PLoS ONE: Molekylær heterogenitet en Patient-afledt glioblastoma Xenoline reguleres af forskellige Cancer Stem Cell Populations

Abstrakt

malignt glioblastom (GBM) er en særdeles aggressiv hjernetumor med en dystre prognose og begrænsede behandlingsmuligheder. Genomisk profilering af GBM prøver har identificeret fire molekylære undertyper (Proneural, Neural, Klassisk og Mesenchymale), der kan opstå fra forskellige glioblastoma stilk-lignende celle (GSC) populationer. Vi har tidligere vist, at vedhængende kulturer af GSCS dyrket på laminin-coatede plader (Ad-GSCS) og sfæroide kulturer af GSCS (Sp-GSCS) havde høj ekspression af stamcelle markører (CD133, Sox2 og nestin), men lav udtryk for differentiering markører (βIII-tubulin og gliafibrillært acid protein). I den foreliggende undersøgelse, vi kendetegnet GBM tumorer produceret af subkutan og intrakranial injektion af Ad-GSCS og Sp-GSCS isoleret fra en patient-afledt xenoline. Selvom de dannede tumorer med identiske histologiske træk, afslørede genekspressionsanalyse at xenografter af Sp-GSCS havde en klassisk molekylær subtype svarende til den af ​​bulk tumorceller. I kontrast xenografter af Ad-GSCS udtrykte en Mesenchymale gen signatur. Adhærente GSC-afledte xenografter havde høj STAT3 og ANGPTL4 udtryk, og berigelse for stamcelle markører, transkriptionelle netværk og pro-angiogene markører er karakteristiske for den Mesenchymale undertype. Undersøgelse af kliniske prøver fra GBM patienter viste, at STAT3 udtryk var direkte korreleret med ANGPTL4 udtryk, og at øget ekspression af disse gener korreleret med dårlig patient overlevelse og ydeevne. En farmakologisk STAT3 inhibitor ophævet STAT3 binding til ANGPTL4 promotoren og udstillet anticancer aktivitet

in vivo

. Derfor Ad-GSCS og Sp-GSCS produceret histologisk identiske tumorer med forskellige genekspressionsmønstre, og en STAT3 /ANGPTL4 vej er identificeret i glioblastom, der kan tjene som et mål for terapeutisk intervention

Henvisning:. Garner JM, Ellison DW, Finkelstein D, Ganguly D, Du Z, Sims M, et al. (2015) Molekylær heterogenitet en Patient-afledt glioblastoma Xenoline reguleres af forskellige Cancer stamcellepopulationer. PLoS ONE 10 (5): e0125838. doi: 10,1371 /journal.pone.0125838

Academic Redaktør: Ilya Ulasov, svensk Neuroscience Institute, UNITED STATES

Modtaget: 18. december 2014 Accepteret: 25 marts 2015; Udgivet: 8. maj 2015

Copyright: © 2015 Garner et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle microarray filer er tilgængelige fra GEO-databasen (tiltrædelse nummer: GSE65576).

Finansiering: Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra National Institutes of Health CA133322 (LMP og AMD), Department of Defense W81XWH-11- 1-0533 (LMP), den Cancer center Support Grant 21766 fra National Cancer Institute og Assisi Foundation of Memphis (AMD), ved Muirhead Chair Endowment (LMP) i UTHSC og af de amerikanske libanesiske syriske associerede Charities (DWE, AMD). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hjernetumorer udgør en vigtig årsag til kræft-relaterede sygelighed og dødelighed i USA, med maligne gliomer er blandt de mest aggressive og vanskelige at behandle [1]. Selv om de sjældent metastaserer, maligne gliomer er lokalt invasive, meget vaskulære tumorer med store områder af nekrose og hypoxi. Prognosen for patienter med gliom er dårlig. De fleste patienter med glioblastoma multiforme (GBM), den mest alvorlige kvalitet af gliom (WHO grad IV) og de mest almindelige gliom undertype hos voksne, dør inden for 2 år efter diagnose, og patientoverlevelse er forblevet dismally lav i årtier [1]. Kirurgisk resektion af GBM fortsat den primære behandling modalitet. Præsentere adjuvans terapier, herunder kemoterapi og strålebehandling, kun give lille forbedring i sygdomsforløbet og udfaldet [2]. Patienter med tilbagevendende GBM har en endnu mere dystert prognose [3].

