PLoS ONE: Kvantificering af kræft i bugspytkirtlen Proteome og Phosphorylome: Angiver molekylære begivenheder Sandsynligt Medvirkende til Kræft og aktivitet af Drug Targets

Abstrakt

Målsætning

LC-MS /MS phospho-proteomics er en væsentlig teknologi til at hjælpe optrævle de komplekse molekylære begivenheder, der fører til og udbrede kræft. Vi har udviklet en global phospho-proteomisk arbejdsgang til at bestemme aktiviteten af ​​signalveje og narkotika mål i bugspytkirtelkræft væv til klinisk anvendelse.

Metoder

Peptider som følge af tryptisk fordøjelse af proteiner udvundet fra frosne væv af pancreas duktal adenokarcinom og baggrund pancreas (n = 12), blev mærket med tandem mass tags (TMT 8-plex), adskilt af en stærk kationbytterkromatografi, derefter blev analyseret ved LC-MS /MS direkte eller først beriget med phosphopeptider ved brug IMAC og TiO

2, før analyse. In-house, blev kommercielle og freeware bioinformatiske platforme bruges til at identificere relevante biologiske begivenheder fra komplekset datasæt.

Resultater

Af 2.101 proteiner identificeret, 152 demonstrerede signifikant forskel i overflod mellem tumor og ikke- tumorvæv. De omfattede proteiner, der er kendt for at blive opreguleret i bugspytkirtelkræft (fx Mucin-1), men de fleste var nye kandidat markører såsom HIPK1 MLCK. Af de 6.543 unikke phosphopeptider identificeret (6.284 unikke phosphoryleringssteder), 635 viste signifikant regulering, især dem fra proteiner involveret i celle migration (Rho guanin nukleotid valutaforhold MRCKα) og dannelse af fokale sammenvoksninger. Activator phosphoryleringssites på FYN, Akt1, ERK2, HDAC1 og andre lægemiddelkandidater fandtes at være stærkt moduleret (≥2 gange) i forskellige sager fremhæve deres forudsigelseskraft.

Konklusion

Her er vi forudsat kritiske oplysninger gør det muligt for os at identificere de fælles og unikke molekylære begivenheder sandsynligvis bidrager til kræft i hvert enkelt tilfælde. Sådanne oplysninger kan bruges til at hjælpe med at forudsige mere skræddersyede terapi egnet til en individuel sag

Henvisning:. Britton D, Zen Y, Quaglia A, Selzer S, Mitra V, Lößner C, et al. (2014) Kvantificering af kræft i bugspytkirtlen Proteome og Phosphorylome: Angiver molekylære begivenheder Sandsynligt Medvirkende til kræft og Aktivitet af Drug Targets. PLoS ONE 9 (3): e90948. doi: 10,1371 /journal.pone.0090948

