PLoS ONE: Identifikation af Special AT-Rich Sequence bindende protein 1 som en roman tumorantigen Anerkendt af CD8 + T-celler: Betydning for Cancer Immunotherapy

Abstrakt

Baggrund

Et stort antal menneskelige tumorassocierede antigener, der genkendes af CD8

+ T-celler i en human leukocyt antigen klasse i (HLA-i) -begrænset mode er blevet identificeret. Særlige AT-rige sekvens bindende protein 1 (SATB1) er højt udtrykt i mange typer af humane cancere som en del af deres neoplastisk fænotype, og opregulering af SATB1 ekspression er afgørende for tumor overlevelse og metastase, således dette protein kan fungere som en rationel mål for cancervacciner.

Metode /vigtigste resultater

Twelve SATB1-afledte peptider blev forudsagt af en immuno-informatik tilgang baseret på HLA-A * 02 bindende motiv. Disse peptider blev undersøgt for deres evne til at inducere peptidspecifikke T celle responser i perifere mononukleære blodceller (PBMC’er) opnået fra HLA-A * 02

+ raske donorer og /eller HLA-A * 02

+ kræftpatienter . Anerkendelse af HLA-A * 02

+ SATB1-udtrykkende cancerceller blev også testet. Blandt de tolv SATB1-afledte peptider, SATB1

565-574 hyppigt inducerede peptidspecifikke T-celle-responser i PBMC’er fra både raske donorer og cancerpatienter. Vigtigere, SATB1

565-574-specifikke T-celler genkendes og dræbte HLA-A * 02

+ SATB1

+ cancerceller i et HLA-I-begrænset vis.

Konklusioner /Betydning

Vi har identificeret en hidtil ukendt HLA-a * 02-begrænsede SATB1-afledt peptidepitop genkendes af CD8

+ T-celler, som igen, genkende og dræbe HLA-a * 02

+ SATB1

+ tumorceller. Den SATB1-afledte epitop identificeret kan anvendes som en diagnostisk markør samt en immun mål for udvikling af cancervacciner

Henvisning:. Wang M, Yin B, Matsueda S, Deng L, Li Y, Zhao W et al. (2013) Identifikation af Special AT-Rich Sequence bindende protein 1 som en roman tumorantigen Anerkendt af CD8

+ T-celler: Betydning for Cancer Immunterapi. PLoS ONE 8 (2): e56730. doi: 10,1371 /journal.pone.0056730

Redaktør: Silke Appel, Universitetet i Bergen, Norge

Modtaget: 26 oktober, 2012; Accepteret: 14 januar 2013; Publiceret: 21 feb 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Cancer Institute, National Institutes of Health og Cancer Research Institute, og The Methodist Hospital Research Institute. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

En af de mest lovende tilgange i behandlingen af ​​kræft er afhængig af at udnytte immunsystemet til at udrydde maligne celler [1], hvis succes afhænger i høj grad af identifikation af egnede tumor-associerede antigener (TAA) til at generere effektive cancervacciner. Det er blevet veletableret, at tumorceller udtrykker TAA’er der kan genkendes af CD8

+ T-celler i forbindelse med human leukocyt antigen klasse I (HLA-I) molekyler. Et stort antal TAA’er og TAA-afledte epitoper er blevet identificeret [2], [3], med nogle af disse proteiner og peptidderivater allerede i forsøg kliniske vaccine. De seneste godkendelser af immunterapi-vaccine /narkotika sipuleucel-T (Provenge) og Ipilimumab (Yervoy) af Food and Drug Administration (FDA) repræsenterer milepæle inden for cancerimmunterapi [4], [5]. Og et klinisk fase III forsøg med gp100 peptid til melanom også afkaster særdeles opmuntrende resultater [6]. Desuden arbejde fra to uafhængige grupper understregede betydningen af ​​tumor-specifikke antigener fremkalde immunreaktioner mod et udviklingsland tumor [7], [8], uden tvivl yderligere at intensivere bestræbelserne på at søge efter nye tumor antigener til kræft immunterapi.

