PLoS ONE: forordning og Novel aktion af thymidinfosforylase i ikke-småcellet lungekræft: Crosstalk med Nrf2 og HO-1

Abstrakt

proangiogen enzym thymidinfosforylase (TP) er et lovende mål for anticancer-terapi, endnu sin indsats i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er ikke fuldt forstået. At belyse dets rolle i NSCLC tumorvækst blev NCI-H292 lung mucoepidermoid carcinomaceller og endotelceller manipuleret til at overudtrykke TP ved viral vektor transduktion. NSCLC celler med ændret udtryk for transskription faktor Nrf2 eller sit mål gen hæm oxygenase-1 (HO-1) blev anvendt til at undersøge reguleringen af ​​TP og resultaterne fra prækliniske modeller var relateret til genekspression data fra kliniske NSCLC prøver. Overekspression af Nrf2 eller HO-1 resulterede i opregulering af TP i NCI-H292 celler, en virkning efterlignes af behandling med en antioxidant N-acetylcystein og delvist er tilbageført i HO-1 knockdown. Overekspression af TP svækket celledeling og migrering

in vitro

, men samtidig forbedret angiogene potentiale af kræftceller suppleret med thymidin. Sidstnævnte blev også observeret for SK-MES-1 pladecellecarcinom og NCI-H460 storcellet carcinom celler. TP-overekspression NCI-H292-tumorer

in vivo

udviste bedre iltning og højere ekspression af IL-8, IL-1β og IL-6. TP overekspression i endotelceller augmented deres angiogene egenskaber, som var associeret med forøget dannelse af HO-1 og VEGF. Korrelation af TP med ekspressionen af ​​HO-1 og inflammatoriske cytokiner blev bekræftet i kliniske prøver af NSCLC. . Helt, den forøgede ekspression af IL-1β og IL-6 sammen med proangiogene virkninger af TP-udtrykkende NSCLC på endotel kan bidrage til tumorvækst, hvilket indebærer TP som et mål for angiogenese i NSCLC

Henvisning: Tertil M , Skrzypek K, Florczyk U, Weglarczyk K, Var H, Collet G, et al. (2014) Forordning og Novel aktion af thymidinfosforylase i ikke-småcellet lungekræft: Crosstalk med Nrf2 og HO-1. PLoS ONE 9 (5): e97070. doi: 10,1371 /journal.pone.0097070

Redaktør: Soumitro Pal, Børnehospital Boston Harvard Medical School, USA

Modtaget: 28 oktober, 2013; Accepteret: 14. april, 2014 Udgivet: 12. maj 2014

Copyright: © 2014 Tertil et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Støttet af tilskuddene nr 311 /N-COST /2008/0, 347 /N-INCA /2008/0 og N N301 314.837 fra National Science Centre (NCN). Alicja Jozkowicz var en International Senior Research Fellow fra Wellcome Trust. M. Tertil og K. Skrzypek blev støttet af Conseil Regional du Centre, stipendium til co-tutorial ph.d.-afhandling. Fakultetet for Biokemi, Biofysik og bioteknologi af Jagiellonian Universitet er en modtager af strukturfondene fra EU og den polske ministerium for videnskab og videregående uddannelse (giver No: POIG.02.01.00-12-064 /08, 02.02. 00-00-014 /08, 01.01.02-00-109 /09 og 01.01.02-00-069 /09). Forskning udført i omfanget af MIR-Tango International Associated Laboratory (LIA). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungetumorer rang som den øverste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den mest udbredte. NSCLC-patienter er ofte diagnosticeret med fremskreden sygdom, når systemisk kemoterapi er den vigtigste behandlingsmulighed. Da tumorvækst og metastase er afhængige af angiogenese, har mekanismer, der styrer dannelse af nye blodkar været målrettet til intervention i lungekræft [1]. Men tilsætning af anti-VEGF agenter til konventionel kemoterapi resulterede kun i lille forbedring af median overlevelse [1], [2] med patienter, der oplever tumor tilbagefald på grund af fremkomsten af ​​resistens til antiangiogene midler, hvilket understreger et presserende behov for nye mål for kombinatorisk behandlinger.

