PLoS ONE: Anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​hæmmer vedhæftning og invasion af leverkræft Cells

Abstrakte

To vigtige begivenheder, nemlig vedhæftning og invasion, er afgørende for forekomsten af ​​metastaser. Vigtigere har 37 kDa /67 kDa laminin receptor (LRP /LR) været impliceret i at øge disse to begivenheder og dermed letter kræft progression. I den aktuelle undersøgelse, rolle LRP /LR i adhæsion og invasion af leverkræft (HUH-7) og leukæmi (K562) -celler blev undersøgt. Flowcytometri vist, at HUH-7-celler viste signifikant højere celleoverflade LRP /LR niveau sammenlignet med den dårligt-invasiv brystcancer (MCF-7) kontrolceller, mens K562 celler udviste signifikant lavere celleoverflade LRP /LR niveauer i sammenligning med de MCF-7-kontrolceller. Western blotting og densitometrisk analyse viste dog, at alle tre tumorigene cellelinjer ikke adskilte sig væsentligt med hensyn til den samlede LRP /LR niveauer. Endvidere behandling af leverkræft celler med anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​(0,2 mg /ml) signifikant reduceret klæbemidlet potentiale af celler til laminin-1 og den invasive potentiale af celler gennem ECM-lignende Matrigel, mens leukæmi celler viste ingen signifikant forskel i begge tilfælde. Derudover Pearsons korrelationskoefficienter foreslog direkte proportionalitet mellem celleoverflade LRP /LR niveauer og limen og invasive potentiale leverkræft og leukæmi celler. Disse resultater tyder på den potentielle anvendelse af anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​som alternativ terapeutisk værktøj til metastatisk leverkræft gennem hindring af LRP /LR laminin-1 interaktion

Henvisning:. Chetty C, Khumalo T, Da Costa Dias B, Reusch U, Knackmuss S, Little M, et al. (2014) Anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​hæmmer vedhæftning og invasion af Liver kræftceller. PLoS ONE 9 (5): e96268. doi: 10,1371 /journal.pone.0096268

Redaktør: Corinne Ida Lasmezas, The Scripps Research Institute Scripps Florida, USA

Modtaget: November 25, 2013; Accepteret: April 4, 2014; Udgivet: 5 maj 2014

Copyright: © 2014 Chetty et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Grundforskningsfonden, Republikken Sydafrika og Sundhedsvidenskabelige Forskningsråd, Republikken Sydafrika. Eventuelle udtalelser, resultater og konklusioner eller anbefalinger udtrykt i dette materiale er dem af forfatter (e), og derfor mener Grundforskningsfonden sig ikke noget ansvar i denne henseende hertil. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre eller tilberedning af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. S.F.T.W. er i øjeblikket en PLoS ONE Editorial Board medlem. U.R., S.K. og M.L. er tilknyttet eller ansat af Affimed Therapeutics A.G., en kommerciel virksomhed, der producerer terapeutiske antistoffer til behandling af cancer og inflammatoriske sygdomme. Endvidere har anti-LRP /LR antistoffer anvendt i denne undersøgelse for blokade af invasion og adhæsion blevet beskrevet i to internationale patenter som potentielle terapeutiske anticancer værktøjer. Nemlig patent, EP0984987, med titlen “En opløselig laminin receptor forløber og metoder til at hæmme dets interaktioner” har krav rettet mod et farmaceutisk præparat, som omfatter en opløselig laminin receptor forløber eller funktionelt derivat eller fragment deraf og er ejet af University of the Witwatersrand. Dette patent er blevet valideret i Det Forenede Kongerige og Tyskland. Det andet patent, EP1670826, er medejer af University of the Witwatersrand og Affimed Therapeutics AG og har titlen “Enkelt kæde antistof handler mod 37 kDa /67 kDa laminin receptor som redskaber til diagnose og behandling af prionsygdomme og kræft, produktion og anvendelse deraf “. Denne givet europæisk patent blev valideret i Det Forenede Kongerige, Frankrig, Tyskland, Schweiz og Østrig. Kravene er rettet til en enkelt kæde antistof molekyle specifikt rettet mod LRP /LR til behandling af prionsygdomme eller kræft. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Kræft er en global byrde, som har vist sig at være den førende dødsårsag i økonomisk udviklede lande og den næsthyppigste dødsårsag i økonomisk udviklingslande [1]. Ifølge Research Fund verden Cancer (WCRF), blev en anslået 14,1 millioner tilfælde af kræft diagnosticeret i år 2012, og det forudses, at cirka 24 millioner nye tilfælde af kræft vil blive diagnosticeret i år 2035, globalt (http: //www.wcrf.org/cancer_statistics/). I øjeblikket har lungekræft blevet identificeret som den mest almindeligt diagnosticeret kræft type, med de to kræfttyper centrale for nærværende undersøgelse nemlig leverkræft og leukæmi, bliver rangeret som sjette og ellevte mest diagnosticeret kræft typer, henholdsvis (GLOBOCAN). Det er blevet rapporteret, at omkring 782 tusind tilfælde af leverkræft og 352000 tilfælde af leukæmi blev diagnosticeret i år 2012 (https://www.wcrf.org/cancerstatistics/world kræft statistics.php), hvilket indikerer det presserende behov for at udvikle en effektiv behandlinger mod kræft.