glioblastom tumorer er en heterogen blanding af cellulære og molekylære undertyper, som kan ligge til grund for den manglende evne til konventionelle og målrettede behandlinger væsentligt påvirke patientresultater. Genomisk profilering har identificeret fire molekylære undertyper af glioblastom: Proneural, neurale, Klassisk og mesenchymale [4]. Den Proneural undertype er forbundet med PDGFRA abnormiteter, IDH1 og TP53 mutationer, og er normalt findes i yngre patienter. De fleste gliomer er klassificeret som Proneural grundet deres oligodrendrocytic signatur [5-7]. Genekspressionen af ​​det neurale klasse af gliom mest ligner normalt hjernevæv, og har en stærk berigelse for gener differentielt udtrykt af neuroner. Den klassiske gliom undertype har en astrocytisk signatur; EGFR-amplifikation er almindeligt observeret i denne tumortype samt høj ekspression af Nestin (en neural precursor og stamcelle markør), og Notch og Sonic hedgehog signalering pathways. Gliomer er klassificeret som Mesenchymale udviser højere udtryk for mesenkymale markører, MET og CHI3L1 og gener i NF-KB-vejen, såsom TRADD, RELB og TNFSF1A, samt sletning af NF1 [8, 9]. Tumorer med et Mesenchymale gen signatur tendens til at være mere aggressive, meget modstandsdygtige over for terapi, føre til en højere sats for tilbagefald og har dårligere overordnede resultater end tumorer i Klassisk, Proneural og Neural subtype [8]. Derfor er en mere detaljeret molekylær forståelse af Mesenchymale undertype i GBM er afgørende at forbedre terapeutisk design og patient resultat.

tumorigen proces i glioblastom tilsyneladende igangsat og påført en sjælden underpopulation af GBM stamceller-lignende celler ( GSCS) [10-12]. Som det er tilfældet med normale stamceller, kan GSCS forny sig selv og undergår differentiering, men de har høj tumorfremkaldende kapacitet og terapeutisk modstand [13]. Disse stamceller-lignende celler er sædvanligvis isoleres baseret på deres evne til at vokse som flercellede, adhærerende kugler fra enkeltcelle-suspensioner [14, 15], som vi betegner som klumpformet GBM stamceller-lignende celler (SP-GSCS). Men udvidelse af Sp-GSCS er teknisk udfordrende, og som sfærer større differentieret afkom vises og døende celler ophobes under området kerne. Som en alternativ fremgangsmåde, adhærente GSCS isoleret fra GBM (Ad-GSCS) og dyrket i kemisk defineret medium på laminin-overtrukket vævskulturkolber vise stamcelle egenskaber og initiere high-grade gliomer efter xenotransplantation [16].

i nærværende rapport blev Ad-GSCS og Sp-GSCS isoleret fra en GBM patient-afledt xenoline (PDX), der har den klassiske gen signatur. Når de injiceres subkutant i flankerne eller orthotopisk ind i hjernen på immunkompromitterede mus, blev Ad-GSCS og Sp-GSCS sig at have markant forbedret tumorfremkaldende aktivitet (TIA) sammenlignet med bulk-tumorceller, og danne tumorer, der viser identiske histologiske træk . Notatet mens begge GSR populationer