Thymidinphosphorylase (TP, EC2.4.2.4) er en pyrimidin bjærgning syntese pathway enzym, som også er kendt for sine proangiogene egenskaber. TP katalyserer reversibel phosphorolyse af thymidin i thymin og 2-deoxy-D-ribose-1-phosphat (DRP), som yderligere dephosphoryleret til 2-deoxy-D-ribose (dR). Enzymet og dens sukkerprodukter stimulerer endothelcellemigration og rør dannelse

in vitro

og forbedre angiogenese i forskellige modeller

in vivo

[3]. TP ofte overudtrykt i humane tumorer, herunder NSCLC [3], [4] og er blevet vist at korrelere med højere mikrokardensitet densitet, mere avanceret tumor stadium, metastase og dårlig prognose [3]. Proangiogen virkning af TP i tumorer, bortset fra den direkte aktion af sine produkter på endotelceller, kan også involvere stimulering af ekspression af andre angiogene faktorer såsom VEGF, interleukin-8 (IL-8) eller hem oxygenase-1 (HO- 1) [5], [6]. Følgelig er rettet mod TP med små molekyler inhibitorer øjeblikket undersøgt som en hidtil ukendt antiangiogenisk strategi [7]. Ikke desto mindre, for udviklingen af ​​effektive kombinatoriske kemoterapeutika, kan fastholde enzymatiske aktivitet af TP være nødvendigt, da det katalyserer et vigtigt skridt i aktiveringen af ​​fluoropyrimidinbaseret baserede stoffer såsom capecitabin, som er blevet foreslået som alternativ behandling for fremskreden NSCLC [8]. Denne dobbelte funktion TP i tumorvækst og terapi indebærer, at inhibering protumoral virkninger af enzymet kan kræve målretning dens downstream mediatorer. Belyse de mekanismer for regulering og tumorfremmende handlinger TP er derfor af afgørende betydning.

Nrf2 (nuklear faktor (erythroid-afledt 2) -lignende 2) er en transskription faktor regulerer cellulære antioxidant reaktioner [9]. Det er ofte konstitutivt aktiv i tumorer, herunder lungekræft, og kan yderligere induceret af behandlinger mod kræft. Det drev udtryk for cytobeskyttende gener, der fører til udvikling af resistens over for cytotoksiske midler [10]. En af Nrf2 mål er HO-1, som konverterer hæm til CO, ferrojern og biliverdin, og som er blevet påvist at mediere Nrf2-drevet modstand NSCLC celler til kemoterapi [11], [12]. Interessant, begge proteiner spiller roller ved fremme af angiogenese: virkningen af ​​HO-1 opstrøms og nedstrøms angiogen VEGF og SDF1α er veletableret [13], og er blevet påvist at inddrage Nrf2 i reguleringen af ​​angiogen IL-8 [14] – [16].

Her undersøger vi den biologiske rolle af TP fokus på angiogenese og samspillet med Nrf2 og HO-1 i ikke-småcellet lungekræft og endotelceller. Vores resultater viser effekterne af TP overekspression i NSCLC celler

in vitro

in vivo

og fremhæve betydningen af ​​proangiogen virkningen af ​​enzymet.

Materialer og metoder

plasmider og virale vektorer

Plasmid pBK-RSV-TP huser human TP-cDNA blev venligst stillet til rådighed af Dr. S. Liekens (Rega Institute for Medical Research, KU Leuven, Belgien). PEF (blå) -Nrf2 indeholdende human Nrf2 cDNA blev venligt Givet af Dr. J.A. Johnson (Division of Pharmaceutical Sciences, University of Wisconsin-Madison, USA) [17]. Konstruktion af retrovirusvektorer (autocampere) RV-TP og RV-Nrf2 blev udført som beskrevet i supplerende metoder (File S1). Retroviral plasmid pMSCV-Luc indeholdende luciferase ekspressionskassette for produktion af RV-Luc blev opnået fra Addgene. Alle autocampere, herunder en kontrol RV-tom vektor (LNCX2) blev fremstillet som beskrevet i [18].