Celler er i høj grad afhængig af den ekstracellulære matrix (ECM), som er den ikke-cellulær komponent af alle væv og organer, der giver en fysisk stillads til cellulære komponenter, og også hjælper med initiering af væsentlig biokemisk processer nødvendige for korrekt vævsdifferentiering, homeostase og morfogenese [2]. Celler klæbe til ECM via virkningen af ​​ECM-receptorer [2]. Især de ikke-integrin 37-kDa /67-kDa laminin receptor (LRP /LR) er en vigtig del af den ekstracellulære matrix, der bistår i talrige fysiologiske processer [3], [4], [5]. Det foreslås, at 37-kDa LRP er forløber for den 67-kDa høj affinitet laminin receptor LR imidlertid den nøjagtige mekanisme, hvorved forstadiet danner receptor er ukendt [6].

LRP /LR er overvejende et transmembrant receptor, er det imidlertid også tydeligt i kernen og cytosolen [7], [8]. I kernen, LRP /LR spiller en kritisk rolle i opretholdelsen af ​​nukleare strukturer, mens i cytosolen, det hjælper med translationelle processer [8]. Som transmembrane receptor, LRP /LR tjener flere funktioner såsom celle migration [9], celle-matrix adhæsion [10], cellernes levedygtighed og proliferation [3], [4], [5].

LRP /LR er blevet vist at have en høj bindingsaffinitet for laminin-1. Laminin-1 er en del af en familie af lamininer, som er ekstracellulære matrixproteiner, der udgør flere noncollagene glycoproteiner, der findes i basalmembranen [11], [12]. Dette glycoprotein menes at spille kritiske roller i cellebinding [11], samling af basalmembranen [11], cellevækst og differentiering [13], cellemigrering [11], [14], neuritudvækst [11], [15 ] og angiogenese [16]. Laminin-1 har også vist sig at fremme den invasive fænotype af tumorigene celler [17].

LRP /LR har vist sig at være overudtrykt på overfladen af ​​mange tumorigene celler [18]. Resultatet af denne overekspression er en øget samspil mellem LRP /LR og laminin-1, og dette samspil har vist sig at være afgørende i at forbedre vedhæftning og invasion – to centrale elementer i metastaser [19]. Væsentlige, laminin-1 i basalmembranen interagerer med LRP /LR på overfladen af ​​tumorigene celler, der fører til adhæsion [19]. Dette vil igen, resulterer i sekretionen af ​​proteolytiske enzymer, såsom type IV collagenase med henblik på at hydrolysere type IV collagen i basalmembranen, hvorved tumorigene celler at invadere og i sidste ende translokere til et sekundært site [19].

