EZH2), et formodet mål på lad-7 familie, blev påvist at styre stamcelle funktion. I denne undersøgelse fandt vi tab af lad-7 familie med tilsvarende overekspression af EZH2 i humane PCA vævsprøver, især i højere Gleason karakteren tumorer. Overekspression af lad-7 ved transfektion af lad-7 forstadier faldt EZH2 udtryk og undertrykt klonogene evne og kugle-dannende evne PCA celler, hvilket var i overensstemmelse med hæmning af EZH2 3’UTR luciferaseaktivitet. Vi fandt også, at behandlingen af ​​PCA celler med BR-DIM (formuleret DIM: 3,3′-diindolylmethane af Bio Respons, Boulder, CO, forkortet BR-DIM) opreguleret lad-7 og nedreguleret EZH2 udtryk, overensstemmelse med hæmning af selv-fornyelse og klonogene kapacitet. Desuden BR-DIM intervention i vores igangværende fase II klinisk forsøg med patienter forud for radikal prostatektomi viste opregulering af lad-7 i overensstemmelse med nedregulering af EZH2 udtryk i PCA vævsprøver efter BR-DIM intervention. Disse resultater tyder på, at tabet af lad-7 medieret forøget ekspression af EZH2 bidrager til PCa aggressivitet, som kunne dæmpes ved BR-DIM behandling, og dermed BR-DIM er tilbøjelige til at have klinisk effekt

Henvisning.: Kong D, Heath E, Chen W, Cher ML, Powell I, Heilbrun L, et al. (2012) Tab af Let-7 opregulerer EZH2 i Prostata Cancer overensstemmelse med erhvervelse af Cancer Stem Cell signaturer, der dæmpes af BR-DIM. PLoS ONE 7 (3): e33729. doi: 10,1371 /journal.pone.0033729

Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Modtaget: November 15, 2011; Accepteret: 16 Februar 2012; Udgivet: 19 marts, 2012 |

Copyright: © 2012 Kong et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af en bevilling fra National Cancer Institute, National Institutes of Health (5R01CA108535-06 og 5R01CA083695-08) udstedt til FHS. (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm? new=1 icde=4342569 loc=2 CFID=28929570 CFTOKEN=80568291). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft (PCA) er den anden hyppigste årsag til kræft død hos mænd i USA dræbte over 32,050 mænd i 2010 [1]. I de seneste ti år, er der sket betydelige forbedringer i de kirurgiske behandlingsmuligheder for patienter diagnosticeret med lokaliseret PCa. Prostata kirurgi har også nydt godt af tekniske og teknologiske fremskridt, såsom nerve besparende prostatektomi og robot prostatektomi. Adjuverende behandling, defineret som ekstra behandling for at reducere eller eliminere lokal og fjern sygdom, tilbydes til patienter [2], især dem, der er i høj risiko for tilbagefald (som ofte defineret af d’Amico kriterierne i PSA 20 ng /ml, Gleason 8-10, og scene T2C til T4) [3].

Strålebehandling og systemisk terapi især androgen deprivation terapi (ADT) betragtes som rimelige adjuverende behandlingsmuligheder. Patienter i høj risiko kategori har en gentagelse på mere end 50% inden for deres levetid, hvilket er uacceptabelt. Men en af ​​de bekymringer i at tilbyde adjuverende behandling til alle patienter i risikogruppe høje er, at selv større end 50% af patienterne gentager sig, er der 38-50% af patienter, der ikke [4]. For at mindske byrden af ​​over-behandling i denne patientgruppe, er der behov for yderligere værktøjer til at identificere de virkelig højrisiko-patienter. Aktuelle værktøjer blive undersøgt omfatter prædiktive nomogrammer [5] og studier, der evaluerer genekspression profilering, der har identificeret et par markører for tumor aggressivitet [6], [7], selv om sådanne fund ikke er blevet oversat til patientbehandling.