Redaktør: Jon CD. Houtman, University of Iowa, USA

Modtaget: August 6, 2013; Accepteret: 5 Februar 2014; Udgivet 26. marts, 2014

Copyright: © 2014 Britton et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Alle værker udført i denne undersøgelse i fællesskab finansieret af Institut for Liver Studies, Kings College Hospital og Proteome Sciences plc. De finansieringskilder beskæftigede de forskere og klinikere, der spillede afgørende roller i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, og forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Vi har følgende interesser. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af Proteome Sciences plc, arbejdsgiver for David Britton, Stefan Selzer, Vikram Mitra, Christopher Lößner, Stephan Jung, Gitte Böhm, Peter Schmid, Petra Prefot, Claudia Hoehle, Sasa Koncarevic, Malcolm Ward, Hans Dieter Zucht og Ian Pike. Alle medarbejdere i Proteome Sciences plc (undtagen nyansatte Vikram Mitra) holde lager eller aktieoptioner i Proteome Sciences plc. Proteome Sciences producerer også TMT reagenser, der anvendes i denne undersøgelse, og disse reagenser er nu licenseret til distribution af Thermo Fisher Scientific. Der er ikke yderligere patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke vores tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Protein fosforylering er en fælles proces modulere aktiviteten af onkogene og tumorsuppressorproteiner [1] – [3]. I mange tilfælde, phosphorylering resulterer i switch-lignende ændringer i proteinfunktion, på grund af modulation af proteinfoldning, substrat affinitet, stabilitet og aktivitet af sine substrater, som igen påvirker signalveje kontrollerende celle proliferation, migrering, differentiering og apoptose, dysregulering sammen bidrager til cancerfænotypen [4]. Pancreas cancer er en af ​​de mest aggressive maligne neoplasmer med en median overlevelse på 6 måneder. En betydelig del af patienterne er diagnosticeret på et fremskredent stadium, hvor terapeutiske muligheder er meget begrænset [5]. Som det er tilfældet for andre kræftformer, molekylær målrettet terapi er lovende for behandling af fremskreden eller recidiverende kræft i bugspytkirtlen [6]. Selv om en række molekylære målretning narkotika har været tilgængelige i det seneste årti, og forventes også mange andre i de kommende år, er et gennembrud stadig behov for forudsigelse af lægemiddelvirkninger og udvælgelse stof. For eksempel, sorafenib, en multi-kinaseinhibitor virker på hyperaktive vaskulær endotelvækstfaktor-receptor, blodpladeafledt vækstfaktorreceptor og Raf, har dokumenteret effekt hos nogle patienter med fremskreden hepatocellulært carcinom [7], men vi kan ikke på nuværende tidspunkt forudsige dens virkning på en individuel patient inden behandlingen påbegyndes. For at overvinde disse vanskeligheder, synes det afgørende at etablere en analytisk tilgang til at hjælpe narkotika udvælgelse, hvor udtryk og aktivitet af flere lægemiddelkandidater er udførligt vurderes fra sag til sag. Phosphorylering er en central begivenhed modulerende protein aktivitet, derfor måle proteinphosphorylering er en nyttig indikator for aktivering status.

Der er hundredvis af anti-cancer lægemiddelvirkninger og onkogene signalproteiner der er relevante for terapeutisk udvalg derfor måler udtryk og aktivering status alle bruger den nuværende guldstandarden analyse, immunhistokemi (IHC), er ikke mulig. I denne henseende, IHC opretholder en rolle som en validering værktøj. Omvendt fase protein microarrays (RPMA) har begrænsninger på grund af en begrænset antistofrepertoire og dårlig specificitet /krydsreaktivitet. Hertil kommer, at genomics-baserede teknologier ikke tillade phospho-signalering målinger. Væskekromatografi – tandem-massespektrometri (LC-MS /MS) baseret blevet udviklet proteom tilgange til at identificere og kvantificere tusindvis af proteiner og deres phosphoryleringssteder [8], [9]. I denne undersøgelse har vi udviklet en LC-MS /MS baseret phospho-proteomisk arbejdsgang (SysQuant) til at overvinde mange af de tekniske og bio-informatik vanskeligheder ved effektivt at kvantificere ekspression og aktivitet af signalanlæg proteiner, hvoraf mange er narkotika mål, på globalt eller hele systemet niveau i tumorvæv. Vi sammenlignede frosset reseceret væv (tumor versus ikke-tumor baggrund) fra tolv tilfælde af pancreas hoved duktalt adenokarcinom og øget gennemløb under anvendelse reporter ion isotopologues af TMT, hvilket resulterer i 8-plex reagenser og derfor muligheden for at køre otte prøver samtidigt [10], [11]. Molekylære begivenheder, der kan bidrage til kræft blev identificeret fælles for alle tilfælde dog nogle var enestående til en individuel sag eller undergruppe. Der syntes også at være en sammenhæng mellem tid for tilbagefald og gruppering af sager følgende primære komponent analyse af T /NT forhold mellem phosphopeptider. Phosphopeptid analyse ved hjælp SysQuant kan identificere nye terapeutiske mål og også hjælpe stratificere patienter i forskellige behandlingsregimer baseret på aktivering status signalveje og kendte drug targets.

