PLoS ONE: Udvikling af en meget stabil PLGA-mPEG Nanopartikel Læsset med cisplatin for kemoterapi af kræft i æggestokkene

Abstrakt

Baggrund

Cisplatin er et potent anticancer narkotika, men den kliniske anvendelse har været begrænset på grund af sine uønskede fysisk-kemiske egenskaber og alvorlige bivirkninger. Bedre formuleringer narkotika for cisplatin er stærkt ønsket.

Metode /vigtigste resultater

Heri har vi udviklet en nanopartikel formulering til cisplatin med høj indkapslingseffektivitet og reduceret toksicitet ved hjælp af cisplatin-tværbundet carboxymethylcellulose ( CMC) core nanopartikler fremstillet af poly (lactid-co-glycolid) -monomethoxy-poly (polyethylenglycol) copolymerer (PLGA-mPEG). Nanopartiklerne har en gennemsnitlig diameter på ca. 80 nm målt ved transmissionselektronmikroskopi (TEM). Indkapslingseffektiviteten af ​​cisplatin i nanopartiklerne er op til 72%. I mellemtiden har vi også observeret en kontrolleret frigivelse af cisplatin på en bæredygtig måde og dosisafhængig behandlingseffekt af cisplatin nanopartikler mod IGROV1-CP celler. Desuden var den gennemsnitlige letale dosis (LD

50) af cisplatin nanopartikler var over 100 mg /kg ved intravenøs administration, som var meget højere end for frit cisplatin.

Konklusion

Dette udviklede cisplatin-loaded nanopartikel er en lovende formulering til levering af cisplatin, som vil være en effektiv terapeutisk regime af kræft i æggestokkene uden alvorlige bivirkninger og kumulativ toksicitet

Henvisning:. Cheng L, Jin C , Lv W, Ding Q, Han X (2011) Udvikling af en meget stabil PLGA-mPEG Nanopartikel læsset med cisplatin for kemoterapi af kræft i æggestokkene. PLoS ONE 6 (9): e25433. doi: 10,1371 /journal.pone.0025433

Redaktør: Martin W. Brechbiel, National Institutes of Health, USA

Modtaget: April 28, 2011; Accepteret: September 5, 2011; Udgivet: 26 September, 2011

Copyright: © 2011 Cheng et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkende støtte fra China International Science and Technology Samarbejde Foundation (2007DFC30306, https://www.cistc.gov.cn/), og Zhejiang Technology Project Foundation (2009C11122, https://www.zjkjt.gov.cn/html /index.htm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Cisplatin-baserede terapeutiske regimer er blevet etableret som standard første-line kemoterapi for patienter med kræft i æggestokkene siden midten af ​​1980’erne [1] – [3]. Imidlertid har anvendelsen været begrænset på grund af alvorlige bivirkninger og kumulativ toksicitet på større organer, såsom lever, nyre, hjerte og nervesystem ved intravenøs administration [4] – [7]. I de senere år har der fundet talrige nanostørrelse lægemiddelbærere blevet udviklet til at minimere bivirkninger af cisplatin og forbedre dets antitumorvirkning gennem former af miceller, såsom poly (asparaginsyre) -poly (ethylenglycol) miceller, liposomer såsom pegylerede liposomer og faste lipidnanopartikler under cancerterapi [8] – [13]. Opløseligt lægemiddel-polymer-konjugater er også blevet udviklet til at forøge opløseligheden af ​​cisplatin. Sådanne konjugater indbefatter cisplatin komplekser med polycarboxylater, poly (amidoaminer), polyamidoamin dendrimerer og polyacryl kæder. Disse systemer kan reducere toksicitet og opnå ideel effekt af kemoterapi [14] – [16].