Siden LRP /LR-laminin-1 interaktion er blevet identificeret som den afgørende begivenhed i vedhæftning og invasion, blokering af denne interaktion kunne betragtes som en væsentlig mekanisme til at behandle metastatisk cancer. Dette implicerer LRP /LR som mål for behandling af metastatisk cancer. Endvidere har flere undersøgelser vist, at anvendelsen af ​​anti-LRP /LR specifikke antistoffer reducerer klæbemidlet og invasive potentiale af visse tumorgene celler, såsom HT1080 fibrosarcoma [18], lunge betydeligt [4], cervikal [4], colon [4] , prostata [4], bryst [20] og øsofageal [20] cancerceller. Især har anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​blevet foreslået at afbryde LRP /LR-laminin-1-interaktionen [4], således IgG1-iS18 ​​kan betragtes som et muligt terapeutisk værktøj ved behandling af metastatisk cancer.

i denne undersøgelse evnen af ​​anti-LRP /LR-specifikt antistof IgG1-iS18 ​​at hindre klæbemidlet og invasive potentiale leukæmi og leverkræft celler blev undersøgt. På grund af den høje forekomst og dødelighed vedrørende disse to cancertyper, alternative behandlingsmuligheder blevet en nødvendighed. Det er bemærkelsesværdigt, at lignende undersøgelser er blevet udført, er det imidlertid muligt, at ikke alle metastatiske cancer celletyper kan reagere på IgG1-iS18 ​​behandlinger. Det bliver derfor nødvendigt at udføre disse metastatiske undersøgelser af forskellige cancertyper, for at få indsigt i anvendelsen af ​​antistoffet som en alternativ bredspektret terapeutisk antistof til behandling af forskellige cancertyper. Således blev denne undersøgelse udført med henblik på at fastslå, om IgG1-iS18 ​​er i stand til markant nedsættelse klæbemidlet og invasive potentiale leukæmi og leverkræft celler, derfor giver mulighed for antistoffet, der skal anvendes som en alternativ terapeutisk værktøj i behandlingen af disse to kræftformer.

Materialer og metoder

Cell kultur og betingelser

humant brystadenocarcinom (MCF-7), lever carcinom (Huh7) og leukæmi (K562) cellelinier opnået fra ATCC blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med højt glucoseindhold (4,5 g /l) suppleret med 10% føtalt kalveserum og 1% penicillin /streptomycin ved 5% CO

2 og 37 ° C.

Reagenser og antistoffer

Matrigel anvendes til celleinvasion assays er afledt af Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) muse sarkom og blev opnået fra BD Biosciences.

laminin-1used for celleadhæsionsassays blev opnået fra Sigma-Aldrich.

chloramphenicolacetyltransferase (CAT) antistof blev opnået fra Sigma-Aldrich.

IgG1-iS18 ​​blev fremstillet rekombinant i et mammalt ekspressionssystem som rapporteret af

Zuber et al., (2008)

konfokal mikroskopi

for at visualisere placeringen af ​​LRP /LR på celleoverfladen, blev konfokal mikroskopi ansat. Celler blev først podet på dækglas og får lov til at nå 70% konfluens. Celler blev fikseret i 4% paraformaldehyd i PBS i ca. 15 minutter, efterfulgt af flere vaske med PBS. Celler blev blokeret i 0,5% BSA i PBS i 5-10 minutter. Efter én PBS vask blev overskydende PBS blottet off. Dækglas indeholdende celler blev anbragt på et objektglas (med celler vender opad), og dette blev efterfulgt af tilsætning af primært antistof IgG1-iS18 ​​(1:100) fortyndet i 0,5% BSA. Indsæt en inkubation natten over ved 4 ° C blev dækglassene skyllet tre gange i PBS /BSA. Efter tilsætning af FITC-koblet sekundært antistof, der var blevet fortyndet i 0,5% BSA, blev inkubation i mørke tilladt i 1 time. Efterfulgt af tre gange vask som før, blev DAPI fortyndet i PBS indgives derefter i 5-10 minutter for at tillade farvning af kernen. Celler blev til sidst vasket en gang i PBS alene og monteret på et rent objektglas under anvendelse GelMount (Sigma-Aldrich). blev tildelt en periode på 45 minutter for at tillade indstilling skal finde sted.

