PLoS ONE: somatiske mutationer, Allel Loss og DNA methylering af Cub og Sushi flere domæner 1 (CSMD1) Gene afslører Association med tidlig alder af diagnose i kolorektal cancer Patients

Abstrakt

Baggrund

Cub og Sushi flere domæner 1 (CSMD1) gen, som ligger på den korte arm af kromosom 8, koder for en type i-transmembranprotein, hvis funktion er i øjeblikket ukendt. CSMD1 ekspression ofte tabt i mange epiteliale cancere. Vores mål var at karakterisere forholdet mellem CSMD1 somatiske mutationer, allel ubalance, DNA methylering og de kliniske karakteristika i kolorektal cancer patienter.

Metoder

Vi sekventeret den CSMD1 kodende områder i 54 kolorektale tumorer ved hjælp af 454FLX pyrosekventering platform at forhøre 72 amplikoner dækker hele den kodende sekvens. Vi anvendte heterozygote SNP allel-forhold på flere CSMD1 loci at bestemme allel balance og udlede tab af heterozygoti. Endelig har vi udført methylering-specifik PCR på 76 kolorektale tumorer til at bestemme status DNA methylering for CSMD1 og kendt methylering mål ALX4, RUNX3, NEUROG1, og CDKN2A.

Resultater

Brug 454FLX sekventering og bekræfter med Sanger-sekventering blev 16 CSMD1 somatiske mutationer identificeret i 6 af de 54 kolorektale tumorer (11%). Den ikke-synonyme til synonymt mutation forholdet mellem de 16 somatiske mutationer var 15:01, et forhold betydeligt højere end den forventede 02:01 ratio (p = 0,014). Dette forhold angiver en tilstedeværelse af positiv selektion for mutationer i CSMD1 proteinsekvensen. CSMD1 allel ubalance var til stede i 19 ud af 37 informative sager (56%). Patienter med allel ubalance og CSMD1 mutationer var signifikant yngre (gennemsnitsalder, 41 år) end dem uden somatiske mutationer (gennemsnitsalder, 68 år). Størstedelen af ​​tumorer blev methyleret ved én eller flere CpG loci i CSMD1 kodende sekvens og CSMD1 methylering signifikant korreleret med to kendte methylering mål ALX4 og RUNX3. C: G T:. A udskiftninger var signifikant overrepræsenteret (47%), hvilket tyder på omfattende cytosin methylering disponerer til somatiske mutationer

Konklusioner

Deep amplikon sekventering og methylering-specifik PCR afslører, at CSMD1 ændringer kan korrelere med tidligere klinisk præsentation i kolorektale tumorer, hvilket yderligere implicerer CSMD1 som et tumorsuppressorgen

Henvisning:. Shull AY, Clendenning ML, Ghoshal-Gupta S, Farrell CL, Vangapandu HV, Dudas L, et al . (2013) somatiske mutationer, Allel Tab og DNA methylering af Cub og Sushi flere domæner 1 (CSMD1) Gene afslører Association med tidlig alder af diagnose i tyk- og endetarmskræft Patienter. PLoS ONE 8 (3): e58731. doi: 10,1371 /journal.pone.0058731