på trods af sådanne lovende resultater, succes i kræft vaccine forsøg på hele har været sporadisk [9] – [11]. I de sidste par år har flere TAA’er, som udtrykkes i forskellige typer af neoplasi blevet identificeret [2], [3]. Men de fleste af antigenerne beskrevet hidtil kan undværes for overlevelse og vækst af tumorcellerne, med undtagelse af nogle få TAA’er såsom telomerase [12], survivin [13] og anti-apoptotiske medlemmer af Bcl-2 familie (Bcl-2, Bcl-X (L) og Mcl-2) [14]. Tumorceller kan derfor have undsluppet overvågning af immunsystemet gennem tab og /eller nedregulering af tumorantigener [15]. Følgelig målretning TAA’er, der er væsentlige for overlevelse og vækst af tumorceller kan bedre forhindre immunselektion af antigen-loss-varianter som følge af vaccination og effektivisering af cancerimmunterapi [15], [16]. Sådanne immunogene tumorantigener, der fremkalder minimal immune escape repræsenterer derfor de mest optimale vaccinekandidater til immunterapi af cancer.

Special AT-rige sekvens bindende protein 1 (SATB1) er en nuklear faktor, som fungerer som en global kromatin organisator. Det regulerer genekspression ved foldning kromatin i loop domæner og tethering DNA-domæner til SATB1 netstruktur [17]. SATB1 syntes at være overudtrykt i aggressive brystcancercellelinier men fraværende eller upåviselige i normale og immortaliserede humane mammae epitelceller, hvilket antyder en rolle SATB1 i omprogrammering chromatin organisation og i sidste ende transkriptionelle profiler af brysttumorer at fremme vækst og metastase [18] . Desuden blev højere niveauer af SATB1 ekspression forbundet med mange andre typer af cancer, herunder larynx pladecellecarcinom [19], endometrioide endometriecancer [20], hepatocellulært carcinom [21], rektal cancer [22], kutan malignt melanom [23 ], gastrisk cancer [24], [25], ovariecancer [26], prostatacancer [27], lungecancer [28] og gliom [29]. Opregulering af SATB1 i disse typer af cancere kan fremme tumorvækst og metastase. Da SATB1 er afgørende for tumorvækst /overlevelse og metastase, immun undslippe ved tab eller nedregulering af SATB1 ekspression kan forringe vedvarende tumorcellevækst og /eller metastase, hvilket således gør SATB1 et attraktivt mål for anticancer vacciner mod forskellige typer af cancere, der udtrykker SATB1.

i denne rapport beskriver vi identifikationen af ​​SATB1-afledte T-celle epitoper for T-celle genkendelse ved hjælp af en immuno-bioinformatik tilgang. Vi valgte tolv peptider, som blev forudsagt at binde til HLA-A * 02-molekyle. De blev syntetiseret og evalueret

in vitro

for deres evne til at stimulere T-celler i PBMC’er fra raske individer og /eller kræftpatienter baseret på interferon-γ (IFN-γ) frigivelse. Et af disse peptider, SATB1

565-574, viste sig at inducere IFN-γ udgivelse i perifere T-celler fra både raske og kræftpatienter. Vigtigere, SATB1

565-574 -specifikke T-celler var i stand til at genkende og dræbe HLA-A * 02

+, SATB1-udtrykkende tumorceller i en HLA-I-afhængig måde. Disse resultater viser gyldigheden af ​​immuno-bioinformatik tilgang og foreslår SATB1

565-574 kan repræsentere en ny tumor-specifikke epitop for kræft immunterapi.

Materialer og metoder

raske donorer og kræftpatienter

HLA-A * 02

+ prostata eller ovariecancer patienter og ti HLA-A * 02

+ raske forsøgspersoner blev indskrevet i denne undersøgelse efter skriftligt informeret samtykke blev opnået. Alle protokoller blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) ved Baylor College of Medicine før studiestart. 20 ml perifert blod blev opnået fra hver person, og mononukleære celler fra perifert blod (PBMC’er) blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering ved anvendelse af Lymphoprep (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norge). Frisk isolerede PBMC’er blev kryokonserveret til senere brug i 1 ml frysemedium indeholdende 90% FCS og 10% dimethylsulfoxid (DMSO) ved -140 ° C. HLA-A * 02-ekspression i PBMC’er opnået fra kræftpatienter og raske forsøgspersoner blev verificeret ved flowcytometri med FITC-mærket HLA-A * 02 mAb BB7.2 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA).