Flowcytometri

Kvantificering af celleoverflade niveauer af LRP /LR blev udført under anvendelse af flowcytometri. EDTA (5 mM) i PBS blev anvendt til at lette frigørelse af adhærente celler, der blev efterfulgt af centrifugering ved 1200 rpm, 10 min. Celler blev efterfølgende fastsat ved at resuspendere celler i PFA i 10 minutter ved 4 ° C. Celler blev igen centrifugeret i 1X PBS som tilladt til fremstilling af fem cellesuspensioner, en til hvilken intet antistof blev tilsat (og tjener således som det ufarvede kontrol), en til hvilken anti-CAT antistof blev tilsat (til brug som en isotype kontrol) og en til hvilken anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​blev tilsat. De resterende to cellesuspensioner inkuberet kun i PBS med henblik på at blive anvendt som negative kontroller for IgG1-iS18 ​​og anti-CAT antistof. Alle suspensioner blev inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Efter tre vasketrin med 1X PBS, gede-anti-humant phycoerythrin (PE) -coupled sekundært antistof (Beckman Coulter) blev tilsat til cellesuspensionen indeholdende IgG1-iS18 ​​primært antistof samt en af ​​de suspensioner, som blev inkuberet i PBS alene . Cellesuspensionen, der blev inkuberet med anti-CAT antistof samt den tilbageværende cellesuspension, som blev inkuberet alene i PBS, blev begge suppleret med en gede-anti-kanin-allophycocyanin (APC) -coupled sekundært antistof efterfulgt af yderligere 1 times inkubation periode af alle cellesuspensioner. Endvidere blev tre efter inkubation vasker udføres, og cellesuspensioner blev analyseret under anvendelse af BD Accuri C6 flowcytometer. Eksperimenter blev udført tre gange og gentages mindst tre gange.

SDS PAGE og Western blotting

Total LRP /LR niveauer blev bestemt ved anvendelse af natriumdodecylsulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE ). Til udførelse af SDS-PAGE, blev 10 ug totalt anvendte protein. Proteiner, der blev adskilt efter størrelse ved SDS-PAGE blev derefter identificeret ved anvendelse af specifikke antistoffer i processen med Western blotting. Proteinerne løst på polyacrylamidgel blev overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran under anvendelse 1X transfer buffer (20% methanol i 192 mM glycin og 25 mM Tris) i 45 minutter ved 350 mV og en halvtør overførsel apparat. Blokeringsbuffer (3% BSA i 1X PBS Tween) blev derefter anvendt for at blokere den blottede membran i 1 time. Når blokeret, blev membranen probet med anti-LRP /LR specifikt primært antistof IgG1-iS18 ​​(1:10000) i 1 time. Inden inkubation af membranen med gede-anti-human-peroxidase (1:5000) sekundært antistof blev tre vaske med 1X PBS Tween udført. Yderligere tre vaske i 1X PBS Tween blev udført efter inkubering i det sekundære antistof, efterfulgt af påvisning af HRP under anvendelse af et forstærket kemiluminescerende substrat (Thermo Scientific). Den resulterende fluorescens blev udviklet og fastgjort på en røntgenfilm. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentages mindst 3 gange.

Vedhæftning assay

For at vurdere den klæbende potentiale varierende tumorigene cellelinjer til basalmembranen

in vitro

, laminin-1 (10 ug /ml) (BD Biosciences) blev anvendt til at coate 96 mikrobrøndsplader, efterlader ikke-coatede brønde, der skal anvendes som negative kontroller. Efter overtrækning af brøndene i 1 time og vask med 0,1% BSA i DMEM blev andre proteinbindingssteder på mikrobrøndsplade blokeret ved anvendelse af 100 pi 0,5% BSA i DMEM i en time. Celler blev suspenderet i serumfrit dyrkningsmedium og tilsat til brønde med en tæthed på 4 x 10

5 celler /ml med henblik på at vurdere adhæsion potentiale. Endvidere celler, der er blevet præ-inkuberet med IgG1-iS18 ​​(0,2 ug /ml) og med anti-CAT (Sigma, 0,2 ug /ml) antistof som negativ kontrol blev tilsat til de relevante brønde for at undersøge virkningerne af antistofferne på adhæsion potentiale af cellerne. Pladerne blev inkuberet ved 37 ° C i 1 time og derefter blev ikke-adhærente celler vaskes bort med PBS, og adhærente celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 10 minutter. Adhærerende celler blev farvet med 0,1% krystalviolet. Pletten blev ekstraheret under anvendelse af 1% SDS, og absorbansen af ​​den ekstraherede prøve ved 550 nm blev analyseret som et mål for den klæbende potentiale. Eksperimenter blev udført tre gange og gentages mindst tre gange.