Poly (mælke-co-glycol) syre (PLGA) mikropartikler er også blevet anvendt til cisplatin indeslutning grundet dens biokompatible og bionedbrydelige egenskaber [17], [18]. Avgoustakis K et al. har vist, at intravenøs administration af PLGA-mPEG nanopartikler ladet med cisplatin resulterer i en signifikant forlængelse af cisplatin tilstedeværelse i blodet hos mus [19]. Men indkapsling effektiviteten af ​​cisplatin er stadig fattige under forberedelsen af ​​PLGA-mPEG nanopartikler fyldt med cisplatin. Gryparis EF et al. [20] har fundet, at nanopartikel ansøgning har mulighed for at opretholde tilstrækkelige eller flere koncentrationer af cisplatin i 2 uger, men relativt lavt indhold af PLGA-mPEG PEG kan fremkalde en forøgelse af nanopartikel størrelse. Endvidere er det ønskeligt at opnå en bæredygtig frigivelse og tilstrækkelig koncentration af cisplatin i kliniske omgivelser, fordi kontinuerlig lavdosis administration af cisplatin er mere effektiv til at inducere apoptose end en enkelt eksponering af cisplatin [21] højdosis, [22].

Hovedformålet med nærværende arbejde er at udvikle et innovativt nanopartikel med en høj indkapslingseffektivitet og bæredygtig frigivelse af cisplatin. I denne nanopartikel delivery system, har d-alfa tocopherylpolyethylenglycol 1000 succinat (TPGS) som en ny effektiv emulgator til gavn for menneskers sundhed blevet brugt og de biologisk nedbrydelige PLGA-mPEG nanopartikler med CMC kerner er blevet udviklet. I mellemtiden har lastning og indkapslingseffektivitet af cisplatin også blevet bestemt. Desuden har antitumorvirkningen af ​​nanopartikler ladet med cisplatin på muse ovariecancer model blevet evalueret. Afslutningsvis giver det forbedrede cisplatin leveringssystem et rationelt design til potentiel terapeutisk anvendelse af cisplatin kræft i æggestokkene.

Resultater

Rationel udformning af CMC og TPGS at forberede PLGA-mPEG nanopartikler med cisplatin

Det er en udfordring at forberede nanopartikler fyldt med cisplatin ved hjælp af PLGA-mPEG copolymerer på grund af deres fysisk-kemiske egenskaber og forberedelse betingelser. I denne undersøgelse har vi foretaget en rationel udformning af nanopartikler indeholdende cisplatin ved at skræddersy den sammensætninger, størrelse og form. Først blev PLGA-mPEG copolymerer syntetiseret fra lactid og glycolid i nærvær af mPEG

5000, hvis hydroxylgruppe kunne initiere polymerisation af ringåbning af lactid og glycolid. Strukturen af ​​det syntetiserede copolymer blev påvist ved

1H NMR i CDC

3, som vist i figur 1. toppe ved 1,65 og 5,10 ppm tilhørte protonerne fra methin (CH) og methyl (-CH

3) grupper af PLGA segmenter mens toppene af methene protoner (-CH

2) i PEG-segmenter placeret på 3,65 ppm, og toppene af methene protoner (-COCH

2O-) placeret på 4,78 ppm var repræsentationen af ​​konjugerede segmenter af PLGA og mPEG så at ingen andre toppe blev detekteret. Den eneste top i GPC-spektrum (figur 2) afslørede den vellykkede syntese af PLGA-mPEG-copolymerer med høj renhed. Polydispersitetsindekset (PI) som en måling af fordelingen bredde for molekylvægte var 1,78. På grundlag af gelpermeationskromatografi (GPC), og forholdet mellem

1H toparealer mellem 5,10 og 3,65 ppm, blev den gennemsnitlige molekylvægt af syntetiserede copolymerer beregnet til at være 37062, som vist i figur 2. vægtprocenten af ​​mPEG var 13,5%.

toppe ved 1,65 og 5,10 ppm tilhørte protonerne fra methin (CH) og methyl (CH

3) grupper af PLGA segmenter toppene af methene protoner (CH

2) i PEG-segmenter placeret på 3,65 ppm, og toppene af methene protoner (-COCH

2O-) placeret på 4,78 ppm repræsenterede konjugerede segmenter af PLGA og mPEG.

toppen repræsenterede den gennemsnitlige molekylvægt af syntetiserede copolymerer blev beregnet til at være 37062.