Redaktør: Nathan A. Ellis, University of Illinois i Chicago, USA

Modtaget: November 29, 2012; Accepteret: 5 feb 2013; Udgivet: 7. marts, 2013 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Støtte for dette projekt blev leveret af National Institutes of Health give 7R21CA127683. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje mest almindelige kræftform med cirka 1 millioner årlige tilfælde på verdensplan [1]. Dette kompleks lidelse er normalt kendetegnet ved en overflod af somatiske mutationer [2]. Men hver tumor har sin egen unikke mutations landskab [3], og de underliggende mekanismer, der giver anledning til denne varieret landskab er dårligt forstået. Aktiverende mutationer i adenomatøs polypose coli (APC), Kirsten ras (KRAS), og Phosphatidylinositol 3-kinase (PIK3CA) gener er meget almindelige i kolorektale cancere [4]. Det er sandsynligt, at den rette kombination af mutationer kunne give en bestemt klon af celler en proliferativ fordel. Mutationer, der forårsager eller bidrager til tumorprogression er almindeligvis omtales som chauffører, mens mutationer, der tilbyder ingen selektiv fordel almindeligvis omtales som passagerer [5], [6], [7]. De fleste af somatiske mutationer, der ophobes i tumorer er tavse passagerer [8], [9], mens små delmængder af mutationer er faktiske bilister [10], [11]. Ved at antage, at alle tavse (synonyme) mutationer er passagerer, har baggrunden på somatiske mutationer i tarmkræft blevet tilnærmet at være en mutation per megabase [12]. Gener, der er oftere muterede end den forudsagte baggrund sats kan være førere af neoplastisk udvikling. Ved at antage, at alle tavse mutationer er passagerer, og at ikke-tavse (ikke-synonyme) mutationer kan enten være drivere eller passagerer, den samlede andel af ikke-synonyme til synonyme (NS /S) mutationer i et givent gen kan give yderligere bevis om, hvorvidt denne gen er under positiv eller negativ selektion for ændring af aminosyresekvensen. Gener, der ophobes mutationer, men er under ingen selektive pres, har en forventet ikke-synonyme til synonym (NS /S) forhold på ca. 02:01. Denne forventede forhold er baseret på de første to nukleotidpositioner i codon dikterer den kodede aminosyre og den tredje “wobble” position tillader kodonredundans. Denne mekanistisk opsætning af den genetiske kode skaber dobbelt så mange muligheder for en given enkelt nukleotid substitution at ændre aminosyresekvensen, som der er mulighed for at erstatte en nukleotid endnu bevare aminosyresekvensen. Gener med en overrepræsentation af ikke-synonyme mutationer har en NS /S-forhold, der er statistisk signifikant højere end den forventede 02:01 og kan trygt antages at være under positivt selektivt pres for at ændre aminosyresekvensen under processen med tumor evolution [ ,,,0],13]. Derfor kan en høj NS /S-forhold på somatiske mutationer tilvejebringe statistiske beviser for, om en muteret gen er en drivkraft for tumor progression [3], [5].

Cub og Sushi flere domæner 1 (CSMD1) gen er et hidtil ukendt kandidat tumorsuppressorgen beliggende på p arm af kromosom 8 (2792875 … 4.852.328). CSMD1 ofte vist skal slettes [14], [15], [16], muterede [2], [10], [17], eller methylerede [14], [18] i mange kræftformer. Faktisk er CSMD1 udtryk ofte tabt i brystkræft [19], mens CSMD1 mister allel balance i hoved og hals planocellulært karcinom (HNSCC) og lungekræft [20]. . CSMD1 har også vist sig at være methyleres i HNSCC cellelinjer [21]

Den første exon i CSMD1 huser en methyleret CpG ø (Kromosom 8: 4.848.969 til 4.852.635) [21], en sekvens rig på C: G basepar indeholdt i CpG eller CpHpG sammenhænge [22]. Den CpG Island Methylator Fænotype (CIMP) [23] beskriver en delmængde af kolorektale tumorer, der viser høj methylering hyppigheden af ​​specifikke CpG øer. Disse CIMP tumorer har forskellige kliniske, patologiske, og molekylære signaturer såsom proksimale tumor placering, dårlig differentiering, og mikrosatellit ustabilitet. Vigtige kliniske korrelationer med CIMP er også blevet observeret i bryst- og hjernetumorer [24], som angiver, at fænomenet er ikke kun vævsspecifik. Det er endnu ikke klart, om CIMP status forårsager eller blot forbundet med disse fænotyper. Methylering af specifikke CIMP gener kun løst korreleret med undertrykkelse af genekspression; derfor andre mekanismer, der påvirker klinisk adfærd CIMP tumorer kan være vigtig. Kimlinie nukleotidsubstitutioner, der involverer C: G t: A overgange menes at være katalyseret af cytosin-methylering [25]. Disse substitutioner fører til en genom-dækkende underrepræsentation af CpG-dinukleotider i forhold til hvad der forventes ved en tilfældighed alene. Genom methylering har således påvirket genom sekvens evolution og polymorfi landskab af de fleste hvirveldyr. Ved lignende ræsonnement, er det muligt, at CIMP status af tumorceller eller deres forstadier til kræft forstadier (stamceller) kan prædisponere methylerede gener for at akkumulere C: G T: a. Somatiske mutationer