in vitro

har en mesenkymale gen signatur, Sp-GSCS producere tumorer med en klassisk gen signatur; således de rekapitulere de molekylære egenskaber af den oprindelige GBM PDX. I modsætning hertil Ad-GSCS producere tumorer med en mesenchymal gen signatur. Udover opreguleres ekspressionen af ​​mange gener er typiske for mesenchymale underklasse, tumorer fremstillet af Ad-GSCS viste opreguleret ekspression af STAT3 og angiopoietin lignende-4 (ANGPTL4). STAT3 er en vigtig transskription faktor, der spiller en væsentlig rolle i onkogenese. ANGPTL4 er blevet rapporteret at virke ikke kun som en tumorsuppressor [17], men også som en forstærker af tumormetastase og angiogenese [18]. Mest interessant, en farmakologisk STAT3 inhibitor blokeret STAT3 binding til ANGPTL4 promotor, og

in vivo

antitumoraktivitet i Ad-GSC xenografter.

Materialer og metoder

Cell kultur

Den menneskelige GBM6 patient-afledt xenograft (PDX) af voksne glioblastom væv blev leveret af Dr. C. David James, (Institut for neurologiske Surgery, University of California, San Francisco) [19], og løbende vedligeholdt som subkutane xenotransplantater i fem uger gammel mand NOD.Cg

Prkdc

scid

Il2rg

tm1Wjl

/SzJ (NSG ) mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Cellekulturer af GBM6 PDX blev afledt fra hakket, frisk høstet tumorvæv. Kortfristede GBM6 kulturer af differentierede bulk-tumorceller blev dyrket som adhærente monolag for 2 til 5 passager i DMEM (Cellgro, Herndon, VA) suppleret med 10% varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Hyclone Labs, Thermo Scientific, Rockford, IL) , 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Ad-GSCS og Sp-GSCS blev opretholdt i Neurobasal-A medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) indeholdende 2% B27 supplement, 2 mM L-glutamin, 100 enheder /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, EGF (20 ng /ml), og basisk FGF (40 ng /ml). Til isolering af Ad-GSCS blev dyrkningskolber coatet med 100 ug /ml poly-D-lysin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) i 1 time efterfulgt af overtrækning med 10 ug /ml laminin (Gibco, Life Technologies Inc. , Grand Island NY) i 2 timer før anvendelse. Ad-GSCS blev udsået i 75 cm

2 kolber, vokset til sammenløb, dissocieret med HyQTase (Thermo Scientific, Videnskabelige, Rockford, IL), og opdelt i en 1: 3-forhold. Til isolering af Sp-GSCS blev gliom celler dissocieret med HyQtase og belagt i ultralav adhæsion kolber.

subkutane implanteret

Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med en undersøgelse protokol godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Tennessee Health Science center. Glioblastom xenografter blev etableret i fem uger gammel mand NOD.Cg-

Prkdc

scid

Il2rg

tm1Wjl

/SzJ (NSG) mus (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ved direkte flanke injektion af celler (1 x 10

6) transduceret med luciferase lentivirus konstruktioner [20]. Tumorer blev målt to gange ugentligt med en håndholdt skydelære. For bioluminescens billeddannelse blev mus injiceret intraperitonealt med d-luciferin (luciferase-substrat), afbildet på IVIS

in vivo

billeddannende system (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA), og fotoniske emissioner vurderet ved anvendelse Living billedsoftware . For at bestemme virkningen af ​​STAT3-inhibering, blev engang detekterbare tumorer bestemt ved caliper måling (sædvanligvis inden for 2-ugers celle injektion), WP1066 (40 mg /kg) i DMSO /Polyethylenglycol blev leveret hver anden dag ved intratumoral injektion. Denne dosis af WP1066 har tidligere været anvendt i prækliniske

in vivo

undersøgelser [21-23].

ortotopisk injektioner

Dyreforsøg blev udført under etablerede retningslinjer og tilsyn med St. Jude Children Research Hospitals Institutional Animal Care og brug Udvalg, som det kræves i USA dyreværnsloven og National Institutes of Health politik at sikre korrekt pasning og anvendelse af forsøgsdyr til forskning. Bedøvede (ketamin /xylazin) CB17 SCID-mus blev anbragt på stereotaktisk udstyr, hvor hovedbunden blev prepped ved hjælp af alkohol og iod podninger og kunstig tåre gel påføres øjnene. Efter hovedbunden udskæring, blev en rektangulær kraniel vindue skåret ud og dura blev fuldstændig fjernet fra overfladen af ​​hjernen, og 1×10