for det andet, en modificeret opløsningsmiddel fordampning metode baseret på vand-organiske fase-vand (W /O /W) flere emulsioner herunder en relativt simpel fremstillingsproces var anvendt til at forbedre indkapslingseffektiviteten af ​​cisplatin i nanopartikler. De observerede karakteristika for nanopartikler kan variere i høj grad afhængig af CMC koncentration, TPGS koncentration og de variable processer, herunder kontakten af ​​opløsningsmiddel tilføjelse orden. For at opnå den optimale CMC koncentration for høj indkapslingseffektivitet blev forskellige tilsatte mængder af CMC i det indre vandige fase af dobbelt emulsionssystem udforsket. Den effektive indkapsling af cisplatin i nanopartikler var højere end ingen mængde af CMC, som afslørede belastningsgraden og indkapslingseffektivitet af cisplatin var 3,88 og 70,9% (vægt /vægt), henholdsvis som vist i tabel 1. Fuldstændig 1,7 mg CMC kombineret med 4 mg cisplatin blev valgt som den optimale indre vandige fase og den optimale koncentration for TPGS blev sigtet for at være 0,035% (vægt /volumen).

som vist i tabel 2 var den gennemsnitlige størrelse af tilberedte nanopartikler læsset med cisplatin lå fra 180 til 210 nm, og belastningsgraden af ​​cisplatin var 3,5-4,2% (vægt /vægt). PI blev bestemt til at være ca. 0,3, som udviste en homogen fordeling i diameter. CMC og PLGA-mPEG polymerer tillægges en negativ ζ-potentiale med en gennemsnitlig værdi på -10,1 og -9,5 mV i tomme nanopartikler og cisplatin nanopartikler, hhv. Ingen signifikant forskel blev observeret i størrelse og ζ-potentiale af nanopartiklerne med eller uden cisplatin. Figur 3 viste de repræsentative billeder af den eksterne struktur af nanopartikler undersøgt af TEM. De fleste nanopartikler var sfæriske form med mindre diametre end diametrene bestemt ved dynamisk lysspredning. Morfologien af ​​nanopartikler med eller uden cisplatin afslørede skelnes eller lignende strukturer

(A) tomme nanopartikler.; (B) cisplatin nanopartikler. Prøver blev farvet med 1% phosphorwolframsyre (50000 ×).

Endelig blev frigivelsesprofilen af ​​cisplatin fra nanopartikler kumulative målt ved højtydende væskekromatografi (HPLC), som vist i figur 4. Denne assaymetode var følsomme nok til at måle cisplatin i et bredt koncentrationsområde med en detektionsgrænse på 0,31 ng /mL. En kalibreringskurve blev etableret i hvert forsøg. Kinetikken af ​​cisplatin fra nanopartikler frigivelse afslørede en konstant frigivelseshastighed styres som funktion af tid. Dog kunne den stabile udgave blive påvirket af CMC-cisplatin konjugation og biologisk nedbrydelige PLGA-mPEG copolymerer. Ligeledes som vist i figur 4, at indfangning af cisplatin i nanopartikler i væsentlig grad kan forsinke frigivelseshastigheden af ​​cisplatin og dermed føre til en forholdsvis stabil frigivelse over tiden.

Cisplatin frigivet fra nanopartikler som en funktion af inkubationstid i 100 mmol /l natriumchlorid-opløsning ved 37 ° C.

Akut toksicitet CMC core nanopartikler

for at vurdere cytotoksiciteten af ​​nanopartikler uden pålæsning af lægemidler, cytotoksicitet nanopartikler i doser på 0,005, 0,02, 0,04 og 0,08 mg /ml blev testet ved anvendelse af mikroplader med 96 brønde podet med celler ved en densitet på 3000 celler /brønd. Cellevæksten kurver af kontrol- og nanopartikler-behandlede grupper var ens, hvilket antyder, at nanopartiklerne ved de testede koncentrationer ikke udviste indlysende toksicitet på celler, som vist i figur 5 (A). Derudover er den maksimale mængde af nanopartikler (0,08 mg /ml), og densiteten af ​​3000 celler /brønd var også de optimale betingelser for at evaluere virkningen af ​​cisplatin nanopartikler på cellevækst

in vitro

.