da tumor tilbagefald og metastaser bidrager til den høje dødelighed, har undersøgelser antydet, at aggressivitet PCa kunne være tæt forbundet med købet af kræft stamceller (CSC) eller cancer stamceller-lignende celler (CSLCs) egenskaber. Nye beviser tyder på, at dereguleret udtryk for mange mikroRNA (miRNA), herunder Lad-7 familie bidrager til kræft progression og tilbagefald [8]. MikroRNA’er er en klasse af ikke-kodende RNA på ca. 20 til 22 nucleotider i størrelse. De regulerer gen udtryk post-transkriptionelt ved at binde til en side i 3′-utranslaterede region (3’UTR) af target mRNA. De har vist sig at regulere cellecyklus, og udviklingen og progressionen af ​​cancer [9]. Lad-7 blev først opdaget og godt undersøgt i Caenorhabditis elegans. Den menneskelige Lad-7 familie består af lade-7a, lad-7b, lad-7c, lad-7d, lad-7e, lad-7f, lad-7g, lad-7i og miR-98. Den lad-7 familie almindeligvis betragtes som en tumorsuppressor overensstemmelse med nedregulering af oncogener, såsom Ras [10], høj mobilitet gruppe A2 (HMGA2) [11] og c-myc [12] ved at binde til 3’UTR af disse mål mRNA. Desuden faldt lad-7-ekspression blev fundet i mange cancertyper, herunder PCa [13], og det har været forbundet med dårlig patient prognosen hos lungecancer [14], hoved og hals pladecellecarcinom [15], og ovariecancer [16 ].

Interessant nok har lad-7 familiemedlemmer blevet påvist at regulere selvfornyelse kapacitet brystcancerceller [17] og PCA-celler ved kontrol af stamcelle-associerede faktorer såsom Oct4, Sox2, og Nanog ekspression [18]. Nylige undersøgelser har også dokumenteret, at lade-7 kan regulere ekspressionen af ​​Lin28 og Lin28B, som igen blokere ophobningen af ​​modent lad-7 [19]. Denne feedback regulering spiller en kritisk rolle i reguleringen af ​​”stemness” ved at styre selvfornyelse [20] – [23], som er den cellulære karakteristisk for CSCS eller CSLCs forbundet med tumor aggressivitet og fornyet. Disse resultater tyder på, at Lad-7 familie kunne spille en central rolle i udviklingen af ​​PCa ved at fastholde og regulere molekylære funktioner i CSCS eller CSLCs i PCa; Men hvordan lad-7 familie bidrager til PCa aggressivitet er ukendt.

Enhancer af Zeste homolog 2 (EZH2) er en af ​​målene i den Lad-7-familien af ​​miRNA, og at ekspressionen af ​​EZH2 er stærkt forbundet med molekylære funktioner i både normale stamceller og CSCS eller CSLCs. EZH2 er en histon-lysin N-methyltransferase, en underenhed af Polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2). Den Polycomb gruppe af proteiner er kendt for at være involveret i reguleringen af ​​gen undertrykkelse gennem kromatin ændringer, som er afgørende for opretholdelsen af ​​de embryonale og voksne stamceller [24], [25]. PRC2 indeholder EZH2, Suz12, Eed, og RBAP-underenheder og dette kompleks er kendt for at fungere i de embryonale og voksne stamceller at undertrykke udviklingsmæssige gener, der fortrinsvis aktiveres under differentiering [26]. Endvidere har yderligere undersøgelser vist, at PRC2 målgener co-besat af stamcelle regulatorer såsom Oct4, Sox2, og Nanog [27]. Nylige undersøgelser har også foreslået, at Polycomb gruppe proteiner er ikke kun vigtigt for embryonisk udvikling, men også spiller kritiske roller i tumor initiering og progression [25]. Over-ekspressionen af ​​EZH2 har været stærkt forbundet med kræft progression dels fordi PRC2 hæmmer E-cadherin udtryk, der fremmer epitel-til-mesenkymale overgang (EMT) i kræftceller [28], et fænomen, der minder om CSCS eller CSLCs. Suz12 har vist sig at mediere E-cadherin inhibering med snail1 [29]. Vigtigere, EZH2 direkte regulerer DNA-methylering ved at fungere som en rekruttering platform for DNA methyltransferase [30]. I vores tidligere undersøgelse fandt vi, at niveauerne af EZH2 og Suz12 mRNA blev forøget i PC3 PDGF-D-celler (EMT-fænotypisk celler) i forhold til PC3 Neo celler [18]. Disse resultater tyder klart, at PRC2 kan bidrage til EMT karakteristika PC3 PDGF-D-celler, som er i overensstemmelse med underskrifter fra CSCS eller CSLCs, der er forbundet med kræft progression og tilbagefald.