Materialer og metoder

Etiske aspekter og forskning protokol blev godkendt af BioBank udvalg af Institut for Liver Studies, Kings College Hospital (reference 08 /H0704 /117). Alle deltagere forudsat skriftligt informeret samtykke til at bruge deres vævsprøver til forskning. Tolv tilfælde af pancreas hoved duktalt adenokarcinom blev selekteret (tabel S1 i tabel S1). Yderligere ikke-fortrolige kliniske oplysninger såsom tumor stadie, køn og tilbagefald kan ses for hver enkelt sag i tabel S2 S3 i tabel S1. Tumor (T) vævsprøver blev taget fra pancreas tumormasser, mens ikke-tumor (NT) prøver var fra pankreas væk fra tumormassen. Alle vævsprøver blev frosset inden for 30 minutter kirurgisk resektion og lagret [ved -80 ° C] indtil analyse af SysQuant (median tid lagerplads [18,5 måneder] spænder [4-28 måneder]. T versus NT blev sammenlignet ved hjælp SysQuant og eksperimenterende detaljer er beskrevet i Methods S1 dokument. sammenfattende er dette indebar protein ekstraktion fra vævsprøver (ug anvendte mængder for hver prøve er vist i tabel S4 i tabel S1), trypsin fordøjelse af proteiner til peptider, TMT 8-plex mærkning af peptider (tumor og ikke-tumorvæv fra 4 tilfælde pr TMT 8-plex) efterfulgt af blanding til dannelse af en enkelt 8-plex prøveblanding (se tabel S5, i tabel S1). Hver TMT 8-plex prøve blev derefter opdelt i tre uafhængige aliquoter, som hver blev yderligere opdelt i 12 fraktioner ved stærk kationbytter (SCX) kromatografi (tabel S6, i tabel S1). Det første sæt 12 SCX fraktioner blev derefter analyseret direkte ved hjælp af LC-MS /MS ved anvendelse dublerede data afhængig erhvervelse kørsler efterfulgt af en tredje run ved hjælp tidsafhængig afvisning af alle funktioner er identificeret i 1. og; 2. De resterende to sæt af 12 fraktioner blev først beriget for phosphopeptider bruger enten immobiliseret metal-affinitetskromatografi (IMAC) eller TiO

2 (tabel S6, i tabel S1). De resulterende 24 phosphopeptidsøjler berigede fraktioner blev også analyseret ved LC-MS /MS. I alt blev udført 108 separate LC-MS /MS-kørsler for hver TMT 8-plex prøve. Rå massespektrometriske data blev søgt mod den menneskelige UniProtKB /Swiss-Prot database ved hjælp af Mascot og SEQUEST (via Proteome Discoverer). Peptid spektrum kampe (PSMS) blev afvist, hvis identificeret med kun lav tillid (≥5% FDR), viste ≤75% phospho-RS sandsynlighed score, og havde mangler kvantificering kanaler (f.eks ikke alle toppe for isobare tags synlige i spektre). Rå intensitetsværdier for isobare tags fra PSM’er passerer filtre blev anvendt til kvantificering, men først normaliseret under anvendelse sum-skalering (som vist i fig S1) for at reducere potentiel eksperimentel /systematisk bias. Log

2 nøgletal blev beregnet ud fra isobare tag intensiteter, der viser reguleringen mellem T i NT for hver enkelt sag. En phosphopeptid T /NT log

2-forholdet er medianen T /NT log

2-forholdet fra alle PSM’er unikke for denne specifikke peptidsekvens. Et protein T /NT log

2-forholdet er medianen T /NT log

2-forholdet fra alle unikke ikke-phosphorylerede peptider unikke for denne specifikke protein. En sidet t-test (one-prøvested test) blev anvendt til at beregne p-værdier. P-værdier blev plottet mod log

2 T /NT nøgletal på Volcano grunde til at identificere betydeligt regulerede peptider. På proteinniveauet blev annotation hjælp GO-vilkår, Kegg-stier og Drugbank information tilføjet, og proteiner blev også kortlagt til veje ved hjælp af ressourcer som DAVID og STRING. På phosphoryleringssite niveau annotation hjælp PhosphoSitePlus blev tilsat, herunder kendte funktionelle og biologiske /patologisk rolle phosphoryleringssite. Partial Least Squares diskriminantanalyse (PLS-DA) blev anvendt til at modellere og undersøge den multivariate datasæt til at identificere outliers og grupper fra alle peptid isobare tag intensiteter fra hvert filter passerer PSM, samt log

2 T /NT-forhold (phosphopeptider ) fra alle grene af workflow (IMAC, TiO

2 og ikke-beriget). Den SysQuant workflow, der kombinerer phospho-proteomisk prøveforberedelse, LC-MS /MS analyse, og bioinformatik analyse, blev anvendt til at identificere vigtige molekylære begivenheder vi mener bidrager til kræft i bugspytkirtlen i de analyserede her tilfælde.