Adenovirusvektorer (ADVS) huser TP cDNA (ADTP) blev udviklet som beskrevet i supplerende metoder (File S1) og kontrol vektorer med GFP (AdGFP) som rapporteret tidligere [16]

cellelinjer og dyrkningsbetingelser

Menneskelig NSCLC cellelinier:. NCI-H292 (mucoepidermoid karcinom, købt fra ATCC), A549 ( adenocarcinom, fås fra Prof. Jakub Golab, Warszawa Medical University, Warszawa, Polen) og NCI-H460 (storcellet carcinom, købt fra ATCC) blev dyrket i RPMI 1640 (PAA) og SK-MES-1 (planocellulært karcinom, købt fra ATCC) blev dyrket i MEM (Gibco), hver suppleret med 10% føtalt bovint serum (PAA) og penicillin (100 U /ml) /streptomycin (10 ug /ml) (Sigma) (pen /strep). Humane mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1, opnået fra Dr. Francis Candal, Center for Disease Control og Forebyggelse, Atlanta, USA) blev dyrket i MCDB 131 suppleret med 10% FBS, L-glutamin 2 mM, pen /strep, EGF 10 ng /ml og hydrocortison 1 mg /ml. Primære humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC) blev isoleret som tidligere beskrevet [19] og dyrket i M199 (PAA) suppleret med 20% FBS, pen /strep og endotelcellevækst supplement ECGS 30 mg /L (Millipore).

Alle celler blev holdt i standard dyrkningsbetingelser: 37 ° C, 5% CO

2, 95% fugtighed. Til undersøgelse af virkningerne af hypoxi celler blev placeret i 24 eller 48 timer i et kammer (Biospherix USA) under kontrollerede gas atmosfære 1% O

2, 5% CO

2 og 94% N

2 placeret ved 37 ° C i en cellekultur inkubator.

til etablering af cellelinier NCI-H292-Luc-TP (NCI-TP) og NCI-H292-Luc-Nrf2 (NCI-Nrf2) stabilt overekspression luciferase og de respektive transgener og kontrol NCI-H292-Luc-EV (NCI-EV) modificeret med tom vektor, blev cellerne transduceret med retrovirusvektorer. Først blev en infektion med RV-transgen eller RV-tom vektor (RV-EV) udføres, og stabilt transformerede celler blev selekteret ved geneticin (1 mg /ml), som blev efterfulgt af transduktion med RV-Luc og selektion ved hygromycin (0,3 mg /ml). NCI-H292-Luc-HO-1 (NCI-HO1) cellelinie blev udviklet og valideret tidligere i vores laboratorium [20]. Til vedligeholdelse af transgenekspression celler blev rutinemæssigt holdt i standard medium yderligere tilsat geneticin (0,5 mg /ml) og hygromycin (0,1 mg /ml). Til forsøg celler blev podet i medium uden antibiotika.

Transient TP overekspression og stimulering af celler med NAC eller TP substrat

thymidin (THD) og N-acetylcystein (NAC) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich . For forbigående TP overekspression i EC’er blev HMEC-1 og HUVEC-celler transduceret med adenovirale vektorer ADTP eller kontrol AdGFP ved MOI = 10 til 24 timer og derefter stimuleret med THD i yderligere 24 timer i komplet medium. For forbigående TP overekspression i NSCLC-celler, blev SK-MES-1 og NCI-H460 transduceres ved MOI = 20 og MOI = 40, henholdsvis, og stimuleret med 1 mM THD i medium suppleret med 2% FBS 48h post-transduktion.

Real-time RT-PCR

mRNA-niveauer af gener blev bestemt ved kvantitativ RT-PCR. RNA blev isoleret med enten Qiazol (Qiagen) eller ved hjælp RNeasy Plus Micro Kit (Qiagen) ifølge producentens instruktioner. 1 ug RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af oligo-dT-primere med RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). Real-time PCR blev udført ved hjælp af 30 ng prøve med QuantiTect SYBR Green (Qiagen, analyse af

in vitro

eksperimenter) eller SYBR Premix Ex Taq II (Takara, analyse af

in vivo

eksperimenter ) ifølge producentens instruktioner om LightCycler 480 II-system (Roche). Genekspression blev beregnet ifølge ACt eller ΔΔCt metoder med EF2 som reference gen, med fejlsøjler beregnet som standardafvigelser af de midler, divideret med √ (N-1), hvor N var antallet af uafhængige forsøg. Fejl formering blev ikke taget i betragtning, hvad der er en vis begrænsning i vores undersøgelse.