Tidligere prækliniske studier fra vores laboratorium har vist, at indol-3-carbinol (I3C) fundet i korsblomstrede grøntsager og dens

in vivo

metabolit 3,3′-diindolylmethane (DIM), især den formulerede DIM (BR-DIM eller B-DIM), at vi har brugt til vores fase i klinisk forsøg [31], er potente midler i inhibering af væksten af ​​PCA-celler, som blev medieret af ændringer i multiple cellulære signalering [32]. Vores seneste resultater viste, at BR-DIM forårsagede opregulering af miR-200b og miR-200c, der typisk tabt i PCA celler [33]. I den aktuelle undersøgelse, fandt vi tab af ekspression af lad-7 familie i overensstemmelse med overekspression EZH2 i PCa celler og i humane PCA vævsprøver, især i tumorer med højere Gleason klasse. Resultaterne fra korrelationsanalyse viste at lade-7-ekspression omvendt var forbundet med EZH2 ekspression i patienter med højere Gleason karakteren tumorer. Her er vi også bevis for den rolle, BR-DIM (formuleret DIM: 3,3′-diindolylmethane, forkortet enten BR-DIM eller B-DIM) i reguleringen af ​​lad-7 og EZH2 i PCA-celler, som dokumenteret af vores præ-kliniske fund samt fund fra vores igangværende fase II klinisk studie i PCA patienter modtog BR-DIM før radikal prostatektomi.

Materialer og metoder

cellelinjer og kultur tilstand

LNCaP, C4-2B, og CWR22RV1 blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 10 pmol /l Hepes, 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. Stabile cellelinjer over-udtrykkende PDGF-D og tom vektor pcDNA3 blev genereret ved transfektion af PC3-celler med pcDNA3-PDGF-D: His eller tilsvarende tom vektor pcDNA3 Neo som tidligere beskrevet og omtalt som PC3 Neo, eller PC3 PDGF-D celler [34], henholdsvis hele dette manuskript. PC3 Neo, PC3 PDGF-D, PC3, DU145-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium med 2 mmol /l glutamin, 10 mmol /l Hepes (Invitrogen, Carlsbad, CA) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 50 enheder /ml penicillin og 50 ug /ml streptomycin. PZ-HPV-7 og RWPE-1-celler blev erhvervet fra ATCC (Manassas, VA). Disse celler blev dyrket i keratinocyt serumfrit medium (K-SFM) leveret af Invitrogen (GIBCO) og leveres med 0,05 mg /ml bovin hypofyse (BPE) og 5 ng /ml human rekombinant epidermal vækstfaktor (EGF). Alle celler blev holdt i et CO 5%

2-befugtet atmosfære ved 37 ° C, og genotypisk karakteriseret at støtte ægtheden af ​​disse celler, og som svarer til dens oprindelse.

Reagenser og antistoffer

antistof mod EZH2 blev købt fra BD Biosciences (Bedford, MA). Antistof mod glyceraldehyd 3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) blev indkøbt fra Affinity Bioreagents (Golden, CO). Ged anti-mus IgG (H + L) -HRP-konjugat blev opnået fra Bio-Rad (Reinach, BL). BR-DIM, et formuleret DIM med højere biotilgængelighed, blev venligst stillet til rådighed af Dr. Michael Zeligs (forkortet som BR-DIM eller B-DIM, Bio Respons, Boulder, CO) og blev opløst i DMSO til at gøre 50 mmol /l stamopløsninger og opbevaret ved -20 ° C i flere portioner for

in vitro

undersøgelse.