Resultater og Diskussion

Alle peptider identificeret af SEQUEST og Mascot i denne undersøgelse blev eksporteret fra Proteome Discoverer og kan ses på zip-filer S1, S2, og S3. File S1 indeholder alle peptider (phosphorylerede og ikke-phosphorylerede) identificeret fra prøverne i TMT 8-plex-1, File S2 indeholder alle peptider identificeret fra prøver i TMT 8-plex-2, og File S3 indeholder alle peptider identificeret fra prøver i TMT 8-plex-3. Disse supplerende zip-filer vist detaljerede oplysninger, herunder SEQUEST Xcorr, Mascot ioner scoringer, AM [ppm], kaffemaskine Q-værdier, og andre vigtige oplysninger. Data fra disse excel dokumenter var input til in-house bioinformatiske værktøjer til at identificere biologisk relevante arrangementer.

I alt vi identificeret 6.543 unikke phosphopeptider sekvenser (6.284 unikke phosphoryleringssteder), fra 2.101 proteiner (tabel 1). Figur 1 viser identificerede peptid (phosphoryleret og ikke-phosphoryleret) fordeling over alle tre arme (ikke-beriget, TiO

2, IMAC) på SysQuant workflow for hver TMT 8-plex. Figur 1 illustrerer også antallet af peptider påvist i alt for alle tre analytiske gentagelser (efter at kombinere numre fra forskellige fraktioner) i hver, og alle TMT 8-plex prøver. Når resultaterne fra hver af de parallelle komponenter (TiO

2, IMAC, ikke-beriget) sammenlignes fordelene ved en kombineret berigelse tilgang og multiple analytiske gentagelser (herunder udnyttelse af tiden afvisningslisten afhængig), er tydelige. Det største samlede antal phospho-peptider blev set ved hjælp af IMAC berigelse som tegnede sig for 79% af alle unikke phosphopeptider identificeret. Imidlertid TiO

2 fraktioner identificeres entydigt næsten 19% af det samlede, som ville blive savnet anvendelse af en enkelt phosphopeptid berigelse strategien (figur 1: TMT 8-plex-ALL: A). Det samme gælder for de tre analytiske kørsler udført på hver prøve. Hvis en enkelt data afhængig kørsel blev udført kun 20.318 unikke peptider ses (Figur 1: TMT 8-plex-ALL: D). En anden data-afhængig run tilføjer 5.868 peptider, mens brugen af ​​tiden afvisningslisten afhængig i løb 3 tillades yderligere 3257 peptider kan identificeres samlet. Kollektivt (køre 2 3) dette udgør yderligere 45% over køre en alene og 31% af det samlede antal unikke peptider. Vigtigere peptider identificeret i tredje løb er generelt af lavere overflod. Vi illustrerer også (Figur S2) antallet af unikke phosphopeptider og ikke-phosphopeptider identificeret i hvert rå fil, fra hver SCX fraktion, i hver arm af arbejdsprocessen (ikke-Enrich, TiO

2, og IMAC), fra hver TMT 8-plex prøve (TMT 8-plex-1, 2, 3)

Venn diagrammer demonstrerer antal.; A: unikke phosphopeptidsøjler sekvenser, B: unikke ikke-phosphopeptidsøjler sekvenser og C: samlede antal unikke peptidsekvenser identificeret i TiO

2, IMAC, og /eller ikke-berige arm af SysQuant workflow, på tværs af alle tre TMT 8-plex prøver i alt (TMT 8-plex-ALL) og individuelt pr TMT 8-plex (TMT 8-plex 1, TMT 8-plex 2, TMT 8-plex 3). D: viser niveauet af overlapning vi observerer for peptid identifikationer fra analytisk kørsel 1, analytisk kørsel 2, og analytisk kørsel 3 (herunder tid afhængig afvisning liste kompileret fra identifikationer fra kørsel 1 og 2)

.