Somatiske mutationer i tumorer kan give historiske beviser for CSMD1 lyddæmpning ved methylering i cancer stamceller. Colon stamceller placeret i bunden af ​​krypterne kan være de primære mål for malign transformation [26], [27]. Mutationer, som har oprindelse i stamceller [28], [29], [30], [31] har en mulighed for at fortsætte længe nok til akkumulering af at samarbejde onkogene mutationer. Selv epigenetisk inaktivering af CSMD1 kan bidrage til maligne transformerede fænotype, [32], [33], [34], [35], [36], [37], somatiske mutationer, der akkumulerer som følge af methylering kan også bidrage til malignitet af ukendte mekanismer. Ved at undersøge flere metoder til CSMD1 ændringer (mutation, methylering og allel tab), vi observerede signifikante korrelationer af CSMD1 tab af funktion med tidlig alder af diagnose i patienter med tarmkræft. Sammenhængen mellem CSMD1 tab af funktion og klinisk præsentation kan bidrage til at give indsigt i neoplastiske udvikling af kolorektal cancer.

Materialer og metoder

Tumor Valg og DNA Isolation

de- identificerede kirurgiske prøver blev opnået fra South Carolina Biorepository System (Palmetto Sundhed, Richland, Palmetto Sundhed, Baptist, og Lexington Regional Medical center, Lexington, South Carolina). Denne undersøgelse blev udført med godkendelse af Institutional Review Board of Palmetto Sundhed, Lexington Medical Center, University of South Carolina og Georgien Health Sciences University, og alle skriftlige patient samtykker blev opnået forud for at studere. De-identificerede kliniske data blev opnået fra tumor-registreringsdatabasen, og den manuelle curation af patologiske optegnelser blev foretaget af væv bank personale.

Vi valgte 54 mikrosatellit-stabil kolorektale tumorer til denne undersøgelse. Alle kirurgiske prøver var frisk frosset, indlejret i Optimal Cutting Temperatur forbindelse (Sakura Finetek, Torrence, CA), og sektioneret. Prøverne blev skåret i 10 um tykke skiver og fastgjort på Sigma silan-prep ä dias. Objektglassene blev fikseret med 75%, 95% og 100% ethanol og xylen. Skiverne fra begyndelsen og slutningen af ​​hver vævsprøve blev farvet med Mayers Hematoxylin (Sigma, St. Louis, MO) og eosin (Harleco, Lawrence, KS) opløsninger til specifikt opnå grænserne for tumorvæv. Alle patientens prøve data leveres i tabel 1.

ekstraktioner af tumoren og normale epitelceller fra vævet skiver blev udført ved hjælp af mikro-dissektion teknik udviklet i vores laboratorium. Tumor og normale celler blev identificeret til micro-dissektion med anvendelsen af ​​to tilberedte H 60 cykler ved 94 ° C i 10 sek, 62 ° C i 45 sekunder, og 62 ° C i 5 minutter. De endelige skabelon koncentrationer af tumor og normalt DNA var 3 ng /pl.