(A) Relativ cellelevedygtighed IGROV1-CP celler udsat for datoer nanopartikler i 72 timer med forskellige doser. (B) Cell vækstinhibering efter udsættelse for frit cisplatin (grå histogram) og cisplatin nanopartikler (sort histogram) i 72 timer. De data, repræsenteret som gennemsnit ± SD.

anticancer aktivitet af frit cisplatin og cisplatin nanopartikler på IGROV1-CP celler

in vitro

blev bestemt. Som vist i figur 5 (B), blev ingen signifikant forskel i cytotoksicitet mellem cisplatin nanopartikler og frit cisplatin ved de testede koncentrationer observeret (

s Restaurant 0,05). Dødeligheden af ​​cisplatin nanopartikler ved dosen 100 mg /kg (på basis af cisplatin) var 40,0%, men dødeligheden i 10 mg /kg cisplatin behandlingsgruppen nåede op til 62,5%. Ingen forringelse sundhed blev observeret hos mus behandlet med tomme nanopartikler under observationsperioden, og den samlede opførsel af mus behandlet med cisplatin nanopartikler eller tomme nanopartikler udviste ikke en indlysende forskel. LD

50 var 8,6 mg /kg for frit cisplatin og 103,4 mg /kg for cisplatin nanopartikler, som vist i tabel 3. Derfor sammenlignet med frit cisplatin, nanopartiklerne fyldt med cisplatin kan give mere sikkerhed i klinisk anvendelse .

sikkerhedsprofil for CMC centrale nanopartikler i IGROV1-CP xenotransplanterede nøgne mus

for at observere den forsinkede organtoksicitet på musene inden for en bestemt behandling periode, store organer, herunder hjerte , lever, lunge, nyre og milt fra BALB /c nøgne mus administreret med frit cisplatin og cisplatin nanopartikler blev snittet og farvet med HE. Ingen indlysende histopatologisk ændring blev observeret i hjerte, lunge og milt fra cisplatin nanopartikler behandlede mus, som vist i figur 6. Imidlertid blev observeret, hepatisk nekrose og patologisk atrofi af nyrerne hos mus behandlet med frit cisplatin. Tilsvarende administration af cisplatin nanopartikler op til 3 mg /kg i 5 konsekutive doser forårsagede ikke en signifikant patologisk forskel i lever og nyrer.

Nude athymiske mus med IGROV1-CP-xenografter blev behandlet med saltvand ( kontrol), tomme nanopartikler (blanke NPS), cisplatin og cisplatin nanopartikler (NP-cp) ved fem doser hver 4 dage. De organer, herunder hjerte, lunge, milt, lever og nyre fra mus behandlet med saltvand blev vist i den første række. De organer fra musene behandlet med tomme nanopartikler blev vist i den anden række. De organer fra musene behandlet med frit cisplatin blev vist i den tredje række. De organer fra musene behandlet med cisplatin nanopartikler blev vist i fjerde række.

For at vurdere virkningen af ​​cisplatin nanopartikler på apoptose, blev tumor- vævssnit farvet med TUNEL til evaluering DNA-fragmentering. Optælling af apoptotiske kerner (ca. 200 celler blev talt) blev foretaget på dias hentet tilfældigt af to uafhængige eksperimentatorer. En klynge af apoptotiske legemer blev givet som en enkelt tæller, og apoptotiske tællinger i forskellige behandlingsgrupper er vist i figur 7 (A). Xenografter behandlet med cisplatin nanopartikler afslørede højere apoptotiske niveauer end kontrollerne (saltvand og tomme nanopartikler,

s

0,05). Skønt de samlede tællinger af apoptotiske celler i tumorer behandlet med cisplatin nanopartikler var lidt højere end i tumorer behandlet med konventionel cisplatin, iagttoges ingen signifikant forskel i det samlede tællinger af apoptotiske celler i begge behandlingsgrupper, som vist i figur 7 (B) (

s

0,05)

(A) Mikroskopisk evaluering af tumor apoptose ved TUNEL farvning.. Atymiske mus med IGROV1-CP xenografter blev behandlet med saltvand (kontrol), tomme nanopartikler (blanke NPS), cisplatin og cisplatin nanopartikler (NP-cp) på fem doser. (B) De gennemsnitlige apoptotiske celletal blev beregnet på grundlag af TUNEL farvning. Atymiske mus med IGROV1-CP xenografter blev behandlet som beskrevet i (A).