Invasion assay

In vitro

analyse af evnen af ​​tumorigene cellelinjer at invadere basalmembranen blev gennemført ud ved hjælp af ECM-lignende Matrigel. Serumfrit koldt kulturmedium (DMEM) blev anvendt for at fortynde Matrigel og denne fortyndede gel blev dispenseret på den øvre kammer i et 24 transwell plade (BD Falcon, 8 um porestørrelse). Denne gel blev derefter lov til at størkne i ca. 5 timer ved 37 ° C. Efter at være blevet høstet, blev cellerne resuspenderet i serumfrit dyrkningsmedium med en tæthed på 1 x 10

6 celler /ml. Antistofbehandlinger krævede celler, der skal inkuberes med IgG1-iS18 ​​(0,2 ug /ml) eller den negative kontrol anti-CAT (Sigma, 0,2 ug /ml) antistof. Celler blev efterfølgende fyldt på den øvre Matrigel-dækket kammer og inkuberes i 18 timer. Det nedre kammer blev fyldt med 500 pi dyrkningsmedier indeholdende 10% FCS (for testen) uden FCS (til kontrol) og inkuberet ved 37 ° C i 18 timer. Dette blev efterfulgt af aspiration af medierne i den nedre og øvre kammer. Ikke-invasive celler blev derefter fjernet ved anvendelse af en vatpind. De resterende invasive celler blev derefter vasket med 300 pi PBS og fastgøres ved hjælp af 300 pi 4% paraformaldehyd, 10 min. Celler blev farvet under anvendelse af 0,5% toluidinblåt farvestof og efter ekstraktion af farvestoffet anvendelse af 1% SDS, blev absorbansen derefter målt ved 620 nm med en ELISA-læser. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentages mindst tre gange.

Statistiske evalueringer

De to-tailed t-test med et konfidensinterval på 95% blev anvendt til at analysere de data , med p-værdier på mindre end 0,05 betragtes signifikant. Omfanget eller graden af ​​association mellem LRP /LR niveauer på celleoverfladen og invasive /klæbende potentiale blev målt ved hjælp af Pearsons korrelationskoefficient. Den Pearsons korrelationskoefficient blev også anvendt til at måle korrelationen mellem klæbemidlet og invasive potentiale af cellelinierne. En positiv koefficient var en indikation af direkte proportionalitet mellem de to variable, mens en negativ koefficient underforstået omvendt proportionalitet.

Resultater

Liver cancer og leukæmi celler afslører LRP /LR på celleoverfladen

Pivotal til forekomsten af ​​metastase er samspillet mellem laminin-1 og LRP /LR på celleoverfladen. Derfor var det nødvendigt at visualisere celleoverflade LRP /LR som et middel til bekræftelse af, at celler faktisk gøre display LRP /LR på deres overflade. Begge tumorigene cellelinjer, samt den dårligt-invasiv brystcancer kontrol, afslørede LRP /LR på celleoverfladen som afbildet i figur 1 a). Den grønne fluorescens i billederne nedenfor er vejledende for celleoverfladen LRP /LR som celler var ikke-permeabiliseres og det sekundære antistof viste sig at ikke binde ikke-specifikt, hvilket bekræftes af de afbildede i Fig.1 b) og Fig.1 kontrol c) nedenfor. Anti-CAT antistof blev anvendt som en negativ kontrol på grund af sin evne til at binde specifikt til chloramphenicolacetyltransferase (CAT), som er et bakterielt protein og er derfor fraværende i pattedyrceller. Salg

Celler var ikke-permeabiliseret med henblik på at muliggøre visualisering af celleoverfladen. a) Celler blev mærket med primært antistof IgG1-iS18 ​​og et FITC-koblet sekundært antistof. b) Celler blev mærket med anti-chloramphenicol acteyltranferase (CAT) antistof som negativ kontrol. c) Celler blev mærket kun med FITC-koblet sekundært antistof for at bekræfte, at det sekundære antistof ikke binder ikke-specifikt.