6 celler suspenderet i 10 pi medium blev injiceret ca. 2,5 mm dyb i den rigtige motor cortex. Det excision webstedet blev lukket med hud lim, og alle dyr blev overvåget nøje 24 timer postoperativt. Tumorvæv blev høstet ved grov inspektion af injektionsstedet, som let blev visualiseret ved anvendelse af et kraniel vindue. Når dette område blev identificeret, omhyggelig dissektion tilladt subtotal fjernelse af tumorvæv alene; dog blev der ikke yderligere test udført for at sikre ingen museceller blev inkluderet i prøven.

genanalyse

Total RNA blev isoleret ved at behandle vævshomogenater med Trizol efterfulgt af isolation med RNeasy Mini (Qiagen Inc., Valencia, CA). Prøverne blev indsendt for komplet mRNA-ekspression profilering til UTHSC Center of Genomics og bioinformatik (Memphis, TN) til mærkning og hybridisering til Menneske-HT12 BeadChips (Illumina Inc.). De microarray data er blevet deponeret i NCBI s Gene Expression Omnibus og er tilgængelige via GEO Series tiltrædelse nummer GSE65576 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE65576). Genekspression blev også målt på NCounter Analysis System (Nanostring Technologies, Seattle, WA) anvendelse af et panel af 230 humane cancerrelaterede gener. Kort fortalt blev total RNA blandet med par af opsamling og reporter sonder, hybridiseret på NCounter Prep Station, og rensede komplekser blev målt på NCounter digitale analysator. For at tage højde for forskelle i hybridisering og rensning blev data normaliseret til den gennemsnitlige tæller for alle kontrol spidser i hver prøve og analyseret med nSolver software. Genekspression mønstre var kvalitet kontrolleres af Principal Component Analysis (PCA). Generne blev statistisk testet af ulige varians t-tests. Den falske opdagelse sats (FDR) blev beregnet til at styre for flere sammenligninger bruger Partek Genomics Suite 6.6. Resultaterne blev visualiseret ved hjælp af STATA /MP 11.2. Desuden blev 3-5 (10 um) krøller skåret fra 24 glioblastom patient biopsiprøver (UTHSC Tissue Services Core), RNA isoleret ved anvendelse RECOVERALL Total Nucleic Acid Isolation Kit (Ambion), og gen-ekspression blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR .

Ingenuity Pathway Analysis (IPA)

IPA (Qiagen Inc., Valencia, CA) blev anvendt til at identificere kanoniske signalveje og funktionelle veje samt at producere netværk af forbundne gener afledt fra gener ændret i de analyserede sammenligninger. Her blev de rang-produkt-genereret gen lister ved hjælp af en 5% FDR uploadet til IPA-serveren som inputdata. IPA bruger pathway biblioteker afledt fra faglitteraturen. Statistik for funktionel analyse blev udført af Fischers eksakte test.