Behandling effekt

in vivo

undersøgelser

Behandlingen effekt af cisplatin nanopartikler for IGROV1-CP celle xenograft i BALB /c nøgne mus blev evalueret. Efter den gennemsnitlige mængde af tumorerne var op til 100-130 mm

3 blev de tumor-bærende mus inddelt i fire grupper (n = 8) med minimal forskel i vægt og størrelse af tumorer blandt grupper. Desuden blev musene behandlet med de følgende regimer herunder saltvand, nanopartikler uden cisplatin, frit cisplatin, og cisplatin nanopartikler hver fjerde dag. Dosen af ​​cisplatin-baserede behandlinger var 3 mg /kg legemsvægt.

Tumorstørrelse, kropsvægt og overlevelsesraten for musene blev derefter overvåget i 21 dage efter begyndelsen af ​​behandlingen. Det gennemsnitlige tumorvolumen ved afslutningen af ​​behandlingsperioden var 209 ± 25 mm

3 i saltvandsbehandlede gruppe, og 213 ± 19 mm

3 i blank nanopartikel-behandlede gruppe, som vist i figur 8 (A) . Men i cisplatin-behandlede gruppe, den endelige gennemsnitlige tumorvolumen var 166 ± 16 mm,

3, som var betydeligt mindre end den saltvandsbehandlede grupper ved ANOVA-analyse ved 95% konfidensinterval. Sammenlignet med cisplatin-behandlede gruppe, en lille reduktion af tumorvolumen i cisplatin nanopartikler behandlede gruppe med gennemsnitlig tumorstørrelse på 146 ± 19 mm

3 ved slutningen af ​​behandlingsperioden. En mulig årsag var, at den efterfølgende intracellulære levering af cisplatin kan hindres af mPEG modifikation af nanopartikler, som ikke udviser et væsentligt bidrag på reduktion tumor. Ved udgangen af ​​behandlingsperioden (dag 21), af overlevelsesprocenten for musene i cisplatin nanopartikler-behandlede gruppe, cisplatin-behandlede gruppe, blank nanopartikel-behandlede gruppe og saltvandsbehandlede gruppe var 87,5, 62,5, 75 og 75 %, henholdsvis som vist i figur 8 (B). Forskellen i overlevelsesrater fra fire grupper foreslået, at cisplatin nanopartikler var meget sikrere end frit cisplatin. Legemsvægten af ​​mus udviste en gradvis nedsættelse startende fra den anden dosis, selv om der blev observeret nogen signifikant forskel i fire grupper, som vist i figur 8 (C).

(A) Effekt af frit cisplatin (3 mg /kg) og cisplatin nanopartikler (NP-cp, 3 mg /kg på grundlag af cisplatin) på tumorvækst i athymiske mus med med IGROV1-CP celle xenografter. Musene blev administreret med forberedte formuleringer ved 4 dages mellemrum i den samlede periode på 21 dages behandling. Saltvandsopløsning blev anvendt som kontrolgruppe, og effekten af ​​tomme nanopartikler (blanke NPS) blev også bekræftet. Dataene blev præsenteret som gennemsnit ± SD (n = 8 ved begyndelsen af ​​forsøget). (B) overlevelsesraten for tumorbærende athymiske mus behandlet med cisplatin (3 mg /kg) NPS-cp (3 mg /kg på basis af cisplatin), datoer NP’er og saltvand (kontrol). (C) Ændringer i kropsvægt som behandlingstiden af ​​IGROV1-CP tumorbærende mus. Barer angivne standardafvigelser.

Diskussion

Fysisk-kemiske egenskaber for cisplatin, såsom dårlig opløselighed i vand (1 mg /ml), høj affinitet til plasmaproteiner og nedbrydelighed, kan begrænse den terapeutiske effektivitet af cisplatin. Cisplatin-baserede forhindringer på sin kliniske anvendelse kan løses ved hjælp af biotilgængelige polymere nanopartikler. Øjeblikket, nogle typer af nanopartikler fremstillet ud fra poly (lactid) -monomethoxy-poly (ethylenglycol) (PLA-mPEG) og PLGA-mPEG-copolymerer har fået stigende opmærksomhed. Begrundelsen for denne undersøgelse er at øge lastning og indkapslingseffektivitet af cisplatin ved nanopartikler og dermed forbedre stabiliteten af ​​cisplatin. TPGS kan også give et sikkert alternativ af polyvinylalkohol (PVA) eller andre tilsætningsstoffer til forbedring udarbejdelse af ensartede nanopartikler fra parti til parti.