Etik erklæring

Patient væv blev indsamlet efter godkendelse fra Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Denne kliniske protokol er klassificeret som fritaget # 4 kategorier under NIH politik, fordi sådanne undersøgelser er retrospektive undersøgelser med anvendelse af arkivering prøve. Det IRB frafaldes behovet for samtykke til brug af arkivet prøver, hvilket var i overensstemmelse med NIH retningslinjer, og prøverne blev analyseret anonymt. PCa vævsprøver fra vores igangværende kliniske forsøg med BR-DIM (B-DIM) indgreb forud for radikal prostatektomi blev også opnået efter godkendelse fra Wayne State University Institutional Review Board (IRB) og informerede samtykke blev opnået fra alle forsøgspersoner. Fordi denne undersøgelse er en konventionel klinisk forsøg, IRB proces kræves skriftlig samtykke fra patienter før periodisering i det kliniske forsøg, som rutinemæssigt koordineres gennem det kliniske forsøg kontor (CTO). Godkendelsen gennem IRB implicerer opfylder samtykkende og periodisering uden hvilken patienterne ikke kan indskrevet i studiet, og dermed vores undersøgelse opfyldte alle de nødvendige retningslinjer compliance fra CTO og IRB. Den lokale kliniske forsøgsprotokol nummer er 2007-128, som kan findes i den kliniske NIH trials.gov. (https://clinicaltrials.gov/show/NCT00888654). På tidspunktet for erhvervelsen prøve for den aktuelle undersøgelse, forsøgsprotokollen påløbne 20 patienter; imidlertid har undersøgelsen nu påløbne alt 33 patienter. Det forventes, at vi vil lukke dette studie med 37 patienter i begyndelsen af ​​2012.

Patienter og prostata væv prøvetagning

Efter at have opnået institutionel Review Board godkendelse, retrospektive arkivers forbehandling PCA væv og matches tilstødende normale væv blev opnået fra Biospecimen kerne af Karmanos Cancer Institute (KCI) indsamlet fra patienter, som gennemgik radikal prostatektomi 2004-2010 på KCI. Vi opnåede også PCA vævsprøver fra vores igangværende kliniske forsøg med BR-DIM (B-DIM) indgreb forud for radikal prostatektomi af nydiagnosticerede PCA patienter 2009-2011 på KCI og Henry Ford Health System (HFHS), Detroit, Michigan . Formalin-fikseret paraffinindlejrede (FFPE) væv blev skåret for miRNA og mRNA analyse. Patienternes kliniske karakteristika blev opnået fra hospitalet database, herunder løb, som vist i tabel 1. Patologiske funktioner blev konstateret fra mikroskopisk vurdering af tumor lysbilleder af patologer både KCI og på HFHS. Gleason score (grad) blev opnået i hvert tilfælde fra den kliniske database.

Klonogen assay

C4-2B, PC3 PDGF-D, og ​​PC3 PDGF-D-celler transficeret med lad-7 familie for 24 timer blev opsamlet efter trypsinisering, og resuspenderes i komplet medium. Enkeltcellesuspensioner blev udpladet i regelmæssige 10 cm i petriskåle med en diameter på koloni tæthed på 2.000 celler pr skål. Efter 2-3 ugers inkubation med skiftende frisk medium hver 3-4 dage blev kolonier farvet med krystalviolet i yderligere 10 minutter og vasket med 1 × PBS. Kolonierne blev fotograferet.

Soft agar assay

C4-2B celler blev høstet og suspenderet i dyrkningsmedium. Blød agar-assay blev udført som tidligere beskrevet af vores laboratorium [18]. Cellerne blev behandlet med 10 eller 25 uM BR-DIM med skiftende frisk medium med BR-DIM hver 3 dage. Efter tre ugers vækst blev kolonierne farvet ved inkubation med 0,5 mg /ml MTT i 4 timer, og derefter blev fotograferet (40 ×). Kolonien numre blev talt under et fasekontrastmikroskop. Data blev præsenteret som koloni-numre (% kontrol).

Self-fornyelse kapacitet assay

Enkelt celle suspensioner af C4-2B og PC3 PDGF-D-celler blev udsået i ultralave vedhængende brønde af 6 Tja plader (Corning, Lowell, MA) ved 2000 celler /brønd i DMEM /F12 (Invitrogen) indeholdende 1 × B27 og N2 (Invitrogen). Enkelt celle status blev bekræftet under mikroskop. Frisk medium med 10 eller 25 pM blev tilsat hver 3-4 dage. Efter en uge blev antal prostaspheres talt under et mikroskop og data blev præsenteret som sfære numre pr 1000 celler podet. Prostaspheres blev fotograferet (40 ×) under et fasekontrastmikroskop.