Histopatologi

Tumor væv produceres ved injektion af bulk tumorceller, Ad-GSCS og Sp-GSCS (fire separate tumorer for hver betingelse) blev fikseret i 10% neutral bufret formalin i 24 timer, indlejret i paraffinvoks, og snit på 5 um tykkelse. For hver prøve blev snit farvet ved anvendelse af en standard hematoxylin og eosin (H CHI31 5′-GTGAAGGCGTCTCAAACAGG-3 ‘(fremad), 5′-GAAGCGGTCAAGGGCATCT-3′ (tilbage); TRADD 5’-GCTGTTTGAGTTGCATCCTAGC-3 ‘(fremad), 5′-CCGCACTTCAGATTTCGCA-3′ (tilbage); NF1 5’-AGATGAAACGATGCTGGTCAAA-3 ‘(fremad), 5-CCTGTAACCTGGTAGAAATGCGA-3′ (tilbage); RelB 5’-CAGCCTCGTGGGGAAAGAC-3 ‘(fremad), 5′-GCCCAGGTTGTTAAAACTGTGC-3′ (tilbage); CASP4 5’-TTTCTGCTCTTCAACGCCACA-3 ‘(fremad), 5′-AGCTTTGGCCCTTGGAGTTTC-3′ (tilbage); FGFR3 5’-TGCGTCGTGGAGAACAAGTTT-3 ‘(fremad), 5′-GCACGGTAACGTAGGGTGTG-3′ (tilbage); PDGFA 5’-GCAAGACCAGGACGGTCATTT-3 ‘(fremad), 5′-GGCACTTGACACTGCTCGT-3′ (tilbage); EGFR 5’-CTACGGGCCAGGAAATGAGAG-3 ‘(fremad), 5′-TGACGGCAGAAGAGAAGGGA-3′ (tilbage); AKT2 5’-ACCACAGTCATCGAGAGGACC-3 ‘(fremad), 5′-GGAGCCACACTTGTAGTCCA-3′ (tilbage); Nestin 5’-GGCGCACCTCAAGATGTCC-3 ‘(fremad), 5’CTTGGGGTCCTGAAAGCTG-3’ (tilbage).

TCGA dataanalyse

For at undersøge forholdet mellem STAT3 og ANGPTL4 udtryk i human GBM hjernevæv, vi forespørges TCGA data portal for alle lav kvalitet gliom og GBM prøver med genekspression (BI_HT_HG-U113A Array datasæt), data samt ledsagende kliniske data. Datasættet blev filtreret for emner med udtryk data for STAT3, ANGPTL4 og kliniske data, hvilket giver et endeligt sæt af 466 individuelle lav kvalitet gliom prøver og 328 uafhængige GBM patientprøver. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Graphpad Prism.

Apoptose assay

induktion af apoptose blev overvåget ved flowcytometri (Accuri Model 6C) under anvendelse af Annexin V-FITC apoptosis afsløring kit (BD Pharmingen, San Diego, CA), ifølge producentens instruktioner.

chromatin immunoprecipitation

kromatin immunfældning (chip) blev udført under anvendelse chippen-i Express Enzymatisk kit (Active Motif, Carlsbad, CA) ifølge til producentens anvisninger. Kort fortalt kromatin af celler blev tværbundet med 1% formaldehyd (10 minutter ved 22 ° C), forskydes til en gennemsnitlig størrelse på ~ 200 bp, og derefter immunpræcipiteret med anti-STAT3 (Santa Cruz Biotechnology). Chip-PCR-primere blev udformet til at opformere en proksimal promotor region indeholdende en formodet STAT3 (-1369 til -1348) bindingssted i ANPTL4 promotoren. De anvendte primere var 5’CATTAAAGACCCTGGCGGTA -3 «(fremad), 5’GGATCACAGTCGTGTGAGGA -3« (tilbage).

Statistisk analyse

Mindst tre uafhængige forsøg blev udført i to eksemplarer og data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. ANOVA og post-hoc mindste signifikante forskel analyse eller Student

T

tests blev udført.

p

værdier 0,05 (*), blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Forskelle i de molekylære underskrifter fra GSCS dyrket in vitro