cellelinier

Alle brystkræft cellelinier (MCF-7, CAMA-1, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA -MB-436, MDA-MB-453, MDA-MB-468), T2-celler (en HLA-A * 02

+ TAP-deficiente cellelinie), prostatacancer-cellelinier (PC3, LNCaP og DU 145), ovariecancer cellelinie Ovcar-3 og lymfom cellelinie Jeko-1 blev erhvervet fra American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA). En æggestokkræft cellelinje Skov-1 [30], [31] var en gave fra Dr. Kunle Odunsi (Roswell Park Cancer Institute, NY, USA); en lymfom cellelinje L1236 [32], [33] var en gave fra Dr. Catherine M. Pullert (Baylor College of Medicine, Houston, USA). Alle cellelinier blev opretholdt i RPMI-1640 medium (Mediatech, Manassas, VA, USA), suppleret med 10% FBS, 1% L-glutamin og 1% penicillin og streptomycin

Peptider

Twelve SATB1-afledte peptider (tabel 1) blev forudsagt under anvendelse BIMAS (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/), SYFPEITHI (https://www.syfpeithi.de/), og Rankpep (https://bio.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html) baseret på HLA-A * 02-bindende motiv. Epitoper, som blev forudsagt af mindst to af disse algoritmer blev udvalgt til yderligere afprøvning. Peptiderne blev syntetiseret ved en fast-fase metoden i en peptidsynteseapparat (AApptec, Inc .; Louisville, KY, USA), oprenset ved omvendt-fase højtydende væskekromatografi og valideres ved massespektrometri. De syntetiserede peptider blev opløst i DMSO ved en koncentration på 10 mg /ml og opbevaret ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse. Et peptid (SATB1

544-552) blev udelukket fra undersøgelsen på grund af vanskeligheden ved peptidsyntese.

In vitro

Stimulering af peptid-specifikke T-celler i PBMC’er

PBMC’er (1 × 10

5 celler /brønd) fra enten raske forsøgspersoner eller cancerpatienter blev inkuberet med standard peptidkoncentrationer på 20 ug /ml pr peptid [34] – [37] i 96-brønds U-bund mikroplader (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) i 200 pi T-celle-medium (TCM) bestående af RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA, USA), 10% humant AB-serum (Valley Biomedical, Winchester , USA), 50 uM 2-mercaptoethanol, 100 IE /ml interleukin-2 (IL-2), 0,1 mM MEM ikke-essentiel aminosyreopløsning (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Halvdelen af ​​TCM blev fjernet og erstattet med frisk TCM indeholdende peptider (20 ug /ml) hver 5 dage. Efter 14 dages dyrkning blev cellerne høstet og testet for deres evne til at producere IFN-γ som reaktion på T2-celler (1 x 10

4 celler /brønd), der var præ-fyldt med enten SATB1 peptid (5 ug /ml) eller en kontrol-peptid (en irrelevant HLA-a * 02 bindende EBV-peptid: GLCTLVAML) som en negativ kontrol. Efter 18 timers inkubation blev supernatanter opsamlet, og IFN-γ frigivelse blev bestemt ved ELISA-assay.

Rapid Expansion Protocol (REP) for SATB1 Peptid-specifikke T-celler

SATB1 peptidspecifik T-celler blev udvidet med en hurtig udvidelse protokol (REP) som tidligere beskrevet [38] med en mindre ændring. Kort fortalt, på dag 0, 0,1-0,5 × 10

6 SATB1 peptid-specifikke T-celler blev dyrket i en T25-kolbe med 20 ml RPMI-1640 suppleret med 10% humant AB-serum, 50 uM 2-mercaptoethanol, 30 ng /mL OKT3 antistof (Ortho Biotech, Bridgewater, NJ, USA) og 30 ng /mL anti-CD28-antistof (R St. Louis, MO, USA) blev tilsat per brønd. Den kolorimetriske reaktion blev stoppet ved anvendelse af 2 N H

2SO4 og pladerne blev aflæst ved 450 nm med en ELISA-pladelæser.