Western blot-analyse

Totale cellelysater blev opnået ved at lysere cellerne i RIPA-buffer. Proteinkoncentration blev bestemt ved anvendelse af BCA-proteinassay (Pierce, Rockford, IL). Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [35].

miRNA og transfektion

Celler blev transficeret med 40 nmol /l af lad-7 forstadier eller miRNA forstadier negativ kontrol # 1 (Ambion, Austin , TX) under anvendelse DharmaFECT3 transfektionsreagens (Dharmacon, Lafayette, CO). Efter 1 dags transfektion blev cellerne trypsonized, og resuspenderes i komplet medium. Enkeltcellesuspensioner blev bekræftet under et mikroskop for klongenicitetsassayet. Hertil kommer, efter 3 dages transfektion blev cellelysaterne forberedes til Western blot-analyse.

Luciferaseaktivitet assay

PC3 PDGF-D-celler med lavere niveauer af lad-7 blev podet med en densitet på 6 x 10

3 celler /brønd i en 96-brønds plade og inkuberet i 24 timer. Cellerne blev co-transficeret med EZH2 3’UTR luciferase plasmid (Origene, Rockville, MD) eller Renilla luciferase plasmid og styre miRNA, lad-7a, lad-7b, lad-7c, og lad-7d forstadier ved hjælp DharmaFECT duo transfektionsreagens (Dharmacon, Lafayette, CO). Efter 48 timers inkubation blev luciferaseaktivitet analyseret under anvendelse Steady-Glo Luciferase Assay System (Promega). The Renilla luciferase-aktivitet blev anvendt som kontrol for transfektionseffektivitet.

Real-time RT-PCR

For at bestemme mRNA-niveauer, blev det totale RNA fra celler isoleret under anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen ) og DNA’et blev fjernet under anvendelse af et RNase-frit NDase kit (Qiagen). Et mikrogram af RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse en høj kapacitet RNA-til-cDNA Kit (Applied Biosystems, Fostor, CA) i overensstemmelse med producentens anvisninger. PCR blev udført som tidligere beskrevet [18]. Den relative mængde af mRNA blev normaliseret til ekspressionen af ​​GAPDH. Til afprøvning af miRNA niveauer, blev det totale RNA fra celler isoleret ved anvendelse af miRNeasy Mini Kit (Qiagen), og DNA’et blev fjernet under anvendelse af et RNase-frit NDase kit (Qiagen). 20 ng RNA blev revers transkriberet til cDNA ved anvendelse af en Universal cDNA Synthesis Kit (Exiqon, Woburn, MA) ifølge fabrikantens instruktioner. Real time PCR blev udført under anvendelse af specifikke miRNA primere (Exiqon) at kvantificere miRNA-ekspression ved hjælp af SYBR® Green RT-PCR-reagenser (Applied Biosystems). Den relative mængde af miRNA blev normaliseret til ekspressionen af ​​RNU48. At bestemme mRNA eller miRNA niveauer i prostatacancerpatient væv, blev det totale RNA isoleret fra FFPE væv under anvendelse miRNeasy FFPE Kit (Qiagen) ifølge producentens anvisninger. RT-PCR assay for miRNA og mRNA-ekspression blev vurderet som ovenfor. Den relative mængde af mRNA blev normaliseret til ekspression af beta-actin og relative mængde af miRNA blev normaliseret til ekspressionen af ​​RNU1A.

Microarray for miRNA profil i prostatakræft patient væv

miRNA microarray samt dataanalyse blev udført efter procedurer som tidligere beskrevet af Kong et al [18].

Alle data er MIAME kompatibel og at den rå data er blevet deponeret i en MIAME kompatibel database. GEO tiltrædelse nummer er GSE34310.

Statistiske metoder

Eksperimenter præsenteret i tallene for cellelinje undersøgelser er repræsentative for tre eller flere uafhængige gentagelser. Data er præsenteret som gennemsnit og standardafvigelse (SD) i søjlediagrammer. De miRNA og mRNA data fra patientens vævsprøve blev log transformeret inden analyse. Sammenligninger af de kontinuerlige variabler mellem to uafhængige grupper blev foretaget ved hjælp af Wilcoxon rank sum test. For parrede relaterede grupper (dvs. normale væv og parrede G6 tumorvæv), Wilcoxon signed rank test blev anvendt. Spearman korrelationer blev anvendt til at beskrive styrken af ​​lineære sammenhæng mellem to variable. Statistisk test af signifikans af sammenhængen var baseret på tilnærmet

t

distribution. Alle statistiske tests var to-sidet på signifikansniveau på 0,05, medmindre andet er angivet. For at reducere falske positivitet, med andre ord styre familien-kloge type I fejl, i denne indledende tidlige fase eksplorativ undersøgelse, brugte vi justerede p-værdier fra to-trins step-up falsk opdagelse sats (FDR) kontrollerende metode [36] . En nominel fejlprocent til at anslå antallet af sande nulhypoteser i to trin FDR procedure blev sat til 0,05.