Western blot-analyse og ELISA

Western blot for HO-1 blev udført som i [19]. Til påvisning af human TP muse mAb P-GF.44C (Calbiochem) blev anvendt. Produktion af human VEGF og IL-8 i dyrkningsmedier og human IL-8, IL-1β og IL-6 i tumorlysater blev kvantificeret ved anvendelse DuoSet ELISA Kits (R 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

TP er forskelligt udtrykt i NSCLC celler med varierende niveauer af Nrf2 og hæm oxygenase-1

Vi undersøgt TP udtryk i NSCLC cellelinjer A549 og NCI-H292 oprindelse fra forskellige histologiske typer af tumorer – adenocarcinom og mucoepidermoid karcinom henholdsvis. Western blot-analyse afslørede, at A549-adenocarcinom viser høj basal ekspression af TP, mens enzymet er meget lavt i NCI-H292 (fig. 1A). Da de to cellelinier er kendt for at afvige i aktiviteten af ​​transkriptionsfaktoren Nrf2 og dens målgen HO-1, idet begge udtrykt på højere niveau i A549 end i NCI-H292 ([22], Fig. 1A, B), undersøgte vi hvorvidt Nrf2 /HO-1 akse kan inddrages i reguleringen af ​​TP. Faktisk, når Nrf2 og HO-1 blev uafhængigt stabilt overudtrykt i NCI-H292-celler (fig. S1A, [20]), som har lav basal Nrf2 og HO-1 blev induktion af TP observeret i både NCI-Nrf2 og NCI -HO1 celler (fig 1C . D, henholdsvis). Dette udtryk mønster blev også bekræftet

in vivo

i subkutant HO-1-overekspression xenotransplantattumorer afledt af NCI-HO1 celler i nøgne mus (fig. 1E).

A. Basal TP, Nrf2 og HO-1 protein niveauer i A549 og NCI-H292 NSCLC cellelinjer indikerer mulig sammenslutning af TP udtryk med Nrf2 /HO-1 akse. B. Basal Nrf2 transkriptionsaktivitet i NSCLC cellelinier målt ved reportergenassay anvendelse af plasmid indeholdende luciferasegenet under kontrol af antioxidant responselement (ARE) (n = 3, * p 0,05 NCI-H292

vs

A549 ). C-D. Øget TP-mRNA og proteinekspression i NCI-H292-cellelinier stabilt overudtrykker Nrf2 eller HO-1 (n = 4, * p 0,05 kontrol tom vektor (EV)

vs

transgen overekspression) E. TP mRNA (venstre ) og protein udtryk (højre, densitometrisk analyse af WB i nederste panel)

in vivo

i kontrol og HO-1-overekspression NCI-H292-xenografter (etableret som beskrevet i [20]) bekræfter den

i vitro

data (n = 5, * p 0,05 NCI-HO1

vs

NCI-EV)

Nrf2-bindingssteder i TP promotor er ikke blevet identificeret. (analyse ikke vist), hvilket tyder på, at forordningen indirekte. Siden HO-1 er et kendt mål for Nrf2 og var signifikant opreguleret i NCI-Nrf2 celler (Fig. S1B), vi næste formål at afgøre, om virkningen af ​​Nrf2 var HO-1-afhængig. NCI-Nrf2 celler blev transficeret med siRNA mod HO-1 (fig. S2), hvilket førte til en delvis nedregulering af TP udtryk i både Nrf2-overekspression celler og kontrol celler transduceret med tom vektor (NCI-EV) (fig. 2A) , hvilket indebærer, at HO-1 spiller en rolle i reguleringen af ​​TP i NSCLC, men dens engagement i effekten af ​​Nrf2 er mindre. Desuden behandling af NCI-EV-celler med en antioxidant N-acetylcystein resulterede i en dosisafhængig opregulering af TP (fig. 2B), efterligner reguleringen af ​​enzymet ved Nrf2 /HO-1 overekspression. Da stimulering af kontrolceller med HO-1 produkter ikke kunne gengive opregulering af TP findes i HO-1 overudtrykkende celler (Fig. S3), virkningen af ​​Nrf2 /HO-1 kunne tilskrives dæmpning af oxidativt stress, som vi har allerede vist, at NCI-HO1 celler har lavere niveau af reaktive oxygenspecies [20].

A. HO-1 og TP-mRNA og proteinekspression i NCI-H292-celler med HO-1 knockdown. NCI-Nrf2 og NCI-EV kontrolceller blev transficeret med 50 nM siRNA mod HO-1 (siHO1) eller kontrol krypteret sekvens (siSCR) i 72 timer fører til nedregulering af TP-ekspression følgende HO-1 nedregulering. (N = 4, * p 0,05 NCI-Nrf2

vs

NCI-EV, # p 0,05 siHO1

vs

siSCR). B. Virkning af antioxidant N-acetylcystein (NAC) på TP-ekspression. NCI-EV-celler blev stimuleret med angivne koncentrationer af NAC i 24 timer resulterer i en dosisafhængig opregulering af TP. (N = 3, * p 0,05 kontrol

vs

stimulation).