Screening for mikrosatelitter Ustabilitet i tumorer

Påvisningen af ​​mismatch reparation deficiente tumorer blev udført ved amplifikation af mikrosatellit-locuset, således at tumorer viser hypermutator fænotype kunne udelukkes. Alle tumorer blev indledningsvist præ-screenes for mikrosatellit instabilitet (MSI) ved anvendelse af BAT26 primere, og dem med ustabilitet blev udelukket. Efterfølgende blev tumorer med somatiske mutationer til CSMD1 analyseret med tre yderligere NCI MSI loci: BAT25, D2S123 og D17S250 primere. De anvendte primere er anført i tabel S1 i File S1 (Integrated DNA Technologies, Coralville, IA). Ingen af ​​tumorerne viste ustabilitet på BAT26 locus, og kun én prøve (Tumor ID 587) viste moderat mikrosatellit ustabilitet på BAT25 locus. PCR amplikoner blev genereret med følgende protokol: PCR Master Mix blev fremstillet ved anvendelse af 5 pi KAPA 5x HiFi-buffer (KAPA Biosystems Woburn, MA), 0,75 pi 10 mM dNTP’er, 3,00 pi primere (slutkoncentration 2,5 uM), 0,50 pi KAPA HiFi HotStart polymerase (KAPA Biosystems Woburn, MA), 1,00 pi 10X SYBR Green (Invitrogen, Carlsbad, CA), 8,75 pi PCR Vand (Invitrogen, Carlsbad, CA) og 1 pi DNA-template på 3 ng /pl. Termisk cyklisering blev udført på et MyIQ termisk iCycler (Bio-Rad, Hercules, CA) ved følgende protokol: 1 cyklus ved 95 ° C i 2 min; 3 cyklusser af 63 ° C i 15 sek og 72 ° C i 15 sek; 3 cyklusser 98 ° C i 20 sekunder, 60 ° C i 15 sek, 72 ° C i 15 sek; 3 cyklusser af 98 ° C i 20 sek, 57 ° C i 15 sek, 72 ° C i 15 sek; 49 cykler af 98 ° C i 20 sek, 56 ° C i 15 sek, 72 ° C i 15 sek; 1 cyklus 55 ° C i 30 sek; 80 cykler af 55 ° C i 30 sek. PCR-produkterne blev kørt på 10% TBE-urea-geler (Bio-Rad, California, USA) ifølge producentens retningslinjer og fotograferet under anvendelse af en Alpha Imager og Mængde One ™ software (Alpha Innotech, San Leandro, CA).

Udarbejdelse af Amplikoner for sekventering

de exoner for CSMD1 og KRAS gener blev identificeret med Sequence Viewer på NCBI hjemmeside (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/sviewer) . PCR primere blev designet til de 71 exons af CSMD1 og for 2 almindelige hotspot mutationer i KRAS (exon 2, codon 12 og 13) ved hjælp af PRIMER3 open source software (https://frodo.wi.mit.edu/primer3/input .htm;. (tabel S1 i File S1) KRAS blev sekventeret kun ved mutation hotspots grund til at prøve begrænsninger frem og omvendt tag-sekvenser, 454A og 454b, henholdsvis blev føjet til de primere som beskrevet i vejledningen til Amplikon Sequencing (454. Life Sciences, Branford CT). PCR amplikationsprodukter for 454 sekventering blev genereret ved hjælp af 7,5 ul KAPA 5x HiFi buffer (KAPA Biosystems Woburn, MA), 1.125 pi 10 mM dNTP’er, 2,25 pi primere (slutkoncentration 2,5 uM), 0,75 pi KAPA HiFi HotStart polymerase (KAPA Biosystems Woburn, MA), og 1 pi DNA-template ved 5 ng /pl Termisk cykling blev udført under anvendelse af en MyIQ Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules CA), og følgende touchdown protokol:. en cyklus, 95 ° C i 2 minutter; 3 cyklusser af 94 ° C i 10 sek, 64 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek, 3 cykler af 94 ° C i 10 sek, 61 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 cyklusser af 94 ° C i 10 sek, 58 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 50 cykler ved 94 ° C i 10 sek, 57 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek. PCR-produkterne blev analyseret ved elektroforese på en 3% agarosegel og fotograferet under anvendelse af en Alpha Imager og Mængde One ™ software (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Amplikoner blev oprenset under anvendelse SPRI Ampure perler (Agencourt, Beverly, MA) efter fabrikantens protokol.

sekventering med 454FLX Platform

SPRI-Ampure perle renset PCR-produkter (CSMD1 og KRAS) blev kvantificeret ved hjælp af Quanti-iT PicoGreen dsDNA Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA) og Fluoroskan Ascent FL

(

Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). Amplikonerne blev amplificeret ved emulsion PCR under anvendelse af emPCR Kite II og III (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) og tovejs sekventeret på den 454 GS FLX genom sequencer (University of South Carolina Environmental Genomics Core Facility, Columbia, SC). Amplikoner fra hver af de 54 tumorer, samt 2 parrede normale prøver, blev sekventeret til en gennemsnitlig dybde på 1800 gange med over 90% af de amplikoner repræsenteret ved over 300 sekvens læser per prøve. Over 500.000 individuelle sekventering læser blev indhentet fra de amplikoner.