RNA-ekstraktion og RT-PCR

RNA-ekstraktion og RT-PCR blev udført som tidligere beskrevet [39]. Kort fortalt blev totalt RNA ekstraheret fra cancerceller med 1 ml Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Tre mikrogram RNA blev revers-transkriberet til cDNA i 30 pi volumen og 1 pi af hver cDNA blev anvendt i efterfølgende PCR-reaktion med et par SATB1 specifikke primere: Primer 1:5′-TGCAAAGGTTGCAGCAACCAAAAGC-3 ‘; 5’-AACATGGATAATGTGGGGCGGCCT-3 ‘. GAPDH blev anvendt som lastning kontrol: primer 1:5’-TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG-3 ‘; Primer 2:5’-TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT-3 ‘. PCR-reaktionen blev udført under følgende betingelser: 95 ° C i 1 min, 95 ° C i 40 s, 60 ° C i 30 s, 72 ° C i 40 s, total 40 cykler, 72 ° C i 5 min, og GAPDH blev kørt i 25 cykler. Lige store mængder PCR-produkter blev dernæst påført og påvises ved gelelektroforese.

Western Blot

Hele celleekstrakter blev fremstillet og løst i SDS-PAGE geler. Proteinerne blev overført til PVDF-membran (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) og yderligere inkuberet med SATB1 antistof (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). LumiGlo Chemiluminescent Substrate System fra KPL (Gaithersburg, MD, USA) blev anvendt for protein detektion.

FACS-analyse

Celler (0,5 x 10

6) blev farvet med enten FITC-anti -CD8, PE-Cy5-anti-CD4 (begge fra eBioscience, San Diego, CA, USA) eller FITC-anti-HLA-A * 02 (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) i PBS indeholdende 2% FBS for is i 30 minutter og derefter vasket to gange i PBS. Bagefter blev cellerne resuspenderet i 500 pi PBS og analyseret ved anvendelse af et FACScalibur maskine. For DimerX HLA-A * 02: Ig-farvning, SATB1 reaktive CD8

+ T-celler blev inkuberet med oprenset HLA-A * 02: Ig dimer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) lastet med et givet peptid, og derefter farvet med FITC anti-muse IgG1 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Flowcytometri blev udført på et FACScalibur maskine.

cytotoksicitetsanalyse

SATB1-afledte peptid-specifikke T-celler blev testet for cytotoksicitet mod peptidbelastede T2-celler, to HLA-A * 02

+ SATB1

+ cancercellelinier (Skov-1 og Jeko-1) og en HLA-a * 02 negativ SATB1

+ PC3 cellelinie som en negativ kontrol af en lactat dehydrogenase (LDH) assay (Promega; Madison, WI, USA). Assayet blev udført i overensstemmelse med producentens anvisninger. LDH frigivelse blev beregnet på grundlag af følgende formel:.

cytotoksicitet (%) = (Experimental – Effector Spontan – Target Spontan LDH frigivelse) /(Target Maximum – Target Spontan LDH frigivelse) × 100

Spontan frigivelse blev bestemt ved anvendelse af supernatanten af ​​målcellerne alene eller effektorceller alene, og den maksimale frigivelse blev bestemt ved anvendelse af supernatanten af ​​målceller inkuberet med en lyseopløsning inkluderet i LDH kit.