Brug modificeret W /O /W dobbelt emulsion metode udviklet af Gryparis EF et al . [20], har vi udviklet et nyt koncept af “kerne-CMC-cisplatin-tværbinding”, som i høj grad kan øge belastningseffektivitet af cisplatin. Under tværbindingen af ​​CMC, kan chloridioner i cisplatin udveksle hydrogenioner med CMC i vand til dannelse af et kompleks. På grund af den tilbageholdelse af komplekset i den primære emulsion fase, kan cisplatin indlæses i nanopartiklerne fremstillet af hydrofobe PLGA med hydrofil methoxypolyethylenglycol kæder. Den belastningseffektivitet af cisplatin er forbedret til 3,9 ± 0,3% (vægt /vægt), og indkapslingseffektiviteten er op til 70,9 ± 2,6%. Endvidere er der ingen rapporter i forbindelse med anvendelsen af ​​CMC polymerer som en strategi til forbedring af belastningseffektivitet af cisplatin. Derfor bør cisplatin nanopartikler være de effektive drug delivery bærere for cisplatin

in vivo

undersøgelse.

Den høje indkapslingseffektivitet af cisplatin er også til dels på grund af anvendelsen af ​​TPGS emulgator i koordinations- induceret nanopartikel formation. TPGS er forskellig fra tidligere rapporteret PVA, natriumcholat eller andre emulgatorer [17], [20]. TPGS, et vandopløseligt derivat af naturligt E-vitamin, er almindeligt anvendt i farmaceutiske og nutraceutiske formuleringer. I denne undersøgelse har vi med succes skabt homogene nanopartikler ved hjælp af TPGS. Ingen snavs og sammenlægning i de homogene nanopartikler blev observeret af TEM. Monodisperse emulsionssmådråber favoriserer sammensmeltning uden TPGS, og nanopartiklerne er vanskeligt at danne. Her TPGS anvendes med et håb om at forskyde ovennævnte emulgatorer og undgå deres fjernelse problemer.

Under evalueringen af ​​cellelevedygtigheden og behandlingseffekt af tilberedte cisplatin nanopartikler, levedygtighed IGROV1-CP-celler inkuberet med frit cisplatin i det koncentrationsområde af 8-24 uM i tre dage udviste et fald fra 79,6% til 14,8%, mens levedygtigheden af ​​celler behandlet med cisplatin-indkapslede nanopartikler viste en reduktion fra 76,9% til 10,8%. Endvidere er de cisplatin nanopartikler inhiberede effektivt tumorvækst i nøgne mus sammenlignet med frit cisplatin ved samme dosis, hvilket tyder på, at nanopartiklerne ikke afbrød anticancer effektivitet af cisplatin

in vivo

. TUNEL analyse bekræftede også forbedret effektiviteten af ​​cisplatin nanopartikler på tumor hæmning. I mellemtiden, histopatologisk undersøgelse afslørede levernekrose og atrofi i nyre i gruppen behandlet med frit cisplatin, men disse former for histopatologiske ændringer blev ikke observeret i de grupper, der blev behandlet med cisplatin nanopartikler. Desuden har andre vigtige organer såsom hjerte, milt og lunger ikke afsløre abnormiteter enten. Således bør de kerne-CMC-cisplatin-tværbundne nanopartikler være meget sikrere og højere effektivitet end frit cisplatin under kræftbehandling.

For yderligere at forstå de bivirkninger af cisplatin nanopartikler, potentiel akut toksicitet af cisplatin -loaded nanopartikler blev også evalueret. ICR-mus blev injiceret intravenøst ​​med 0,8 ml cisplatin nanopartikler ved de cisplatin koncentrationer på 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 og 3,0 mg /mL, og overlevelsesraten for musene blev undersøgt. Som forventet LD

50 af cisplatin nanopartikler afslørede 12 gange højere end den af ​​frit cisplatin. Sammenlignede overlevelsen sats, viste BALB /c-mus mere tolerance over for cisplatin nanopartikler end frit cisplatin, som indikerede, at cisplatin nanopartikler havde mere sikkerhed end frit cisplatin på betingelse af relativt høje administration dosis.