Høje procentdele af tumorigene celler udviser LRP /LR på celleoverfladen

Selvom konfokal mikroskopi bekræftede, at cellelinierne gør faktisk display LRP /LR på deres celleoverflade, blev yderligere kvantificering af celleoverflade niveauer af LRP /LR påkrævet. Flowcytometri blev anvendt til denne kvantificering.

Som vist i figur 2 A, C og E, alle tre tumorigene cellelinjer afslørede høje procentdele af celler i en specifik population, der viser LRP /LR på celleoverfladen, med skiftet mellem de to toppe i hver graf indikerer en ændring i fluorescensintensitet som følge af den celle-overflade-farvning af cellerne med anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​og fluorochrom-koblede sekundære antistof. HUH-7 liver cancerceller udviste en højere procentdel af celler, der udviser LRP /LR på celleoverfladen i forhold til K562 leukæmiceller samt dårligt-invasiv brystcancer (MCF-7) kontrol cellelinie. Fig. 2 B, D og F indeholder derudover den ufarvede kontrol og denne kontrol tjente til at vise, at PE sekundære antistof ikke binder ikke-specifikt. Forskydningerne i fluorescensintensitet af ufarvede, APC kun og anti-CAT-APC mærkede celler (de negative kontroller) er repræsenteret i fig S1. Det er også bemærkelsesværdigt at tilføje, at celle debris og celleaggregater blev udelukket fra analysen, som de var uden for det definerede port (fig. S3).

Den første top i grafer A, C og E er repræsentativ for ikke- mærkede celler, dvs. celler mærket med gede-anti-humant PE-koblet sekundært kun antistof, hvorimod den anden top er indikativ for celler mærket med både anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​og det sekundære antistof, både ved en koncentration på 30 ug /ml. Grafer B, D og F skildrer optagelsen af ​​et uplettet kontrol til at vise ingen ikke-specifik sekundært antistof binding. Eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentaget mindst tre gange med 20 000 celler tælles per prøve.

Liver cancer celler udviser signifikant højere og leukæmiceller viser signifikant lavere celleoverflade LRP /LR niveauer sammenlignet med dårligt invasive brystcancerceller

Udover den procentdel af celler, der udviser LRP /LR på deres celleoverflade, blev den faktiske celleoverflade LRP /LR niveauer inden for en specifik cellepopulation analyseres ved anvendelse af flowcytometri. Det samme antal celler (20000 celler) inden for specifikke populationer af de tre tumorigene cellelinjer blev mærket med den samme koncentration (30 ug /ml) af tidligere nævnte primære og sekundære antistoffer i løbet af det samme tidsrum. Således mere LRP /LR, der er til stede på overfladen af ​​de tumorgene celler, ville den mere primære antistof IgG1-iS18 ​​binde til LRP /LR og efterfølgende vil den mere IgG-specifkke fluorochrom-koblet sekundært antistof binder til det primære antistof . Således vil de mediane fluorescensintensiteter (MFI) er forskellige mellem de tre cellelinier (tabel 1) og kan derfor anvendes som en indikator af celleoverflade LRP /LR niveauer. Det blev observeret, at i sammenligning med dårligt invasiv MCF-7 brystcancer kontrol cellelinie, liver cancer cells (HUH-7) viste højere niveauer af LRP /LR på deres celleoverflade (Fig.3). Derudover afslørede K562 leukæmiceller lavere celleoverflade LRP /LR niveauer i sammenligning med de MCF-7 celler (fig.3).