Statistik

t-test blev anvendt til at analysere kvantitative forskelle mellem de eksperimentelle brønde og kontroller i ELISA-assays. P 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

SATB1 mRNA udtrykkes i en række af kræft

For at undersøge, om SATB1 udtrykkes i kræftceller, mRNA-ekspression for SATB1 i. forskellige typer af tumorceller blev udført ved RT-PCR. Som vist i figur 1, blev SATB1 mRNA stærkt udtrykt i en række forskellige cancere, herunder brystcancer, ovariecancer, prostatacancer samt lymfom. Mens den normale prostata epitelial cellelinje, havde PNT1A ikke udtrykke SATB1 mRNA.

mRNA-ekspression for SATB1 i forskellige cellelinier, blev bestemt ved RT-PCR. De brystkræft cellelinier (MCF-7, CAMA-1, MDA-MB-134VI, MDA-MB-175VII, MDA-MB-361, DU4475, MDA-MB-231, MDA-MB-436, MDA-MB- 453 og MDA-MB-468), prostatacancer (PC) cellelinier (PC3, LNCaP og DU145), ovariecancer (OC) cellelinier (OVCAR-3 og Skov-1), lymfom cellelinier (Jeko-1 og L1236 ) og en normal prostata epitelcellelinie PNT1A blev inkluderet som en kontrol. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Induktion af SATB1-afledt peptid-specifikke CTL’er i raske donorer

Først, vi opnåede PBMC’er fra 10 HLA-A * 02

+ raske donorer at bestemme, om SATB1-reaktive T-celle-forstadier var til stede i disse raske forsøgspersoner. Cellerne blev stimuleret

in vitro

i to uger med hver af SATB1-afledte peptider indeholdende HLA-A * 02-bindende motiv (tabel 1). Ved slutningen af ​​peptid stimulering blev supernatanter fra kulturerne analyseret ved ELISA for at detektere IFN-γ frigivelse som reaktion på T2-celler pulset med eller uden tilsvarende peptider. Som vist i tabel 2, næsten alle de 11 SATB1-afledte peptider (10/11) var i stand til at inducere peptidspecifikke T-celle-responser i mindst én af de raske personer. Især peptidet SATB1

565-574 inducerede højere niveau af IFN-γ frigivelse ( 900 pg /ml) i 4 ud af 10 raske forsøgspersoner, der angiver dens høj immunogenicitet og potentiale i at udvide antigenspecifikke T-celler i raske forsøgspersoner.

Tilstedeværelse af SATB1 peptid specifikke CTL’er i kræftpatienter

Vores analyse viste, at peptid-specifikke T-celler mod SATB1

565-574 blev fundet i ~ 60% af raske forsøgspersoner, begrundet vi derfor, at CTL forstadier, der kunne genkende dette peptid også kan være rigelige i PBMC’er fra kræftpatienter. For at teste vores hypotese, vi undersøgte, om peptid SATB1

565-574 kunne fremkalde peptid CTL’er fra PBMCer fra HLA-A * 02

+ æggestokkene kræftpatienter. PBMC’er fra tre HLA-A * 02

+ æggestokkene kræftpatienter blev indsamlet og stimuleret

in vitro

med peptid SATB1

565-574. Som vist i tabel 3, peptid SATB1

565-574 var i stand til at inducere peptidspecifikke CTL’er fra PBMCer fra patienter med ovariecancer, hvilket indikerer, at peptidet er stærkt immunogent, ikke blot hos raske forsøgspersoner, men også hos kræftpatienter. Vi har også afgøres, om dette peptid kandidat kunne fremkalde peptid-specifikke CTL’er fra PBMCer fra HLA-A * 02

+ prostata cancer patienter. Som det var tilfældet med patienter med ovariecancer, peptid SATB1

565-574 tilsvarende inducerede peptidspecifikke CTL’er fra PBMC’er af 5 prostatacancerpatienter samt (tabel 3), hvilket indikerer CTL-forstadier, som genkender dette peptid er rigelige i PBMC’er fra kræft patienter.

SATB1-afledte peptid induceret CD8

+ T-celle-afhængige Responses

For yderligere at analysere SATB1

565-574 peptid-specifikke T-celler, vi næste ekspanderede SATB1

565-574 peptid-specifikke T-celler identificeret i tabel 2 og 3 for at opnå et tilstrækkeligt antal af disse celler. Til dette formål har vi udført peptid titreringsforsøg at bestemme den optimale peptidkoncentration til indlæsning T2-celler til T-celle genkendelse. Som vist i figur 2A, kan T2-celler sensibiliseres ved peptid SATB1