af de 6543 phosphopeptider identificeret, 5409 var kvantificerbare. På grund af det store antal kvantificerbare phosphopeptider disse skal ses på en separat excel-fil (File S4), snarere end som en del af hoveddokumentet. File S4 viser phosphopeptidsøjler sekvenser, de phosphorylerede rester og navnet protein og UniProt tiltrædelse nummer som peptid tilhører. File S4 viser også alle kvantitative og statistiske oplysninger vedrørende phosphopeptiderne i tumor versus ikke-tumor fra alle tilfælde, og giver også annotation oplysninger, herunder kendte funktionelle effekter af phosphorylering begivenhed. Disse oplysninger blev udvundet fra PhosphositePlus databasen og kan observeres i kolonner BM-CP. File S4 indeholder også funktionelle oplysninger om proteinet, oplysninger fra GO vilkår (kolonne CQ-DC), og om sådanne proteiner er kendt lægemiddeltargets (kolonne DD-GD) udvundet fra Drug Bank databasen. For yderligere oplysninger om den relative protein overflod og normaliserede phosphopeptidsøjler niveauer (phosphopeptidsøjler normaliseret til protein-niveau) henviser til fil S5. Den relative forekomst af phosphopeptider i tumor versus ikke-tumorvæv skifter fra sag til sag primært skyldes ændringer i ekspressionsniveauet af det phosphorylerede protein eller grundet moduleret aktivitet af kinaser og phosphataser inducerer eller vending phosphorylering af proteinsubstratet hhv. I File S5 normalisere vi den relative forekomst af en phosphopeptid til den relative forekomst af det respektive protein. Relativ protein overflod beregnes ved hjælp kun ikke-phosphorylerede peptider derfor der er tilfælde, hvor vi ikke er i stand til at udføre normalisering som følge af fraværet af ikke-phosphorylerede peptider til nogle af proteinerne.

PLS-DA

den første Principal Component (PC1) viser variabiliteten indført på grund af de tre forskellige grene af arbejdsgangen. Disse tre arme IMAC, TiO

2 og totalt protein (dvs. ikke-beriget), som vist i figur 2A og figur S3, har adskilt variablerne i 3 separate klynger. Den helt sorte cirkel i figur 2A viser T2 hotelling rum baseret på 95% sikkerhed. PC1 forklarer 13,6% af den samlede varians i datasættet. Den anden Principal Component (PC2) illustrerer variationen indført ved forskellige TMT 8-plex kanaler. Denne variabilitet understreger primært patient til patient varians, som er 10,56% af den samlede varians i datasættet. Den mellem klasse variation, dvs. Tumor (T) vs Non-Tumor (NT), er vist ved den tredje hovedkomponent (PC3), hvilket forklarer 14,36% af den samlede varians i datasættet. Figur 2B og figur S4 viser gruppering af variabler i to separate klynger, dvs. T og NT. Forskelle på tværs af de forskellige grene af arbejdsgangen har også påvirket PC3, hvilket illustreres af den sammenslutning af TotalProtein (ikke-berigede) peptider i en enkelt klynge i figur 2B. Kun patient 12 viser ikke nogen forskel i T sammenlignet med NT ifølge figur 2B. PLS bi-plots viser, at der ikke var nogen outliers i dette datasæt, som vist på hoteling T2-Range plot (Figur S3). PLS bekræftede, at forsøget var en succes, og at der er betydelige forskelle mellem T og NT. Forskelle på tværs af de tre forskellige arme af arbejdsgangen eksisterer, men TiO

2 og IMAC har en næsten lige korrelation. Sammen PC1, PC2 og PC3 forklare 38,52% af den samlede varians i datasættet. Den resterende variation i datasættet kan tilskrives blandede effekter af analytisk og biologisk variation

A:. PC1 og PC2 score plot af de første to hovedkomponenter beskriver 13,6% (PC1) og 10,6% (PC2) af den samlede varians i data (rå isobare tag intensiteter fra hver PSM passerer sæt filtre). Cirklen viser T2 hotelling rum baseret på 95% sikkerhed. B: PC2 og PC3 score plot af de næste hovedkomponenterne beskriver 10,6% (PC2) og 14,4% (PC3) af den samlede varians i data. C: PC1 og PC2 score plot af de første to hovedkomponenter beskriver 25,8% (PC1) og 19,3% (PC2) af den samlede varians i data (median log

2 T /NT forhold for alle kvantificerbare phosphopeptider i hvert enkelt tilfælde ). Her er vi vist også tid af tilbagefald i måneder for hvert enkelt tilfælde, efter operation