generelt har cisplatin nanopartikler blevet designet og fremstillet. Sfæriske partikler og snæver størrelsesfordeling er blevet karakteriseret. Vedvarende frigivelse af cisplatin over fem dage fra PLGA-mPEG nanopartikler

in vitro

blev observeret. Derfor kan vi konkludere, at nanopartikler har et væsentligt bidrag til kontrolleret frigivelse af cisplatin og ikke skader behandlingen effektivitet af cisplatin. Vores resultater giver yderligere evaluering af cisplatin nanopartikler som en hidtil ukendt cancerterapi. Men for at maksimere antitumorvirkningen af ​​cisplatin nanopartikler, er det nødvendigt yderligere at optimere administrationen dosis og injektion regime.

Aktuelle strategier, især til fremstilling af sådanne nanopartikler, involveret multi-trins fremstilling. Som et resultat heraf er proceduren en iboende ineffektivt system, som ikke må være let skalerbar og kan resultere i batch-til-batch variation. I vores laboratorium har vi udviklet en ny metode til fremstilling af nanopartikler med batch-til-batch ensartethed. Det er en enkel, skalerbar, effektiv og kontrollerbar system ved hjælp af vores veltilrettelagt formulering strategi. Vores proof-of-concept

in vitro

in vivo

Evalueringen viser, at PLGA-mPEG nanopartikel formulering er en potentiel cisplatin levering system til ovariecancer behandling.

Materialer og Metoder

Materialer

Cisplatin blev købt fra Shandong Boyuan Chemical Co. Ltd (Jinan, Kina). CMC blev købt fra Aladdin Reagent Co Ltd (Shanghai, Kina). mPEG (M

W 5 kDa) og TPGS blev opnået fra Jiangsu Xixin Vitamin Co. Ltd. omvendt-fase-søjle (ZORBAX-NH

2, 250 x 4,6 mm, 5 um) blev indkøbt fra Agilent Technologies Co . Ltd (USA). Alle reagens vand, der anvendes i laboratoriet blev forbehandlet med Milli-Q Plus system (Millipore Corporation, USA). Alle mPEG prøver blev dehydreret ved azeotrop destillation med toluen, og derefter vakuumtørret ved 50 ° C i 12 timer før brug. IGROV1-CP celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Stephen Collins på UCSD (CA, USA).

Dyr

Alle eksperimenter dyr blev udført med godkendelse af Institutional Animal etiske komité (IACE) af Research center i Laboratory Animal Science of Zhejiang Chinese Medical University (Hangzhou, Kina). Tallene tilladelsen er Syxk (zhe) 2008-0115. ICR-mus og BALB /c-mus (4-6 uger gamle og vejer 18-22 g) blev holdt ved dyret centrum. Cisplatin nanopartikler blev administreret med intravenøs injektion. Ved slutningen af ​​behandlingsperioder, blev lever, nyre, hjerte, milt og lungevæv indsamlet som pr godkendelse af IAEC.

Syntese og karakterisering af PLGA-mPEG copolymer

PLGA-mPEG copolymerer blev fremstillet ved en smeltepolymerisationsproces under vakuum ved anvendelse stanno-2-ethylhexanoat som katalysator [23]. PLGA (30) -mPEG (5) blev syntetiseret med sammensætning LA:GA:EO = 03:01:01, molekylvægt (den vægtgennemsnitlige molekylvægt) = 3,7 × 10

4, PI = 1,8 (LA, GA og EO står for mælkesyre, glycolsyre og ethylenoxid komponenter henholdsvis). Copolymeren blev karakteriseret med

1H-NMR og GPC.

Fremstilling og karakterisering af cisplatin nanopartikler

PLGA-mPEG nanopartikler fyldt med cisplatin blev fremstillet med W /O /W-emulsion solvent fordampning metode udviklet af Gryparis EF [20], med specifikke ændringer. Kort fortalt, 5,71 mg /ml cisplatin opløst i 30 mM CMC vandig opløsning blev emulgeret i en organisk fase ved hjælp af sonikering (bioruptor, model UCD-200 TM-EX) ved 100 W i 45 sekunder. Den organiske fase blev hovedsagelig sammensat af chloroform og acetone indeholdende 50 mg PLGA-mPEG. Vand-i-organiske fase emulsion blev tilsat til en vandig opløsning af TPGS (0,035%, w /v).