565-574, men ikke en kontrol EBV-peptid for T celle genkendelse ved en koncentration på 0,08 ug /mL, og bindingsstederne af HLA-A * 02-molekyler på T2-celler blev mættet ved 5 ug /ml. Yderligere forøgelse af koncentrationerne af SATB1

565-574 undladt at øge produktionen af ​​IFN-γ. Derfor vi konsekvent anvendt peptidet koncentration på 5 ug /ml for pre-loading T2-celler i vores ELISA-assays. De ekspanderede T-celler opretholdt antigen-specificitet og udskilte signifikante mængder af IFN-γ efter stimulering med T2 celler pulset med de tilsvarende peptider, men ikke med en kontrol EBV-peptid (figur 2A og B). For at opnå direkte bevis på delmængder af de responderende T-celler er afbildet i figur 2B blev de udvidede SATB1 peptid-reaktive PBMC’er udtømt for enten CD4

+ T-celler (Figur 2C) eller CD8

+ T-celler (figur 2D ) før inkubering med peptider til ELISA-assays. Som vist i figur 2E, CD8

+ T-celler, ikke CD4

+ T-celler (figur 2F), opnået fra ekspanderede PBMC’er svarede på SATB1

565-574 pulserede T2-celler, hvilket indikerer, at T-celle-respons induceret af SATB1

565-574 var afhængig af CD8

+ T-celler. Endvidere dimerX HLA-A * 02: Ig-farvning (figur 2G og H) og IFN-γ intracellulær farvning (fig S1) viste også, at SATB1

565-574 inducerede peptidspecifik, HLA-A * 02 begrænset CD8

+ T celle-afhængige responser.

induceret CD8

+ T-celle-afhængige responser. Anerkendelse af T2-celler pre-loaded med titrerede koncentrationer af peptider (0-20 ug /ml) ved ekspanderet SATB1

565-574-specifikke T-celler fra rask donor # 1 blev testet ved ELISA-assay (A). De udvidede SATB1-reaktive PBMC’er (B) blev co-inkuberet med T2-celler (1 x 10

4 celler /brønd) alene i komplet medium (CM), eller med T2 celler præinstalleret med enten SATB1

565 -574 (5 ug /ml) eller en kontrol EBV-peptid som negativ kontrol. Cellerne blev inkuberet i 18-24 timer blev IFN-γ-sekretion i supernatanten bestemt ved ELISA-assay. SATB1-reaktive PBMC’er udtømt for CD4

+ T-celler (C) og SATB1-reaktive PBMC’er depleteret for CD8

+ T-celler (D) blev verificeret ved flowcytometri. De anerkendelser af T2-celler pulset med SATB1

565-574 af SATB1-reaktive PBMC’er udtømt for enten CD4

+ T-celler (E) eller CD8

+ T-celler (F) blev bestemt ved ELISA. SATB1 reaktive CD8

+ T-celler blev inkuberet med oprenset HLA-A2: Ig dimer belastes med en kontrol EBV-peptid (G) eller med peptid SATB1

565-574 (H), og derefter farvet med FITC anti-muse IgG1. Celler blev analyseret ved anvendelse af et FACScalibur maskine. Data (fra A, B, E og F) er plottet som middeltal ± SD. Resultaterne er repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001 versus kontroller (T2 celler alene eller T2 celler pulset med en kontrol EBV peptid).

Anerkendelse og Drab af kræftceller ved SATB1-afledte peptid-specifikke CD8

+ T-celler i en HLA-i Begrænset Manner

Baseret på vores resultater hidtil blev SATB1

565-574 specifikke CD8

+ T-celler anvendt i efterfølgende eksperimenter. For at bestemme om SATB1-afledte peptid-specifikke T-celler var i stand til at genkende og dræbe HLA-A * 02

+, SATB1-udtrykkende cancerceller, anvendte vi en HLA-A * 02

– SATB1 mRNA positiv prostatacancer cellelinje PC3 (som negativ kontrol) og fem HLA-a * 02