Ud over at undersøge rå isobare tag intensiteter i T NT prøver at identificere outliers og grupper, PLS-DA blev også brugt til at undersøge loggen

2 T /NT nøgletal fra alle phospho-peptider (median fra IMAC, TiO

2, Ikke-beriget) i hvert enkelt tilfælde, som vist i figur 2C. En subtil sammenhæng mellem den sammenslutning af sager og tiden for fornyet synes at afslutte, men antallet af biologiske gentagelser vil skulle øges, før de kom til nogen endelige konklusioner. Når det er sagt er det interessant at observere sager 14 og 9 grupperet tæt og begge tilfælde oplevet meget tidligt tilbagefald på 2 og 5 måneder efter operationen, hhv. Cases 10 og 8 også samlet, men langt væk fra alle andre tilfælde. Case 10 viste tilbagefald på 31 måneder og case 8 havde ingen tegn på tilbagefald endda 23 måneder efter operationen. Sager 4, 12, 1, 7, 5 og 13 samles og disse viste gentagelse mellem 10 til 21 måneder efter kirurgi. Interessant tilfælde 6, hvilket er endnu at vise gentagelse, også grupperet med de sager, der viste tilbagefald på 10 til 21 måneder. Case 11 ikke gruppe med andre sager.

Markant reguleret proteinekspression

Vi bestemmes den relative forekomst af proteiner i tumor i forhold til ikke-tumorvæv, ved hjælp af median log

2 T /NT forhold af de ikke-phosphorylerede peptider unikke for hvert protein som surrogater til at beregne den relative forekomst af de respektive proteiner. En ensidig t-test blev anvendt til at beregne p-værdier, og disse blev plottet mod log

2 T /NT-forhold på en vulkan plot at detektere signifikante (Log

2 T /NT≥0.3 eller ≤-0,3 og p ≤ 0,05) regler end alle tilfælde (figur 3A). I alt var der 152 proteiner betydeligt reguleret baseret på Log

2 T /NT≥0.3 eller ≤-0,3 og p ≤ 0,05 (File S6_Sheet ‘Pro_TvNT eller 0.3_p 0,05). Tabel 2 viser de 12 mest markant opreguleres proteiner i tumor i forhold til ikke-tumorvæv, og også giver en beskrivelse af enhver kendt funktion af hvert protein eller forbindelse med kræft [13] – [31]. Overekspression af mucin-1 er ofte forbundet med cancer og vi fandt også mucin-1 at være signifikant opreguleret i pancreas tumorvæv. Interessant vi fandt mere betydelige opregulerede proteiner end mucin-1, hvoraf nogle kan vise sig at være mere specifikke markører for kræft i bugspytkirtlen, måske endda nye terapeutiske mål f.eks Homeodomæne-interagerende protein kinase 1 (HIPK1). HIPK1, der var forhøjet i tumor sammenlignet med ikke-tumor i alle tilfælde (median log

2 T /NT = 1,00; p = 1,59 E -04), er en af ​​fire HIPK serin /threoninkinaser, der vides at interagere med og regulere aktiviteten af ​​talrige cellulære proteiner herunder flere transkriptionsfaktorer og cofaktorer [32], [33], [34]. HIPKs har været impliceret i kontrollen af ​​en række cellulære veje til at regulere forskellige processer, herunder DNA beskadigelse respons, væv specifikation, og proliferation [34]. Salg

Volcano plots viser -log

10 P-værdier i forhold til at logge

2 T /NT nøgletal for; A: relative protein overflod (bestemt ud fra median ikke-phosphopeptid log

2 T /NT-forhold), B: phosphopeptider målt i IMAC, C: TiO

2, D: og ikke-beriget arm af SysQuant workflow . Røde cirkler påpeger betydeligt modulerede proteiner (log

2 T /NT nøgletal ≥0.3 eller ≤-0,3 og p-værdier ≤ 0,05) og phosphopeptider (log

2 T /NT nøgletal ≥0.75 eller ≤-0,75 og p -værdier ≤0.05). E: er et Venn-diagram, der illustrerer fordelingen af ​​de 635 phosphopeptider tværs af de tre grene af arbejdsproces, der blev væsentligt moduleret