Den resulterende W /O /W emulsion blev derefter microfludized med et tryk på mindst 12000 PSI, og omrøres ved en magnetisk omrører i 3 timer ved stuetemperatur indtil fuldstændig afdampning af chloroform og acetone. Til slut blev nanopartikel suspension lyofiliseres og opbevares ved 4 ° C indtil senere anvendelse. For at øge indfangning af cisplatin i nanopartikler, CMC i det indre vandige fase af W /O /W blev konjugeret til cisplatin i 1 ml vand i 3 timer under kontinuerlig forsigtig omrøring. Datoer nanopartikler blev også fremstillet med den samme fremgangsmåde uden cisplatin.

partikelstørrelse og zetapotentialet blev målt ved hjælp af Malvern Zetasizer instrument (13 kører per prøve, NETASIZER NANO S90). Den morfologisk undersøgelse af nanopartikler blev observeret under TEM (JEM-1230, JEOL, Japan). En dråbe nanopartikel suspension blev anbragt på en kobber gitter dækket med nitrocellulosemembran og tørres i fri luft før negativ farvning med phosphowolframsyre natrium-opløsning (1% vægt /volumen).

Bestemmelse af belastningseffektivitet og

In vitro

frigivelseshastigheden af ​​cisplatin

belastningseffektivitet af cisplatin i nanopartikler blev bestemt ved anvendelse af en direkte procedure [24]. Fuldstændig 5 mg lyofiliserede nanopartikler blev opløst i 1 ml NaOH (0,1 N) og omrørt natten over på en magnetomrører ved stuetemperatur. Suspensionen blev centrifugeret ved 18.000 g i 10 minutter, og 90 pi supernatant blev anvendt til at kvantificere cisplatin indhold ved HPLC. Indkapslingseffektiviteten blev beregnet som mængden af ​​cisplatin udvundet fra nanopartikler i forhold til den oprindelige mængde af cisplatin anvendes for hvert præparat. Desuden for at kvantificere frigivelseskinetikken for cisplatin fra nanopartikler, cisplatin nanopartikler (5 mg) blev suspenderet i 10 ml phosphatbufret saltvand (PBS). Suspensionen blev anbragt i et mikrocentrifugerør og anbringes derefter i en orbital vandbad rystning ved 120 rpm ved 37 ° C. Rørene blev centrifugeret ved udpegede tidsintervaller. Efter centrifugering blev supernatanterne opsamlet til bestemmelse af cisplatin. Efter prøveudtagning vores supernatanter blev inkubationsmediet erstattet med frisk PBS, og rørene blev anbragt tilbage i inkubatoren. Indholdet af disse opløsninger cisplatin blev bestemt ved måling af absorbansen ved 310 nm med en ikke-gradient mobil fase bestående af 0,9% NaCl og methanol (v /v, 25/75) ved en konstant strømningshastighed på 1,0 ml /min.

In vitro

cytotoksicitet undersøgelse

MTT-assayet blev anvendt til at evaluere toksiciteten af ​​tomme nanopartikler, cisplatin nanopartikler og frit cisplatin mod IGROV1-CP ovariecancer celler [25 ]. Cellerne blev podet i plast plader med 96 brønde ved 3 × 10

3 celler pr. Fireogtyve timer efter udpladning cisplatin, datoer nanopartikler og cisplatin nanopartikler (både suspenderet i dyrkningsmedium) i forskellige koncentrationer blev tilsat til brøndene. I alt 50 pi MTT-opløsning (5 mg /ml i PBS, pH 7,4) tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 ° C i 3 timer. Opløsningen blev trukket tilbage, og derefter 200 pi blev tilsat syrnet isopropanol (0,33 ml HCI i 100 ml isopropanol) og omrøres grundigt for at opløse formazan-krystallerne. Opløsningen blev straks aflæst på en mikropladelæser (TECAN INFINIT M200, USA) ved en bølgelængde på 490 nm. blev udført forsøgene uafhængigt tre gange. Cytotoksicitet blev udtrykt som inhibering i procent af cellelevedygtighed.

In vivo

evaluering af akut toksicitet

ICR mus blev anvendt til at vurdere relative toksicitet efter intravenøs administration af cisplatin nanopartikler .