Resultater

Angivelse af lad-7 familie gik tabt i prostatakræft ( PCA) vævsprøver

for at bestemme indholdet af den lad-7 familie i PCA vævsprøver, vi indsamlet før behandlingen PCA væv og matchede tilstødende normale vævsprøver (anvendt som kontrol til sammenligning med tumorvæv). Resultaterne fra miRNA udtryk ved mircroarray udtryk profilering viste, at alle medlemmer af Lad-7 familie (miR-98 var målbart) faldt i PCA væv i forhold til tilstødende normale vævsprøver (Fig. 1A). Endvidere fandt vi, at ekspression af lad-7a, lad-7b, lad-7c og lad-7d var måles præcist i forhold til andre familiemedlemmer, fordi deres udtryk var meget lave (fig. 1A). Derfor har vi bestemt og bekræftede udtryk for Lad-7a, lad-7b, lad-7c, og lad-7d i alle de tilfælde, herunder 129 PCA vævsprøver og 94 tilstødende normale vævsprøver. Vi opdagede, at udtrykket på lad-7 familie i histologisk normale prostata væv fra Gleason klasse 7 eller højere tumor blev faldt i forhold til histologisk normalt væv fra Gleason klasse 6 tumorer (data ikke vist), hvilket tyder på, at de histologisk normale væv fra prostata kirtel af patienter med højere lønklasse tumorer er ikke normal. Således tog vi normalt fra prostata af alle patienter diagnosticeret med karakteren 6 tumorer til yderligere analyse og brugt det som “normal væv kontrol”. Vi observerede, at udtrykkene for lad-7 familie i klasse 6 tumorer er ikke statistisk anderledes i forhold til normal kontrol. Vi fandt imidlertid en signifikant nedsat udtryk for lad-7a, lad-7b, let7c og lad-7d i PCa med Gleason klasse 7 eller højere tumorer i forhold til normalt væv kontrol (fig. 1B). Disse resultater tyder på, at tabet af lad-7 familie kunne være forbundet med PCa aggressivitet især fordi de lavere lønklasse tumorerne var ikke anderledes end det normale væv kontrol, mens højere lønklasse tumorer var anderledes.

(A) Microarray profilering blev gjort for at vurdere ekspressionen af ​​miRNA ved hjælp total RNA udvundet fra tre PCA vævsprøver og matchede tilstødende normale prostata væv. Resultaterne viste, at lade-7a, lad-7b, lad-7c og lad-7d blev højt udtrykt i prostatavæv og deres ekspression blev tabt i humane PCA vævsprøver (* p 0,05, ** p 0,01). (B) Resultaterne fra real time-RT-PCR bekræftede, at niveauerne af Lad-7b, lad-7c og lad-7d var signifikant nedreguleret i tumorer med højere Gleason klasse. (7a: lad-7a, N: normal; TG6: tumorvæv fra patienter med Gleason klasse 6. n = 39 for normal, n = 44 for TG6, n = 52 for TG7, n = 33 for TG8, 9). (C) En væsentlig opregulering af ekspressionen af ​​EZH2 blev observeret i PCA vævsprøver med Gleason klasse 7 (n = 46) og højere (n = 33), men ikke i PCa prøver med Gleason karakteren 6 (n = 39) . (D) EZH2 niveauer blev omvendt korreleret med lad-7b og lad-7c udtryk i tumor prøver med Gleason klasse 7.