For bedre at forstå de biologiske processer og Kegg signalveje afviger mellem tumor. og ikke-tumor vi valgte numre på alle betydeligt modulerede proteiner tiltrædelses- og uploadet disse til DAVID Bio-informatik ressource. Den Focal Vedhæftning Kegg signalvejen var mest væsentligt påvirket giver en Benjamini score på 1,0E-3. Markant modulerede Focal adhæsionsproteiner inkluderet; Talin-1, Filamin-A, Filamin-B, Filamin-C, Vinculin, Fibronectin, Zyxin, og Myosin let kæde kinase, glat muskulatur (figur 4 Fil S6_Sheet; FA lamellipodium). Talin-2, fokal adhæsionkinase 1 (FAK1), Protein phosphatase 1 regulatoriske underenhed 12A var også fokal adhæsionsproteiner og væsentligt moduleret men kan kun ses i File S6, da disse proteiner ikke var kvantificerbare i nogle tilfælde og Figur 4 viser kun proteiner kvantificerbar i alle tilfælde (fx ingen N /A). Alle disse fokale adhæsionsproteiner, undtagen FAK1, var signifikant opreguleret i tumor versus ikke-tumor tyder forøgede størrelse og /eller hyppigheden af ​​fokale adhæsioner i celler i tumoren. Fokale adhæsioner er kendt for at spille en rolle i migration af mange celletyper [35], [36], [37]. Under trækket de fokale adhæsioner kan forankre celler til ekstracellulære matrix efter dannelsen af ​​celle- fremspring eller fremspring; såsom pseudopodium, filopodium, og lamellipodium [37]. De fokale adhæsionsproteiner Vinculin og Myosin Light Chain kinase er også kendt for at være involveret i dannelsen af ​​lamellipodia og fremme celle motilitet. På figur 4 vi liste proteiner vides at være involveret i dannelsen af ​​vækstfremskrivninger og fokale sammenvoksninger, set at være signifikant moduleret og målbare i alle tilfælde. Plasmamembranen spænder ekstracellulære matrix-receptorer (Integriner) er væsentlige komponenter i de centrale sammenvoksninger men vi ikke observere statistisk signifikant modulation af enhver integrin udtryk men observere betydelig modulation af integrin fosforylering, som diskuteret senere. Samlingen af ​​fokale adhæsioner involverer også aktivering af Rho signalering samt myosin-induceret kontraktilitet [37]. Figur 4 viser også Myosin 9, 10, 11, og 14 var signifikant forhøjet i tumor sammenlignet med ikke-tumorvæv

Alle proteiner i denne figur viste sig at være forbundet med GO begreberne »lamellipodium ‘ »Kontaktpunkt vedhæftning” og også vist sig at være signifikant (p ≤ 0,05) op- eller ned- reguleret i tumor sammenlignet med ikke-tumorvæv og kvantificerbar i hvert tilfælde (fx alle proteiner indeholdende NA for alle tilfælde blev udelukket fra tabellen). Log

2 T /NT forhold af de ikke-phosphorylerede peptider fra hvert protein blev anvendt som surrogater til at beregne den relative forekomst af de respektive proteiner. Log

2 T /NT forhold mellem ikke-fosforylerede peptider blev i gennemsnit over tre arme af workflow (IMAC, TiO

2, Ikke berige).

Funktionelle roller fire proteiner i figur 4 (LIM og SH3 domæne protein 1, moesin, Palladin, og PDZ og LIM domæne protein 7) allerede er blevet diskuteret i tabel 2, men Alpha-actinin-4 (ACTN4) er en actin-bindende protein med flere roller i forskellige celletyper. I ikke-muskelceller, har det vist sig langs Microfilament bundter og adherens-type knudepunkter, hvor det er involveret i binding actin til membranen. Det menes at være involveret i metastatiske processer som Li Fu et al [38] viste, at overekspression af ACTN4 i kombination med 67 LR er forbundet med esophageal pladecellecarcinom (ESCC) progression. De viste, at ACTN4 differentielt blev udtrykt i ESCC væv i forhold til normale væv, og at ekspressionsniveauer af ACTN4 blev gradvist øget fra fase I til III. Klinisk-patologisk korrelation under anvendelse TMA afslørede, at overekspression af ACTN4 var signifikant associeret med fremskreden tumor stadium (P = 2.6E-2) og lymfeknudemetastaser (P = 4.9E-02) [38]. Plectin er også blevet foreslået som en cancer biomarkør, især for pancreascancer [39]. Selvom normalt et cytoplasmatisk protein, er plectin udtrykkes på cellemembranen i pancreas duktal adenokarcinom (PDAC) og kan derfor anvendes til at målrette PDAC celler [39]. Vores undersøgelse bekræfter, at både kræft biomarkører er betydeligt i udtrykt i tumor sammenlignet med ikke-tumorvæv i bugspytkirtlen kræftpatienter (median log