Celler blev mærket med primært antistof IgG1-iS18 ​​(01:25) og anti- menneskelig phycoerythrin (PE) sekundært antistof. 20000-celler blev analyseret i alle tre cellelinier, og medianen fluorescensintensiteter (MFI) blev anvendt som en indikator af celleoverflade LRP /LR niveauer. MFI-værdier er angivet i den sidste kolonne i tabel 1, blev anvendt til at konstruere dette tal og det er bemærkelsesværdigt, at MFI værdi svarende til MCF-7-cellelinje blev sat til 100%. Eksperimenter blev udført tre gange og gentages mindst tre gange. ** P = 0,0025, *** p. 0,0001

De mediane fluorescensintensiteter opnået efter anti-CAT mærkning og detektion viser, at der ikke er nogen væsentlig forskel i graden af ​​celle- overflade CAT-farvning i alle tre cellelinier (fig. S2)

Samlet LRP /LR niveauer ikke signifikant forskellig mellem de tumorigene cellelinjer

Som tidligere nævnt, LRP /LR ikke udelukkende forekomme på celleoverfladen men er yderligere ses i kernen og cytosolen, blev derfor Western blot-analyse udført for at vurdere den samlede LRP /LR niveauer. Eksperimenter blev udført tre gange og gentaget tre gange. En repræsentativ blot er afbildet i figur 4. Det er bemærkelsesværdigt at konstatere, at kun 37 kDa laminin receptor precursor kunne påvises ved anvendelse af anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18.

Anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​blev anvendt som primært antistof i forbindelse med et sekundært HRP-koblet antistof. β-actin var ansat som lastning kontrol.

Efter påvisning af LRP, kvantificering af de samlede LRP niveauer var påkrævet og densitometri blev ansat til at opnå dette. Fig.5 viser densitometriske analyse, som afslørede, at statistisk set var der ingen signifikant forskel observeret i samlede LRP niveauer mellem de tre tumorigene cellelinjer.

Kvantificering blev udført under anvendelse densitometri og data er repræsentative for forsøg udført i tre eksemplarer og gentaget tre gange. Ikke-signifikant (NS): p. 0,05

IgG1-iS18 ​​hæmmer klæbende potentiale lever kræftceller

Pivotal til indledningen af ​​invasionen er vedhæftningen af ​​en tumorigen betydeligt celle til basalmembranen gennem LRP /LR-laminin-1-interaktionen, som den giver mulighed for andre interaktioner at forekomme at lette nedbrydning af basalmembranen. Celler blev inkuberet med IgG1-iS18 ​​og anti-CAT-antistoffer (0,2 mg /ml) og efter en time, absorbanslæsninger af den resulterende opløsning var indikativ for graden af ​​cellebinding til laminin-1-coatede plader.

som vist i figur 6, den kontrolprøve uden antistof tilladt til bestemmelse af klæbemidlet potentiale af cellelinierne, og det blev observeret, at både levercancer (HUH-7) samt leukæmiceller (K562) var mere klæbende end de dårligt-invasiv brystcancer (MCF-7) kontrolceller. Imidlertid lgG1-iS18 ​​var kun effektiv til at hindre den klæbende potentiale for leverkræft celler og ingen signifikant reduktion i adhæsion blev observeret for leukæmi celler behandlet med anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18. Som forventet, har anti-CAT kontrol antistof ikke have en væsentlig indvirkning på den selvklæbende potentiale tumorigene cellelinjer

p-værdier, der er vist i rød (* p = 0,0238, *** p = 0,0002). indikerer stigningen i adhæsive potentiale for leverkræft (HUH-7) og leukæmi (K562) -celler sammenlignet med brystcancer (MCF-7) kontrol cellelinie. p-værdier er vist i sort (** p = 0,0031; *** p = 0,0005) repræsenterer reduktionen i klæbende potentiale efter behandling af celler med egnede antistoffer. En reduktion af 63,35% i klæbemidlet potentiale blev observeret efter administration af IgG1-iS18 ​​til HUH-7 liver cancerceller. Dataene repræsenterer eksperimenter udført i tre eksemplarer og gentages mindst tre gange.

Invasion af Matrigel ved leverkræft celler (HUH-7) hæmmes betydeligt af anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​

invasion af basalmembranen betragtes som en forudsætning for udviklingen af ​​en metastatisk cancer, dermed invasion assays under anvendelse af en Matrigel, som efterligner komponenterne i basalmembranen, blev udført for at bestemme den invasive potentiale tumorigene cellelinjer. I lighed med de adhæsionsassays, den kontrolprøve uden antistof tilladt for bestemmelse af den invasive potentiale af cellelinierne. Desuden blev cellerne behandlet med anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​og anti-CAT antistof (0,2 mg /ml).