+ SATB1 mRNA positiv cancercellelinier. Ekspressionen af ​​SATB1 mRNA i disse 6 cellelinjer er tidligere blevet undersøgt ved RT-PCR (figur 1) og HLA-A * 02-ekspression blev verificeret ved flowcytometri (figur 3A). Derudover har vi også kontrolleres ekspression af SATB1 protein blandt disse cellelinjer (figur 3B), og fandt, at alle kræft cellelinjer udtrykte SATB1 protein undtagen PC3 og Ovcar-3. Derfor blev Ovcar-3 også betragtes som en negativ kontrol. Som vist i figur 4A, SATB1

565-574 -specifikke T-celler kunne genkende HLA-A * 02

+ SATB1 udtrykker Skov-1 og Jeko-1-celler, men ikke PC3 eller Ovcar-3-celler. De to andre HLA-A * 02

+ SATB1 udtrykkende cancercellelinier (CAMA-1, MDA-MB-231) kunne kun blive anerkendt, når de blev forbehandlet med IFN-γ (figur 4B), hvilket antyder, at enten forbedret HLA-A * 02 udtryk på celle overflader (Figur S2) eller induktion af immunproteasomer af IFN-γ, kan lette præsentationen af ​​den korrekte epitop til celleoverflader for T-celle kontrol. I modsætning hertil kunne normale celler, herunder PNT1A og autologe PBMC’er, ikke anerkendes af SATB1

565-574-specifikke T-celler (figur 4A). Desuden SATB1

565-574-specifikke T-celler ikke genkende in vitro-opdelte Th delmængder, herunder Th1, Th2 og Th17 celler (Figur S3).

(A) Celler blev farvet med FITC -Anti-HLA-A * 02 i PBS indeholdende 2% FBS. Derefter blev cellerne vasket og resuspenderet i PBS og analyseret ved anvendelse af et FACScalibur maskine. (B) Ekspression af SATB1 protein i forskellige tumorceller blev bestemt ved Western blot. Actin blev brugt som en belastning kontrol.

(A) SATB1

565-574-specifikke T-celler fra rask donor # 1 blev dyrket alene i medium eller co-inkuberes med forskellige typer af tumor celler såvel som normale celler (PNT1A og PBMC); (B) Tumorceller blev forbehandlet med eller uden IFN-γ (10 ng /ml) i 48 timer inden inkubering med SATB1

565-574-specifikke T-celler. SATB1

565-574-specifikke T-celler blev dyrket i medium alene som en negativ kontrol (rød søjle); For at blokere HLA-afhængige responser, enten anti-HLA-I mAb (W6 /32) eller HLA-II mAb blev tilsat til cellekulturer under inkubation af SATB1

565-574-specifikke T-celler med Skov-1 (C) eller Jeko-1-celler (D). Celler blev inkuberet i 18 -24 timer, blev IFN-γ-sekretion i supernatanten bestemt ved ELISA-assay. SATB1

565-574-specifikke CD8

+ T-celler blev testet for cytotoksicitet mod T2-celler pulset med eller uden peptider (E), Skov-1 (F) og Jeko-1 (G) ved LDH-assay. HLA-A * 02 negative PC3 celler blev anvendt som en negativ kontrol i LDH-assayet. Data fra A-G er afbildet som middel ± SD. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

. 0,001 versus kontrol

for at afgøre, om anerkendelse af kræftceller ved SATB1

565-574-specifikke CD8

+ T-celler var HLA-i begrænset, vi co-dyrket SATB1

565-574-specifikke T-celler med enten Skov- 1 eller Jeko-1-celler i nærvær af enten anti-HLA-i mAb (W6 /32) eller anti-HLA-II mAb. Som vist i figur 4C og D, blev T-celle responser inhiberes fuldstændigt ved tilsætningen af ​​anti-HLA-I mAb, men ikke anti-HLA-II (HLA-DP mAb), hvilket tyder på, at anerkendelsen af ​​tumorceller ved SATB1

565-574-specifikke CD8

+ T-celler er HLA-i begrænset.

for yderligere at undersøge, om SATB1

565-574-specifikke CD8

+ T-celler var i stand til at dræbe HLA-A * 02

+, SATB1-udtrykkende cancerceller, udførte vi cytotoksicitetsassays. Som vist i figur 4E, SATB1

565-574-specifikke T-celler dræbt T2-celler pulset med SATB1

565-574, men ikke T2-celler alene eller hos de pulseret med en kontrol EBV-peptid. Vigtigere, SATB1

565-574-specifikke T-celler var i stand til at dræbe HLA-A * 02

+, SATB1 udtrykker Skov-1 og Jeko-1-celler, men ikke HLA-A * 02

– PC3 celler (Figur 4F og G). Disse resultater tyder på, at SATB1

565-574-specifikke T-celler genkender en T-celle epitop, der er endogent bearbejdes og præsenteres af tumorceller.