2 T /NT = 0,29 og p-værdi = 3.33E-02 for ACTN4, og median log

2 T /NT = 0,32 og p-værdi = 1.63E-03 for Plectin).

Catenin delta-1 er nødvendig for dannelsen af ​​celle-celle-adhæsion (adherensovergange) gennem dets interaktion med den cytoplasmatiske hale af klassiske og type II cadheriner. Catenin delta-1 modulerer også aktiviteterne i Rho familie af GTPaser (RhoA, Rac og Cdc42), hvilket tyder på, at sammen med andre Src substrater, catenin delta-1 regulerer actin dynamik. Således catenin delta-1 er en master regulator af adherens junction-dannelse og sandsynligvis deltager i reguleringen af ​​balancen mellem klæbemidlet og motile cellulære fænotyper [40]. Her har vi observerer faldt betydeligt niveauer af catenin delta-1 i tumor sammenlignet med ikke-tumorvæv (median log

2 T /NT = -0,29 og p-værdi = 1.34E-02). Når man overvejer de vigtige rolle catenin delta-1 spiller i formning /vedligeholde adherensovergange mellem epitelceller, og i betragtning af vores observerede fald i udtryk og phosphorylering af dette protein er det tyder på, at disse begivenheder kan bidrage til dissociation af epitelceller, og derfor epitel til mesenkymale overgang . i bugspytkirtelkræft

af særlig interesse er at opdage, at Myosin let kæde kinase (MLCK) er signifikant overudtrykt i tumor sammenlignet med ikke-tumorvæv (median log

2 T /NT = 0,5 p- value = 2.95E -02). MLCK er en Ca

2 + /calmodulin-afhængig proteinkinase, der regulerer en række cellulære funktioner, såsom, muskelsammentrækning og cellemigration, via phosphorylering af myosin let kæde-proteiner. Da tumor celle migration er et vigtigt skridt i tumor spredning, kan myosin let kæde kinase (MLCK) betragtes som et terapeutisk mål for forebyggelse af tumor spredning. Faktisk er der fundet MLCK aktivering og udtryk at blive positivt relateret til metastatisk tilbøjelighed. Desuden har MLCK inhibitorer vist sig at mindske invasivitet af forskellige cancerceller [41]. Interessant sager 14, 9, 4 og 13 har højeste MLCK og tre ud af fire af disse tilfælde viser også meget tidligt tilbagefald (2 måneder, 5 måneder, 10 måneder, den længste med 21 måneder tilbagefald, henholdsvis) . Måske er disse fire tilfælde ville drage fordel af MLCK inhibitor terapi, hvis patienten stratificering var baseret på høj ekspression af target medikament i tumor versus ikke-tumor. Case 10 viste de laveste niveauer af MLCK i tumor sammenlignet ikke-tumor korrelerer med denne sag viser den længste tid, før gentagelse af 31 måneder. MLCK spiller også en rolle i p38 MAPK signalering en pathway demonstrerer øget aktivitet i flere af tumorerne i denne undersøgelse, som beskrevet senere.

Observing forøget Myosin ekspression i tumorvæv er også af særlig interesse som MYH9 (median log

2 T /NT = 0,29 og p-værdi = 5.93E-03), MYH10 (median log

2 T /NT = 0,23 og p-værdi = 2.18E-02), MYH14 (median log

2 T /NT = 0,35 og p-værdi = 2.03E-02) er alle cellulære myosiner der er kritiske for cytokinese, celle form, og specialiserede funktioner såsom sekretion og loft. Under celle sprede disse tre, spiller en vigtig rolle i cytoskeleton reorganisering, fokal kontakter dannelse (i den centrale del, men ikke margenerne for spredning celler) og MYH10 inducerer lamellipodial forlængelse, mens denne funktion er mekanisk antagoniseres af MYH9, som menes at forårsage lamellipodial tilbagetrækning.