TP overekspression dæmper proliferation og migration af NCI-H292 celler, men øger angiogene potentiale NSCLC cellelinjer

in vitro

Næste, vi havde til formål at undersøge de direkte effekter af TP selv om proliferation og migration af NCI-H292 celler. En stabil cellelinje overudtrykker både luciferase og TP (NCI-TP) blev oprettet ved retroviral transduktion og valideret til TP-ekspression (fig. 3A). Uventet proliferation af NCI-TP-celler blev inhiberet (3B). Scratch assay viste, at vandrende potentiale af NCI-TP celler blev også svækket (Fig 3C, Fil S2 . S3). Nedregulering af mRNA-niveauer af matrixmetalloproteinaser (MMP’er) MMP-1 og MMP-2 blev også observeret (Fig. S4) som potentielt kunne indvirke negativt tumorigene potentiale NCI-H292 celler

in vivo

.

A. Validering af modellen – opregulering af TP-mRNA og protein niveauer i NCI-H292 cellelinien stabilt overudtrykker TP, etableret som beskrevet i Materialer og metoder (n = 3). B. Relative basale proliferationshastigheder af NCI-EV og TP-overudtrykkende celler målt ved inkorporering af bromdeoxyuridin (BrdU) (n = 4). C. Basal migration satser af NCI-EV og NCI-TP celler bestemt ved bunden assay (n = 4) (skala bar – 200 pm) * p 0,05 NCI-TP vs NCI-EV

da menes den store rolle for TP i tumorvækst at være forbundet snarere med sine proangiogene egenskaber [23], vi næste fokuseret på at belyse den rolle, TP i modulering af angiogenese i vores NCSLC model. Under standardbetingelser /TP produkter på angiogene potentiale af tumorceller kunne observeres nogen effekt af TP overekspression (fig. S5). Ikke desto mindre er den største udløser af angiogene switch

in vivo

er ilt afsavn. Derfor, for at bedre efterligne miljøet af en voksende tumor, placeret vi cellerne under hypoxi og forsynet dem med thymidin, der kan frigives fra den nekrotiske kerne tumor. Mens de inhiberende virkninger af TP overekspression på proliferation og migration i NSCLC-celler ikke blev påvirket af enten hypoxi og /eller thymidin (fig. S6), afslørede ændrede betingelser forøget angiogen potentiale NCI-TP-celler, som påvist ved Matrigel rørdannelse assay med konditioneret medier (fig. 4A). Det var forbundet med opreguleringen af ​​IL-8-protein-produktion ved tumorceller (fig. 4B) og induktion af HO-1 (fig. 4C), som kunne være tegn på forhøjet oxidativt stress i TP-overudtrykker celler, hvilket er i overensstemmelse med resultaterne fra andre tumortyper [5]. Vigtigere, TP-overudtrykkende celler udviste forøget angiogen potentiale i nærvær af thymidin også under normoxiske betingelser (fig. S7).

A. Øget angiogene potentiale TP overudtrykkende celler i hypoxi i nærvær af thymidin. NCI-H292-celler blev stimuleret med 1 mM THD i 48 timer under 1% oxygen og konditionerede medier blev anvendt på HMEC-1-celler podet på Matrigel. Antallet af branchpoints dannet af HMEC-1 behandlet med konditioneret medium fra enten tomme vektor transducerede NCI-H292-celler (NCI-EV) eller TP-transducerede (NCI-TP) er blevet beregnet (skala bar – 200 um) (n = 3). B. Produktion af angiogene faktorer i TP-overekspression NCI-H292 celler under hypoxi i nærvær af 1 mM THD i 24 timer kvantificeret ved ELISA påvisning opregulering af IL-8 i NCI-TP-cellelinie (n = 4). C. Øget HO-1-mRNA (venstre) og protein (højre) ekspression i TP-overudtrykkende celler i nærvær af 1 mM THD i hypoxi efter 24 timer (n = 3). * P 0,05 NCI-TP vs NCI-EV. D-I. Forbedret angiogene potentiale lunge pladecellecarcinom SK-MES-1 og storcellet carcinom celler NCI-H460 følgende transient TP overekspression. SK-MES-1 (D-F, n = 3) og NCI-H460 (G-I, n = 4) celler blev transduceret med ADTP eller kontrol AdGFP i 48 timer, stimuleres med 1 mM THD i yderligere 48 timer under 1 % oxygen (D-E I). Konditionerede medier blev anvendt i Matrigel assay på HUVEC-celler (D H) og HO-1-ekspression blev analyseret i cellelysater (F I). * P 0,05 ADTP vs AdGFP