og som subkutane xenotransplantater

Glioblastoma er kendetegnet ved omfattende heterogenitet på cellulære og molekylære plan [24], hvilket kan afspejle tilstedeværelsen af ​​forskellige cancer stamceller populationer. I en tidligere undersøgelse isolerede vi Ad-GSCS og Sp-GSCS fra GBM6 PDX, og viste, at begge populationer havde høj ekspression af stamcellemarkører, såsom CD133, Sox2 og Nestin, men lav ekspression af differentieringsmarkører såsom βIII- tubulin og gliafibrillært syre protein sammenlignet med bulk-tumorceller [25]. Begge populationer opretholde en høj CD133 ekspression ( 85%) ved hjælp af flow cytometrisk analyse, selv når de blev holdt i serum-holdige medier i en uge, som tilvejebringer stærke beviser for, at disse GSCS repræsenterer en “sand” stamcelle befolkning, og at “stemness” er ikke en artefakt af medierne (serum versus vækstfaktorer). Begge populationer havde høj konstitutiv STAT3 og NF-KB-aktivering, hvilket resulterede i opregulering af Notch-vejen. Til mere fuldt ud at karakterisere de molekylære signaturer disse GSR befolkningsgrupper, blev RNA fremstillet ud fra biologiske gentagelser af GBM6 celler dyrket som enten kortsigtede kulturer af differentierede bulk-tumorceller blev Ad-GSCS eller Sp-GSCS, og hele genomet udtryk profilering udført på HT-12-ekspression Bead-Chips ved UTHSC center Genomics og bioinformatik. Hierarkisk klyngedannelse blev anvendt til at vurdere den differentielle ekspression af ~ 840 GBM subtype prædiktor gener [4]. Som vist i fig 1A, en Heatmap af variationen i ekspression af disse prædiktor gener viste, at celler dyrket

in vitro

under begge GSR betingelser udviste meget lignende udtryk profiler, hvilket var markant forskellig fra ekspressionsprofilen af ​​det stærkt differentierede bulk-tumorceller dyrket i serumholdigt medium. I overensstemmelse med vores tidligere fund [25], høj Nestin blev Sox2 og CD133-ekspression i både GSR populationer, mens βIII-tubulin og gliafibrillært syre protein blev udtrykt ved relativt lave niveauer. Selv de to GSR populationer blev dyrket under forskellige dyrkningsbetingelser (adhærent versus suspensionskultur), deres genekspressionsprofiler var meget ens. Vi derefter sammenlignet den matematiske varians blandt de forskellige data prøver ved PCA, der er et uovervåget analytisk metode svarende til faktor analyse, der er følsom over for alle årsager til variabilitet inden dataene. Visualisering af de første tre komponenter giver mulighed for kvalitetskontrol og den relative vurdering af variabiliteten af ​​replikater. Denne PCA visualisering giver også en vurdering af de kategoriske faktorer af interesse ved at demonstrere, om de data, naturligt aggregater af disse faktorer eller af en ukendt eller systematisk faktor ligesom batch. Når genekspression af GSR populationer og bulk tumorceller dyrket

in vitro

blev underkastet PCA-analyse, genekspressionsprofilerne i de to forskellige GSR kulturer blev også fundet at være forholdsvis ens, mens den for bulk-tumorceller dyrket

in vitro

blev markant anderledes (figur 1B).

RNA blev fremstillet af GBM6 bulk-tumorceller, Ad-GSC, og Sp-GSR kulturer samt fra subkutane tumorxenoplantater af disse injicerede celler. Biologiske dubletter blev kørt for hver prøve og data blev indsamlet og analyseret. A. Genekspression blev målt ved Illumina array og gener rapporteret i TCGA databasen blev analyseret. B. PCA plot repræsenterer sammenligning af gen underskrifter fra hver tilstand.

Vi derefter udførte hele genomet udtryk analyse på tumorer fremstillet af de forskellige GBM cellepopulationer. I korte, bulk tumorceller, Ad-GSCS og Sp-GSCS (1 x 10

6 celler) blev injiceret i flankerne af immunkompromitterede NSG mus, og en gang nåede et volumen på ~ 200 mm

3, tumorer var udskåret blev RNA fremstillet og underkastet microarray analyse. I modsætning til den

in vitro

fund, tumorer fremstillet af Ad-GSCS og Sp-GSCS havde markant forskellige udtryk profiler som det fremgår af heatmaps af genekspressionsprofilerne (Fig 1A) samt PCA af den gennemsnitlige genekspression (fig 1B). De tumorxenografter af de differentierede bulk-tumorceller og Sp-GSCS var yderst lignende, hvilket er i overensstemmelse med det fund, at Sp-GSCS genbefolke de GBM tumorer med genekspressionsprofiler næsten identisk med den for bulk-tumorceller [26]. Derfor, mens det gen ekspressionen af ​​Sp-GSCS og Ad-GSCS vokset

in vitro

er meget ens,

in vivo

molekylær signatur af tumor væv er helt anderledes. Disse resultater tyder på, at der findes særskilte stamcellepopulationer i GBM og fremme tumor heterogenitet.