Variant Detection Analysis

454FLX sekventering læser blev justeret til referencen sekvens fra NCBI (hg19 Build 37) og analyseret ved hjælp af softwaren CLC Genomics Workbench 4 (CLC Bio, Århus, Danmark). Vi analyserede vores sekventering data fra kolorektale tumorer og matchede normale prøver ved hjælp af Probabilistic Variant Detection Tool fra Genomics Workbench. Mutationer set i den komplementære normale væv, den dbSNP database eller 1000 genomer Project blev anset for at være kimcellelinje mutationer. De resterende mutationer blev betragtet som sandsynlige somatiske mutationer. Vores mutation opkald blev foretaget under robuste og stringente sekventering kriterier fastsat af CLC Genomics Workbench med en sandsynlighed kald af 100 for at slette falske mutation observationer. Eventuelle homopolymerområder blev også udelukket fra vores dataanalyse. Vi ekskluderede også opdaget indsættelse /sletning (INDEL) varianter fra vores undersøgelse, da 454FLX sekventering er ikke følsom at opdage Indel s.

Somatic Mutation Validering gennem Sanger sekventering

Sanger sekventering af den høje koncentration varianter blev udført for at bekræfte de somatiske mutationer identificeret af variant påvisning analyse. Beckman Coulter /Agencourt genomiske Services (Beverly, MA) og de centrale genomics facilitet på Georgia Health Sciences University udførte Sanger sekventering, som anvender samme 454a og B-tags tidligere beskrevne med 454FLX sekventering. PCR amplikoner blev genereret med følgende protokol: PCR Master Mix blev fremstillet ved anvendelse af 7 pi PCR vand (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 pi 2X KAPA SYBR (KAPA Biosystems Woburn, MA), 2 pi Primer mix ( slutkoncentration 2,5 uM), og 1 pi DNA-template på 3 ng /pl. Termisk cyklisering blev udført med følgende protokol: 1 cyklus ved 98 ° C i 2 min; 3 cyklusser af 98 ° C i 10 sek, 63 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 cyklusser af 98 ° C i 10 sek, 60 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 cyklusser af 98 ° C i 10 sek, 57 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 49 cykler af 98 ° C i 10 sek, 56 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 1 cyklus ved 55 ° C i 30 sek; 80 cykler af 55 ° C i 80 cykler. Sanger kromatogrammer blev analyseret ved hjælp af CLC Genomics Workbench 4. Efter at være blevet godkendt af Sanger sekventering blev CSMD1 somatiske mutationer registreret og deponeret i Leiden Open Variation Database (LOVD) (Leiden University Medical Center, Holland).

Allelic Balance Test fra 454FLX CSMD1 Sekvenser

Vi brugte Sekventiel Sandsynlighed Ratio Test (SPRT) for at påvise statistisk signifikante allele ubalancer i tumor prøver [39], [40]. Den SPRT designet til at teste to konkurrerende hypotese ved hjælp sekventielt påløbne observationer over tid efter på forhånd specificerede øvre og nedre grænser for oplysninger [59]. Hypotese 1 er, at allelerne er afbalancerede, så de forventede allele proportioner på informative loci bør være 50%. Hypotese 2 er, at en af ​​de to alleler er til stede i den normale prøve er helt fraværende i tumoren, så den forventede dominerende allel procentdel til informative loci bør være 100% for tumorprøver uforurenede med normalt DNA. I tilfælde gennemgår LOH hvor tumor-DNA er forurenet med op til 50% normalt DNA, den forventede dominerende allele andel er 66,7%. Konfidensintervalresultaterne kurver blev konstrueret til at identificere korrekt balancerede og ubalancerede alleler hele spektret af total allel tællinger blev observeret i de 454FLX data, der giver mulighed for op til 50% kontaminering af tumor med normalt DNA. Den øverste kurve fastlægger grænsen for allel ubalance, mens den nederste kurve fastlægger tærsklen for allel balance. Hvis en tumor allel andel overskrider den øvre bundet tumoren blev klassificeret som ubalanceret. Hvis derimod allelen andelen er mindre end den nedre grænse kurve, blev tumoren klassificeret som afbalanceret. Hvis den observerede allel andel forekom mellem de to kurver blev prøverne klassificeret som ubestemt. I alle tilfælde blev to eller flere informative alleler skal være ude af balance til at kalde en tumor ubalanceret.