Som vist i fig.7, liver cancer (HUH-7) celler er betydeligt mere invasive i forhold til den dårligt invasiv brystcancer (MCF-7) kontrol cellelinie, mens leukæmi (K562) -celler viste en betydeligt lavere invasiv potentiale sammenlignet med kontrollen. Desuden IgG1-iS18 ​​held hæmmet invasive potentiale for leverkræft (HUH-7) celler, mens ingen signifikant resultat blev observeret for leukæmi celler. Som forventet havde den anti-CAT antistof kontrol ikke i væsentlig grad invasive potentiale af de tumorgene cellelinier

p-værdier er angivet med rødt (* p = 0,0485; ** p = 0,0053). Repræsenterer ændringerne i invasiv potentiale cellelinjer sammenlignet med MCF-7 kontrol, samtidig p-værdier er vist i sort (* p = 0,0214; ** p = 0,0091) er indikative for virkningen af ​​egnede antistoffer på den invasive potentiale af cellelinierne. Ved indgivelse af IgG1-iS18 ​​til HUH-7 liver cancerceller, blev en reduktion på ca. 39.75% observeret vedrørende invasive potentiale af cellerne. Data repræsenterer forsøg udført i tre eksemplarer og gentaget mindst tre gange.

Diskussion

Flere undersøgelser har vist, at, på celleoverfladen, forskellige tumorigene cellelinjer udviser en overekspression af 37 kDa /67 kDa LRP /LR, derfor tyder på, at LRP /LR-laminin-1 interaktion kan være afgørende for cancerceller til at undergå metastase [21]. Det kan derfor være egnede til at inhibere denne interaktion som et middel til at hæmme adhæsion og invasion – to arrangementer fundet at være afgørende for forekomsten af ​​processen med metastase. En undersøgelse foretaget af Zuber

et al

har vist, at IgG1-iS18 ​​antistof er meget specifik for LRP /LR [18]. Desuden har nyere forskning vist, at anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​signifikant hæmmer limen og invasive potentiale livmoderhalskræft [4], lunge [4], prostata [4], kolon [4], bryst [20], og øsofagus [20] kræftceller. Den foreliggende undersøgelse undersøgte rollen som LRP /LR i adhæsion og invasion af leverkræft (HUH-7) samt leukæmi (K562) -celler, og havde til formål at fastslå, om anvendelse af anti-LRP /LR specifikt antistof IgG1-iS18 ​​signifikant reducerer klæbemidlet og invasive potentiale af disse to tumorigene cellelinjer.

Oprindeligt afslørede konfokal mikroskopi, at alle tre tumorigene cellelinjer faktisk display LRP /LR på deres celleoverflade (fig. 1a). Imidlertid er denne teknik begrænset af det faktum, at det ikke er kvantitativ og var behov for yderligere analyser for at fastslå de niveauer, ved hvilke LRP /LR vises på celleoverfladen af ​​disse tumorigene cellelinjer.

betydelig høj procentsatser ( 87%) af alle tre tumorgene cellelinier, nemlig HUH-7, K562, og MCF-7 (dårligt invasiv brystcancer kontrol) celler vises LRP /LR på deres celleoverflade (fig.2). Desuden blev det konstateret, ved analyse af forskelle i median fluorescensintensiteter at i sammenligning med MCF-7 kontrol cellelinie, liver cancer cells (HUH-7) viste signifikant højere og leukæmiceller (K562) afslørede signifikant lavere celleoverflade LRP /LR niveauer (fig.3). Som tidligere nævnt, LRP /LR spiller væsentlige roller i adhæsion, invasion, proliferation og migration af celler [9]. Se, at HUH-7 cellelinie er kendt for at være invasiv og K562 forstås at være en suspension cellelinje (ATCC), kan celleoverflade niveauer af LRP /LR, der konstateres være korrelerer med den invasive potentiale af disse celler