Ad-GSR og Sp-GSC implanteret udtrykker distinkte molekylære profiler

For at afgøre, om de molekylære profiler af Ad-GSCS og Sp-GSCS svarede til nogen af ​​de fire molekylære undertyper af glioblastom sammenlignede vi ekspressionen af ​​~ 840 GBM prædiktor gener i vores celle og vævsprøver med den for 202 glioblastoma tumorvæv i TCGA database, som repræsenterer klassiske (hvide kugler) , Neural (sorte kugler), Proneural (blå kugler) og Mesenchymale (grå kugler) underklasser. Fig 2A viser som forventet, at de GBM tumorprøver danner fire relativt forskellige grupper som tidligere vist [4], men der er en vis overlapning mellem ekspressionsmønstre mellem disse fire underklasser. Genekspression profiler af Ad-GSCS (røde kugler) og Sp-GSCS (gule kugler) dyrket

in vitro

ligne den Mesenchymale GBM underklasse. I modsætning udtrykket profil af bulk GBM6 tumorceller dyrket

in vitro

(Orange kugler) er forbundet med den klassiske GBM undertype, hvilket er i overensstemmelse med, hvad der tidligere blev fundet (Y. Gillespie, personlig kommunikation). Vi undersøgte dernæst mønsteret for genekspression i flank tumorer i disse celler. Mest interessant, tumorer, der opstod fra Ad-GSCS udtrykte en Mesenchymale gen signatur, der ligner Ad-GSCS vokset

in vitro

. I modsætning hertil tumorer, der opstod i mus injiceret med Sp-GSCS havde en klassisk undertype signatur, der ligner det gen underskrift af tumorer afledt af bulk-tumorceller. Således Sp-GSCS og Ad-GSCS har lignende molekylære egenskaber (Mesenchymale underklasse)

in vitro

, som er forskellig fra bulk-tumorceller dyrket (Klassisk underklasse)

in vitro

. Når det injiceres i mus, disse GSCS danne molekylært distinkte tumorer. Ad-GSCS opretholde en Mesenchymale gen signatur

in vitro

in vivo

, mens Sp-GSCS genskabe tumoren med en klassisk gen signatur, der svarer til bulk-tumorceller.

A. Array analyse blev udført og sammenlignet med glioblastom molekylære underklasser; PCA kort skildrer den klassiske, mesenkymale, neurale, og proneural gen signaturer og genet underskrift GBM6 celler og tumorvæv afledt fra bulk tumorceller, Ad-GSCS og Sp-GSCS. B. og C. RNA blev isoleret fra tre individuelle tumorer afledt af GBM6 bulk-tumorceller, Ad-GSCS og Sp-GSCS (B), og fra disse celler dyrket

in vitro

(C) for at bestemme gen ekspression af molekylære markører ifølge den Mesenchymale (CHI3L1, TRADD, NF1, RelB og CASP4) og Klassisk (FGFR3, PDGFA, EGFR, AKT2 og Nestin) underklasse af glioblastom ved qPCR og normaliseret til actin-ekspression (n = 3). Fejl barer, S.D. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001.