CSMD1 mRNA Expression Analysis in HCT116 WT og HCT116 DNMT1 /DNMT3B DKO

Angivelse af CSMD1 mRNA blev bestemt ved at udføre kvantitativ real-time PCR på HCT116 WT og HCT116 DNMT1 /3B DKO cDNA. HCT116 WT og DNMT1 /3B DKO cDNA blev dannet ved først at isolere mRNA fra hver under anvendelse af Dynabeads mRNA isolation kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) og derefter blev omdannet til cDNA under anvendelse af Superscript II revers transkriptase (Invitrogen, Carlsbad, CA). PCR amplikoner blev genereret med følgende protokol: PCR Master Mix blev fremstillet ved anvendelse af 3 pi PCR vand (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10 pi 2X KAPA SYBR (KAPA Biosystems Woburn, MA), 2 pi Primer mix (endelig koncentration 2,5 uM), og 5 pi cDNA template. Termisk cyklisering blev udført med følgende protokol: 1 cyklus ved 98 ° C i 2 min; 3 cyklusser af 98 ° C i 10 sek, 64 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 cyklusser af 98 ° C i 10 sek, 61 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 3 cyklusser af 98 ° C i 10 sek, 58 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 40 cykler af 98 ° C i 10 sek, 57 ° C i 10 sek, 70 ° C i 30 sek; 1 cyklus ved 95 ° C i 30 sek; 80 cykler af touchdown gradient, der starter ved 95 ° C og faldt med -5 ° C hver cyklus.

methyleringsanalyse under anvendelse Methylering specifik PCR /High Resolution Melt Curve Analyse

Vi oprenset DNA fra tumorer og kontrol cellelinier ved den Agencourt DNAdvance Kit (Beckman Coulter Genomics, Beverly, MA) ifølge fabrikantens instruktioner. To hundrede nanogram af genomisk DNA blev bisulfit ændret af EZ DNA-methylering – Gold Kit (Zymo Research) efter fabrikantens protokol. HCT116 og HCT116-DNMT1 /3B dobbelt knockout (DKO) DNA [43] blev anvendt som positive og negative kontroller til status for methylering af alle gener undersøges. CSMD1 methyleres og ikke udtrykkes i vildtype HCT-116-celler. I modsætning hertil CSMD1 er umethyleret og udtrykt i DKO celler [60]. CSMD1 gen methylering blev forespurgt på 3 positioner og blev navngivet CSMD1-1 (CHR8: 4.852.196 til 4.852.032), CSMD1-3 (4.851.450 til 4.851.301) og CSMD1-5 (4.851.422 til 4.851.291). De methylering specifikke PCR-primere, der anvendes, er vist i tabel S2 i File S1. Hver tumor genereret et autentisk produkt enten med denatureret primere eller med methylerede primere, men aldrig begge dele. Tilfælde, hvor intet produkt blev observeret med enten primerpar blev betragtet uninformative. De methylering Resultaterne af tumorer er vist i tabel S3 i File S1.

methylering specifik PCR /høj opløsning smelte Curve Analyse blev gennemført i henhold til tidligere beskrevne protokoller [61]. PCR-reaktionen blev udført ved anvendelse af 3-6 ng bisulfit modificerede DNA i et totalt volumen på 20 pi, der indeholdt 12,5 pi 2X KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (KAPA Biosystems Woburn, MA), (til analyse af genomisk position 3.265.577 KAPA HRM hurtigt PCR-kittet blev anvendt); og 2.5pmol af primere [62]. De reaktion cyklingsbetingelser var 94 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 45 cykler af 30 sekunder ved 94 ° C, genspecifikke annealingstemperatur i 30 sek, forlængelse ved 72 ° C i 30 sekunder, og en samling af data vindue på 76- 77 ° C i 30 sek. Association kurver blev genereret for alle produkter, og tilstedeværelsen eller fraværet af autentiske produkter blev bestemt ved sammenligning med positive og negative kontroller. Alle reaktioner blev udført under anvendelse af en MyIQ enkelt farvede Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad).