Angivelse af EZH2 blev øget i PCA vævsprøver og var omvendt korreleret med udtrykket af lad-7 familie

Siden udtryk for lad-7 familie gik tabt i PCA væv af patienter med højere Gleason kvalitet, det rejser et spørgsmål om, hvordan lad-7 familie kunne regulere PCa aggressivitet. Vi har søgt mål for Lad-7 familie ved hjælp Targetscan software, og vi konstaterede, at EZH2 kunne reguleres af Lad-7 familie, fordi der er et specifikt bindingssted i 3’UTR af EZH2 mRNA. Således har vi vurderet ekspression af EZH2 mRNA i PCA væv. Vores resultater viste, at EZH2 ekspression blev forøget i PCA vævsprøver med Gleason klasse 7 og højere sammenlignet med normalt væv kontrol (fig. 1C). Udtrykket af Lad-7b og lad-7c var omvendt korreleret med EZH2 udtryk med r = -0,36 (95% CI: -0,61 til -0,06), p = 0,0414, og r = -0,43 (95% CI: -0,65 til – 0,15), p = 0,0132, henholdsvis (fig. 1D). Disse resultater antyder, at tabet af lad-7 kunne være ansvarlig for forøget ekspression af EZH2.

Lad-7 undertrykt EZH2 ekspression og inhiberede klonogen vækst PCa celler

Vi undersøgte ekspressionen af ​​EZH2 i PCA cellelinier og immortaliserede prostata epiteliale cellelinjer, og fandt, at EZH2 blev udtrykt i prostatacancerceller ved relativt højere niveauer sammenlignet med immortaliserede prostata epiteliale cellelinjer: PZ-HPV-7 og RWPE-1-celler (figur 2A, øvre panel. ). For yderligere at bestemme den biologiske konsekvens af Lad-7 familie udtryk i reguleringen af ​​EZH2 udtryk vi transficeret PC3 og PC3 PDGD-D-celler med lad-7 forstadier, og resultaterne viste, at lade-7 familiemedlemmer kunne signifikant inhibere ekspressionen af EZH2 i disse to cellelinjer (fig. 2A, midterste og nederste panel). Disse resultater antyder, lad-7 familie regulerer ekspressionen af ​​EZH2. For at opnå yderligere mekanistisk indsigt, testede vi, om lad-7 kunne direkte undertrykke udtryk for EZH2 ved binding til 3’UTR af EZH2 mRNA. Vi co-transficeret EZH2 3’UTR luciferase plasmid og lad-7 prækursorer, og fandt, at lade-7a, lad-7b, lad-7c, og lad-7b kunne kraftigt inhibere EZH2 3’UTR luciferaseaktivitet sammenlignet med transfektion af celler med kontrol miRNA (fig. 2B). Lad-7 bindingssteder i 3’UTR af EZH2 mRNA er vist i figur 2C. Vi derefter testet biologisk konsekvens af celler transficeret med præ-let-7 familie og vurderet klonogenisk vækst som en indirekte

in vitro

mål for tumor aggressivitet. Vi fandt, at overekspressionen af ​​lad-7 familie signifikant inhiberede klonogene vækst af PC3 PDGF-D-celler, som oprindeligt udviste lavere ekspression af lad-7 (fig. 2D). Men i øjeblikket er der ingen metode, der kunne være klinisk nyttige for opregulering af mistede miRNA. Til det formål har vi testet vores hypotese ved at teste, om BR-DIM kunne være nyttige til opregulering af miRNA.

(A) Ekspression af EZH2 viste sig at være højere i PCA cellelinjer sammenlignet med immortaliserede prostata epitelcelle linjer: PZ-HPV-7 og RWPE-1 (øverste panel) og transfektion af lad-7 forstadier hæmmede EZH2 udtryk i PC3 og PC3 PDGF-D-celler 3 dage efter transfektion (midterste og nederste panel). (B) lad-7 familiemedlemmer undertrykt EZH2 3’UTR luciferaseaktivitet i PC3 PDGF-D-celler (Lavere niveauer af lad-7 familie i disse celler) co-transficeret med lad-7 og EZH2 3’UTR luciferase plasmid. (C) lad-7 bindingssteder i 3’UTR af EZH2 mRNA blev vist. (D) Transfektion af lad-7 forstadier betydeligt reduceret klonogen vækst kapacitet PC3 PDGF-D-celler (Con: kontrol, 7a: pre-lad-7a, ** p 0,01)