Vi næste undersøgt, om TP modulerer angiogene potentiale af tumorceller oprindelse fra andre NSCLC histologiske typer, nemlig pladecellekræft SK-MES-1 cellelinje og NCI-H460 large cellecarcinom. Konditionerede medier opsamlet fra hypoxiske celler transient overudtrykkende TP følgende adenovirusvektor transduktion og stimulering med THD forårsagede forøget forgrening af endotelceller i sammenligning med kontrol AdGFP-transducerede celler for begge celletyper (fig. 4D, G), som blev ledsaget af øget produktion af IL-8 ved SK-MES-1-celler (fig. 4E). Induktion af HO-1 ved TP blev observeret under normoxiske betingelser (fig. 4F, I).

TP modulerer udtryk for inflammatoriske cytokiner

in vivo

For at bestemme, hvordan den komplekse virkninger af TP overekspression på proliferation, migration og angiogene potentiale NCI-H292 celler observeret

in vitro

ville påvirke tumor udvikling

in vivo

blev tumorceller implanteret subkutant i nøgne mus og tumorvækst blev overvåget i 5 uger. TP overekspression tendens til at accelerere væksten af ​​NSCLC xenografter (figur 5A.) (P 0,1 NCI-TP

vs

NCI-EV på 4 og 5 uger). Desuden viste NCI-TP tumorer en ubetydelig tendens (p = 0,2) mod forøget invasion af tumor-drænende lymfeknuder (fig. S8). Som celledeling og migrering er svækket af TP overekspression (fig. 3B-C), vi formodes forskellene i angiogene egenskaber. Faktisk måling af tumor iltning udføres ved afslutningen af ​​forsøget viste, at NCI-TP-tumorer var signifikant bedre iltet end tumorer afledt fra kontrolceller, som faldt sammen med forøget produktion af hIL-8 i de tidligere tumorer (fig. 5B, C) . Vigtigere er det, i vores tidligere forskning under brug af NCI-H292-xenografter vi har vist, at forbedret tumor iltning, støtter øget tumorvaskularisering i denne model [20]. Men selv om TP-overekspression blev bekræftet at blive tilbageholdt i xenotransplantater (fig. 5D, E), ingen forskelle i enten kunne påvises HO-1 eller andre angiogene faktorer sammenlignet med kontroltumorer (Fig. 5D, Fig. S9A -D). For bedre at forstå den mekanisme bag effekten af ​​TP overekspression på NSCLC

in vivo

, vi bestemt udtryk for inflammatoriske cytokiner i tumorer. Humant interleukin-1 og interleukin-6 niveauer blev forøget betydeligt i NCI-TP tumorer (Fig 5F . G). Også udtryk for TNF tendens til at være højere i TP-overekspression tumorer, men det nåede ikke statistisk signifikans (fig. S9e).

A. Måling af tumor volumen ved kaliberen. NCI-EV og NCI-TP-celler blev xenotransplanteret i nøgne mus som beskrevet i Materialer og Metoder. B. Måling af tumor iltning ved 5 ugers tumorvækst (n = 7 for NCI-EV, n = 9 for NCI-TP). C-G. mRNA (venstre) og protein (højre) ekspression af human IL-8 (C), HO-1 (D), TP (D, E) og inflammatoriske cytokiner (F-G) i xenotransplantattumorer indikerer opregulering af sekretionen af ​​IL- 8, IL-1β og IL-6 i NCI-TP-xenotransplantater (n = 5, * p 0,05 NCI-TP vs NCI-EV). H-J. mRNA ekspressionen af ​​TP (H) og inflammatoriske cytokiner (I-J) i biopsier fra humane primære og sekundære lunge adenokarcinomer.