Statistical Analysis

binomialsandsynlighed blev anvendt til at sammenligne signifikans mellem ikke-synonyme til synonyme somatiske mutationer af CSMD1 i kolorektale patienter. Sammenligning af gennemsnitlige alder ved diagnose eller klinisk præsentation for genetisk balancerede og ubalancerede patienter med somatiske mutationer blev udført af Mann-Whitney U test. Spearman Rank Correlation blev brugt til at sammenligne forholdet mellem methylerede loci.

Resultater

Frekvenser og karakter af somatiske mutationer

CSMD1 gen spænder 2,05 MB genomisk DNA på p arm af kromosom 8. den kodende sekvens del af genet er 11,740 nukleotider (0,0234 Mb pr diploid genom). Vi sekventeret i alt 54 kolorektale tumorer svarende til 1,26 MB CSMD1 CDS DNA. Vi identificerede og Sanger-verificeret 16 somatiske mutationer i 6 af de 54 kolorektale tumorer (11%) (tabel 2). Vi derefter beregnet en somatisk mutation på 11.90 mutationer /MB, en sats, der er mærkbart højere end genom-dækkende baggrund mutationsrater af mikrosatellit-stabil kolorektal kræft [3], [38].

de somatiske mutationer var signifikant beriget med ikke-synonyme ændringer i forhold til synonyme ændringer. På Sanger bekræftet varianter identificerede vi 15 ikke-synonyme (NS) mutationer og 1 synonym (S) mutation, for en NS /S-forhold på 15:01. Sandsynligheden for dette mange (eller flere) ikke-synonyme mutationer forekommer tilfældigt alene er 0,014, argumenterer imod den hypotese, at CSMD1 er en passager gen påvirkes af en mutator fænotype. Jo mere sandsynlige forklaring er, at ikke-synonyme mutationer er udvalgt til under kolorektal udvikling af kræft. Det er vigtigt at bemærke, at tumor 517 havde 10 somatiske mutationer til CSMD1, hvoraf ni var ikke-synonyme. Sandsynligheden for dette mange ikke-synonyme mutationer forekommer tilfældigt alene er 0,1. Den alternative hypotese er, at selektivt tryk kørte akkumuleringen af ​​multiple CSMD1 ikke-synonyme varianter inden for samme tumor, eventuelt bosiddende i separate subkloner. De varierende undergrupper af mutationsfrekvenser i CSMD1 hentyde til denne tro, at de multiple CSMD1 mutationer opstået separate subkloner i samme tumor population (Figur 1).

Ti CSMD1 somatisk mutation blev fundet i Tumor 517. Men disse særlige mutationer forekommer ved varierende delmængder af koncentrationer, hvilket viser at hver delmængde kan være opstået fra en uafhængig klon i tumoren befolkning.

Da progression af adenocarcinom kan drives af mutationer til KRAS onkogenet, analyserede vi mutationen hotspots ved codon 12 og 13 i exon 2 ved anvendelse Sanger-sekventering af PCR-produkter. KRAS hotspot somatiske mutationer blev set i 21 af de 54 kolorektale tumorer (~39%). Tre tumorer indeholdt somatiske mutationer i både CSMD1 og KRAS, med to af de tre tumorer udviser en højere CSMD1 mutant allel frekvens end KRAS mutante allel (tabel 1). Dette resultat kan indikere, at CSMD1 somatiske mutationer forud KRAS somatiske mutationer, der menes at forekomme tidligt under kolorektal tumorudvikling. En tumor havde CSMD1 mutation allel koncentrationer, der var mindre end KRAS mutant allel koncentration, måske indikerer, at CSMD1 mutationer i denne tumor skete efter de KRAS-mutationer. Stadig, at klonen huser CSMD1 mutante allel ekspanderet tilstrækkeligt til, at CSMD1 mutante allel påvises, hvilket viser, at denne udvidelse ikke blev drevet af den mutante allel KRAS. For at kunne bestemme tidsfristerne for CSMD1 og KRAS-mutationer, vil blive krævet bihuler sekvensanalyse af tidlige læsioner såsom adenomer. Ikke desto mindre er vores observationer indikerer, at CSMD1 ikke-synonyme mutationer giver tumorceller med en selektiv fordel, der fungerer uafhængigt af den fordel, som KRAS-mutationer.