For yderligere at karakterisere genekspression i Ad-GSCS og Sp-GSCS tumorxenoplantater, undersøgte vi ekspressionen af ​​gener tidligere definerede at være karakteristisk for den klassiske (FGFR3, PDFA, EGFR, AKT -2 og nestin) og Mesenchymale (CHI3L1, TRADD, NF1, RelB og CASP4) glioblastom undertyper [4]. RNA blev ekstraheret og puljet fra tre individuelle subkutane xenotransplantater afledt af bulk-tumorceller, Ad-GSCS eller Sp-GSCS, og ekspressionen af ​​disse markørgener blev bestemt ved qPCR. Figur 2B viser, at ekspressionen af ​​mesenchymale markører CHI3L1, TRADD og RelB er signifikant forhøjet i Ad-GSCS xenografter i forhold til tumorxenoplantater af bulk tumorceller og Sp-GSCS. I modsætning hertil tumor suppressor NF1, der nedreguleres i Mesenchymale glioblastom, udtrykkes ved relativt lave niveauer i tumorvæv fra Ad-GSCS sammenlignet med tumorer afledt af Sp-GSCS og bulk tumorceller. Mesenchymal markering, CHI3L1, i kombination med astrocytiske markører indikerer en epitelial-til-mesenkym overgang, der er blevet forbundet med aggressive, dedifferentierede tumorer [27]. Gener i TNF og NF-KB pathways, såsom TRADD og RelB, er stærkt udtrykt i den Mesenchymale subtype samt, muligvis som følge af øget nekrose og tilhørende inflammatoriske infiltrater [28]. Desuden er de klassiske markørgener FGFR3, PDGFA, EGFR og nestin alle udtrykt ved forholdsvis høje niveauer i tumorxenotransplantater af bulk tumorceller og Sp-GSCS, sammenlignet med xenografter af Ad-GSCS, hvilket er i overensstemmelse med PCA analyse klassifikation af tumorerne som klassisk undertype. I modsætning hertil er EGFR og Nestin udtrykt ved ekstremt lave niveauer i Ad-GSC tumorxenoplantater, hvilket er i overensstemmelse med deres klassificering som Mesenchymal tumorer. Signifikant EGFR amplifikation er observeret i 97% af Classical glioblastomer i TCGA databasen, men sjældent i andre undertyper. Den GBM6 xenograft er afledt af en patient med overekspression af VIII mutant af EGFR, og vores fund af høj EGFR i løs tumorceller og i tumorer afledt heraf er i overensstemmelse med EGFR overekspression. Det er dog yderst interessant, at tumorerne fra Ad-GSCS udtrykker relativt lave EGFR niveauer giver yderligere beviser for, at Ad-GSCS er en særskilt GSC befolkning. Baseret på disse resultater på differential markør genekspression i GSR xenografter, vi så undersøgt ekspressionen af ​​Mesenchymale og klassiske markørgener i bulk-tumorceller, Ad-GSCS og Sp-GSCS vokset

in vitro

. Som vist i figur 2C, er udtryk for de klassiske markørgener FGF3, PDGFA, EGFR og Akt2 markant nedreguleret i både GSR befolkninger i forhold til bulk-tumorceller dyrket

in vitro

. Derudover er der er forhøjet udtryk for de Mesenkymale markørgener TRADD, NF1 og RelB i både Ad-GSC og Sp-GSR befolkninger dyrket

in vitro

. Samlet vores undersøgelser viser, at Ad-GSCS er et molekylært særskilt GSC subpopulation sig fra Sp-GSCS. Ad-GSCS udviser en Mesenchymale gen signatur

in vitro

, og fremme dannelsen af ​​Mesenchymal tumorer

in vivo

.

Histopatologi af Sp-GSC og Ad-GSC xenografter

En vigtig egenskab ved GBM er mærket morfologiske heterogenitet i selve tumoren, samt blandt forskellige GBM tumorer. Den molekylære heterogenitet observeret i vores glioblastom implanteret af bulk tumorceller, Ad-GSCS og Sp-GSCS førte os til at undersøge histopatologi af disse tumorer. Fire individuelle subkutane tumorer afledt af hver celle kultur tilstand blev formalin-fikseret, paraffin-indlejret, og sektioneret. Hver prøve var H 0,05, ** p A. H 0,05, ** p * P 0,05, ** p * P 0,05, ** p * P 0,05, ** p