Samspil af TP, HO-1 og inflammatoriske cytokiner i kliniske NSCLC prøver

Vi udførte indledende validering af vores resultater ved hjælp af klinisk materiale af primære tumorer og tumor-infiltrerede lymfeknuder indsamlet under kirurgi fra patienter, der lider af lunge adenocarcinom. Mens der var ingen forskelle i enten TP, IL-1β eller IL-6-ekspression mellem de primære og sekundære tumorprøver (Fig.5 HJ), er det bemærkelsesværdigt, at den basale ekspression af TP var høj i forhold til konstitutiv gen EF2 i tumorvæv (betyder TP /EF2 = 2,202), hvilket er sammenligneligt med TP /EF2 niveauer opnået i vores TP-overekspression xenografter (betyder TP /EF2 = 1,027, se fig. 5E). De relative gen /EF2 forhold er også ens for de interleukiner, hvilket viser, at vores xenograftmodel nøje parallel kliniske situation. Vi fandt en signifikant sammenhæng mellem HO-1 og TP udtryk (Spearman Rank Correlation, R = 0,556;

s

= 0,028). Hvad mere er, en signifikant sammenhæng med TP med IL-1β (R = 0,514,

s

= 0,001) og IL-6 (R = 0,519,

s

= 0,002) blev observeret således bekræfter vores data fra dyremodellen viser en potentiel hidtil ukendt virkning af TP opregulering i lungecarcinom.

TP overekspression øger angiogene potentiale af endotelceller

Interleukin-1β blev påvist at inducere ekspression af TP i primær makrovaskulær humane endotelceller HUVEC [24]. Vi gengivet denne effekt i en human mikrovaskulære endotel cellelinie HMEC-1 (fig. 6A), hvilket tyder forordningen var fælles for forskellige endotheliale celletyper. Denne observation rejst et spørgsmål om, hvorvidt TP-afhængige opregulering af inflammatoriske cytokiner i kræftceller muligvis kunne bidrage til modulering af tumor angiogenese ved graduering af TP i endotel. Derfor næste undersøgte vi virkningerne af TP overekspression i EC’er. Indførelse af TP i HUVEC forbedret evner endotelceller til dannelse tubulære-lignende strukturer i Matrigel og angiogen spiring i kollagengel (fig. 6B, C). Dette var ledsaget af induktion af proangiogen HO-1 (Fig. 6D, E), som blev yderligere forstærket i HUVEC-celler i nærvær af overskud af TP-substrat (fig. 6E). I HMEC-1 model, blev en samtidig stigning i VEGF produktion observeret efter TP overekspression (Fig 6F.), Mens der kunne observeres nogen effekt for HUVEC (figur 6G.), Som ikke må frigive VEGF [25] – [27]. Disse resultater indebærer, en hidtil ukendt proangiogen virkning af TP inden EC’er, eventuelt gennem induktion af andre angiogene proteiner. Mekanismen kan imidlertid være strengt endotel celletypespecifik.

A. Virkning af IL-1β på TP ekspression i HMEC-1-celler. Stimulering med 0,3 ng /ml humant rekombinant IL-1β i 24 timer førte til opregulering af TP i endotelceller (ECS). (N = 3, * p 0,05 kontrol

vs

IL-1β). B-C. EC’er blev transduceret med adenovirale vektorer ADTP eller kontrol AdGFP ved MOI = 10 i 48 timer, når Matrigel assay på HUVEC i nærvær af VEGF (50 ng /ml) (B) og klumpformet assay på HUVEC (VEGF 50 ng /mL) (C ) blev udført, hvilket indikerer forøget angiogen potentiale TP-overudtrykkende celler (n = 3, * p 0,05 ADTP

vs

AdGFP, # p 0,05 kontrol

vs

VEGF) (skala bar – 100 um) D-G. 24 timer efter transduktion med AdV endotelceller blev stimuleret med 1 mM THD for næste 24 timer. Analyse af HO-1-ekspression ved kvantitativ PCR og western blot i HMEC-1 (D) og i HUVEC (E) viser induktionen af ​​HO-1 i TP-overekspression EC’er, forbundet med forøget VEGF-ekspression i HMEC-1 (F), mens der er ingen effekt i HUVEC (G). (N = 4, * p 0,05 ADTP

vs

AdGFP, $ p 0,05 kontrol

vs

THD).

Diskussion

den iøjnefaldende fund af den foreliggende undersøgelse er påvisningen af, at TP kan opreguleres i NCI-H292 celler ved aktivering af Nrf2 /HO-1-vejen eventuelt gennem forbedring af oxidativ stress.