Kolorektal tumorer med CSMD1 LOH og somatiske mutationer Vis Tidlig klinisk præsentation

Ud af de 54 tumorer sekventerede, Syvogtredive havde to eller flere loci, der var heterozygote for germline varianter og kunne derfor vurderes for CSMD1 allel ubalance ved Sekventiel Sandsynlighed Ratio Test [39], [40]. Fifty-én procent (19/37) af de kolorektale tumorer var ubalanceret på to eller flere sammenhængende CSMD1 loci (figur 2, tabel 1), hvilket indikerer, at CSMD1 tab af heterozygositet kunne have fundet sted i disse tumorer. Selvom forskellen ikke var statistisk signifikant, den gennemsnitlige alder for diagnose for patienter med CSMD1 allel ubalance var yngre end dem med afbalancerede alleler (60 år vs. 69 år, Mann-Whitney p = 0,052). Den gennemsnitlige alder ved diagnose for patienter med CSMD1 somatiske mutationer var også yngre end for dem uden somatiske mutationer (58 år vs. 66 år), selvom denne forskel var også ikke statistisk signifikant. Tab af heterozygositet er en mekanisme, der samvirker med somatisk mutation til at inaktivere tumorsuppressorgener. Vi observerede, at patienter med både ubalancerede og muterede CSMD1 alleler var signifikant yngre i en alder af diagnose (41 år) end patienter med en afbalanceret og vildtype CSMD1 (68 år, Mann-Whitney p = 0,0077). I modsætning til vores tidligere undersøgelser [17], har vi ikke observere en signifikant sammenhæng mellem CSMD1 somatisk mutation status og tumor stadie i denne serie af prøver. Ikke desto mindre er det statistiske beviser vedrørende klinisk præsentation falder sammen med de seneste undersøgelser foretaget af The Cancer Genome Atlas (TCGA). Baseret på en Kaplan-Meier Survival Analysis, afslørede TCGA sekventering data, som kolorektal cancer patienter med CSMD1 ændringer har en signifikant lavere sandsynlighed for overlevelse end patienter uden CSMD1 ændringer (log-rank test p = 0,000565) [41]. Med sådanne beviser, identifikation af CSMD1 ændringer har potentialet til at blive brugt som markører i kolorektal cancer prognose.

Den øvre grænse kurve vist i grafen viser CI tærsklen på 95% af CSMD1 loci klassificeres som ubalanceret, mens den nedre grænse kurve viser CI tærsklen på 95% af CSMD1 loci klassificeres som afbalanceret. Tumorer med to eller flere sammenhængende loci, der blev-afbalancerede blev klassificeret som har undergået tab af heterozygoti. Loci, der faldt mellem de to tærskler blev anset ubestemt for allel karakterisering. Visse loci i CSMD1 demonstrerede allel balance, selv om de var bosat i tumorer, der var ubalanceret for CSMD1. Dette resultat hentyder til kromosomale pauser, der opstår inden for CSMD1 gensekvens, nedstrøms for det undersøgte loci

Overskud af CG . TA Mutationer og CSMD1 Methylering

Exome sekventering af tarmkræft har afsløret, at flere tumorer har global overskud af CG TA somatiske mutationer [2], [3]. Vi observerede 7 af 15 (46,7%) CSMD1 somatiske mutationer var CG TA overgange (tabel 2). Denne klasse af mutation opstår fra ikke-enzymatisk deaminering af 5′-methylcytosin at producere thymidin. Tabel S2. Tabel S3.