BR. -DIM behandling førte til opregulering af lad-7 familie og følgelig nedreguleres ekspressionen af ​​EZH2 i PCA-celler

i den foreliggende undersøgelse fandt vi, at BR-DIM behandling forøgede ekspression af lad-7 familie i flere PCA cellelinjer, herunder LNCaP, C4-2B og PC3-celler (fig. 3A og fig. S1A-C). Desuden også BR-DIM behandling førte til nedsat ekspression af EZH2 mRNA (fig. 3B) og protein i forskellige PCA cellelinier og på forskellige tidspunkter (fig. 3C, 3D og fig. S1D). Desuden Mere interessant, data fra vores igangværende fase II klinisk studie viste, at BR-DIM behandling af PCA patienter forud for radikal prostatektomi førte til forøget ekspression af lad-7a, lad-7b, lad-7c, og bogstav 7d i tumorprøver efter BR-DIM intervention (fig. 4A-C), og disse resultater stemmer overens med reduceret ekspression af EZH2 (fig. 4D). Derfor er vores resultater tyder på, at BR-DIM kan være et vigtigt middel til at re-udtrykke de tabte miRNA især Lad-7 familie, hvilket ville reducere niveauet af EZH2 udtryk og kompromis CSCS eller CSLCs funktion.

( A) Totalt RNA blev isoleret fra LNCaP, C4-2B og PC3-celler behandlet med 25 pM BR-DIM i 24 timer, og resultaterne fra real time RT-PCR viste, at ekspressionen af ​​lad-7 blev øget efter BR-DIM behandling sammenlignet til ubehandlet kontrol (c: DMSO kontrol). (B) Niveauer af EZH2 mRNA blev undertrykt af BR-DIM behandling på en dosisafhængig ondere. (C og D) Cellelysaterne blev fremstillet ud fra celler behandlet med BR-DIM i 48 timer og Western blot, der viser proteinniveauer af EZH2, der blev nedreguleret af BR-DIM behandling (PC3 PD: PC3 PDGF-D-celler, *, p 0,05, **, p. 0,01)

RNA blev opnået fra BR-DIM interventions- kliniske forsøg prøver, hvor BR-DIM blev givet til patienter i 2-4 uger før operationen . RNA blev også opnået fra formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) vævsprøver af PCA patienter med matchede tumor Gleason kvalitet, tumor scenen og patientens alder som kontrolgruppe. Ekspressionen af ​​miRNA og mRNA blev vurderet ved anvendelse real time RT-PCR. Relative miRNA og mRNA-niveauer blev normaliseret til RNU1A1 og beta-actin, hhv. (A) BR-DIM indgriben ført til øgede tendens i niveauer af Let-7a-ekspression. (B og C) Lad-7b, lad-7c og lad-7d var signifikant opreguleret af BR-DIM intervention. (D) EZH2 udtryk blev nedreguleret af BR-DIM intervention.

BR-DIM behandling hæmmede selv-fornyelse og klonogenisk kapacitet PCA celler

For at teste, om BR-DIM kunne regulere selvfornyelse kapacitet og klonogenisk evne PCA celler, udførte vi sfære-dannende assays og fundet, at behandlingen af ​​C4-2B og PC3 PDGF-D-celler med 10 eller 25 uM BR-DIM markant reduceret antallet og størrelsen af prostaspheres sammenlignet med ubehandlede kontrol (DMSO-kontrol) (fig. 5A). Desuden BR-DIM behandling inhiberede også klonogene vækst kapacitet PCA cellelinier C4-2B og PC3 PDGF-D-celler (fig. 5B). Resultaterne fra blød agar-assay viste yderligere, at behandlingen af ​​C4-2B celler med 10 eller 25 uM BR-DIM reducerede kolonistørrelsen og tal (fig. 5C og 5D), hvilket antyder, at BR-DIM kunne eliminere tumorceller især celler med CSCS eller CSLCs egenskaber ved opregulering lad-7 familie og dermed af nedregulere ekspressionen af ​​EZH2.

(A) Enkelt celle suspensioner af C4-2B og PC3 PDGF-D-celler blev udsået i ultra lave adhærente brønde i 6-brønds plade ved 2000 celler /brønd i DMEM /F12 suppleret med B27 og N2 og med 10, 25 uM BR-DIM og inkuberet i 6 dage. Prostasphere tal blev reduceret med BR-DIM behandling (øverste panel).