Diskussion

Det er veletableret, at CD8

+ T-celler spiller en kritisk rolle i kontrollen tumorudvikling og progression. Peptid epitoper afledt TAA’er kan genkendes som antigener af T-celler i forbindelse med MHC-I-molekyler [40], [41]. Identificering af ideelle TAA’er og deres peptider, der genkendes af T-celler er afgørende for udviklingen af ​​effektive cancervacciner. Ideel TAA’er såsom anti-apoptotiske proteiner [14], telomerase [12] og survivin [13], som er obligatorisk for tumorvækst /overlevelse, kan repræsentere optimale mål for medieret vaccine immunterapi af kræft. SATB1 er stærkt udtrykt i mange typer af humane kræftformer og opregulering af SATB1 udtryk er afgørende for tumor overlevelse og metastase, dermed SATB1 repræsenterer en af ​​sådanne ideelle TAA’er.

Formålet med den aktuelle undersøgelse var at identificere HLA -A * 02 bindende SATB1-afledte epitoper genkendt af CD8

+ T-celler i PBMC’er af raske forsøgspersoner og kræftpatienter. Tolv SATB1-afledte peptider blev forudsagt under anvendelse BIMAS, SYFPEITHI, og Rankpep baseret på HLA-A * 02-bindende motiv. Peptider, der blev forudsagt af mindst 2 af 3 programmer blev udvalgt til yderligere afprøvning for deres evne til at stimulere PBMC’er fra raske forsøgspersoner og /eller kræftpatienter. Yderligere undersøgelser viste, at 10 ud af 11 syntetiserede SATB1-afledte peptider var i stand til at inducere peptidspecifikke T-celle-responser i mindst én ud af 10 raske forsøgspersoner. Specifikt SATB1

565-574 viste sig at inducere højere niveau af IFN-γ frigivelse ( 900 pg /ml) i 4 ud af 10 raske forsøgspersoner, hvilket viser, at dette peptid kan være immunogene og potentielt stand til at udvide antigen- specifikke T-celler hos raske forsøgspersoner. Desuden SATB1

565-574 inducerede ofte specifikke T-celle responser i PBMC’er af æggestokkene kræftpatienter samt i PBMC’er fra patienter med prostatacancer. Vigtigere, anerkendt SATB1

565-574 peptid-specifikke T-celler og dræbte HLA-A * 02

+ SATB1-udtrykkende Jeko-1, Skov-1-celler samt IFN-y-behandlede brystkræft cellelinier ( CAMA-1 og MDA-MB-231), hvilket tyder på dette peptid er naturligvis behandles af kræftceller.

SATB1 er en global kromatin arrangør og transskription faktor og har vist sig som en nøglefaktor integrere højere ordens kromatin arkitektur med genregulering [42]. SATB1 fremmer tumorvækst og metastase ved omprogrammering chromatin organisation og transskriptionsprofiler, og er overudtrykt i en række forskellige cancere, herunder brystcancer [18], larynx pladecellecarcinom [19], endometrioide endometriecancer [20], hepatocellulært carcinom [21] , endetarmskræft [22], kutan malignt melanom [23], mavekræft [24], [25], ovariecancer [26], prostatacancer [27], lungecancer [28] og gliom [29]. I tumorceller med høje niveauer af SATB1, gener, der fremmer tumorprogression og metastase blev opreguleret, hvorimod gener, der inhiberer tumormetastase var undertrykt [17]; mens tavshed af SATB1 stærkt reduceret invasive og metastatiske kapacitet af kræftceller [43].