PLoS ONE: CMTM3 hæmmer human testikelkræft Cell Vækst gennem Induktion Cell-Cycle Anholdelse og Apoptosis

Abstrakt

Menneskelig CMTM3 er blevet foreslået som et formodet tumorsuppressorgen. Tabet af CMTM3 er blevet fundet i flere carcinomer. Men reguleringen af ​​CMTM3 udtryk og dens funktion i tumor progression stort set ukendt. Her undersøgte vi reguleringen af ​​CMTM3 udtryk, funktion og molekylære mekanisme i humane testikel kræftceller. CMTM3 blev ofte nedreguleret eller tavshed i testikelkræft cellelinjer og tumorvæv, men stærkt udtrykt i normale testis væv. Den fornyede udtryk for CMTM3 betydeligt undertrykt koloni dannelse, proliferation og migration kapacitet testikelkræft celler ved at inducere en G2 cellecyklusstop og apoptose. Desuden genekspressionen af ​​CMTM3 aktiveret transkriptionen af ​​p53, induceret p53 akkumulering, opreguleret ekspression af p21, og øget spaltning af caspase 9, 8, 3, og PARP. Nedreguleringen af ​​

CMTM3

i kliniske tumorvæv var forbundet med methylering af et enkelt CpG sted lokaliseret inden for Sp1 /Sp3-responsive region af kernen promotoren. Disse resultater indikerer, at CMTM3 kan fungere som tumor suppressor gennem induktionen af ​​en G2 cellecyklusstop og apoptose. CMTM3 er således involveret i testikelkræft patogenese, og det er ofte i det mindste delvist bragt til tavshed af methylering af en enkelt, specifik CpG websted i tumorvæv

Henvisning:. Li Z, Xie J, Wu J, Li W , Nie L, Sun X, et al. (2014) CMTM3 hæmmer human testikelkræft Cell Vækst gennem Inducerende Cell-Cycle Anholdelse og apoptose. PLoS ONE 9 (2): e88965. doi: 10,1371 /journal.pone.0088965

Redaktør: Thomas G. Hofmann, tysk Cancer Research Center, Tyskland

Modtaget: 15 oktober, 2013; Accepteret: 16 Jan 2014; Udgivet: 28 februar 2014

Copyright: © 2014 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Basic Research Program Kina (Grant nr 2014CD745200, https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx), National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.272.840, http: //www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm) og Unge Forskere Fund af National Natural Science Foundation of China (Grant nr 81.201.579, https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Testikel kønsceller tumorer (TGCTs) er almindelig hos mænd i alderen 15 til 35 år og tegner sig for 1% af alle maligne neoplasmer hos mænd [1]. Forekomsten af ​​TGCTs er steget dramatisk i løbet af det sidste århundrede [2].

TGCTs stammer fra transformerede gonocytes eller udifferentieret spermatogonier, som er afledt af føtale kimceller og voksne kim stamceller henholdsvis. TGCTs er klassificeret som seminomer eller ikke-seminomatous kimcelletumorer efter deres histologiske karakteristika [1]. Seminomer er de hyppigste (50-70%) testikelkræft kimcelletumorer. Ikke-seminomatous kimcelletumorer omfatter embryonal celle karcinom, blommesækken tumorer, choriocarcinom, og teratomer [1]. TGCTs er blevet en af ​​de mest helbredes solide neoplasmer, på grund af fremskridt inden for diagnostiske og terapeutiske metoder [3]. Imidlertid er de molekylære mekanismer, der opererer i TGCTs ikke fuldt klarlagt.

CKLF-lignende MARVEL transmembrane domæne indeholdende 3 (CMTM3) tilhører kemokin-lignende faktor-gen superfamilien, en hidtil ukendt familie, der ligner chemokinet og transmembrane 4 superfamilier af signalmolekyler.

CMTM3

er en af ​​flere kemokin-lignende faktor gener lokaliseret i en klynge på kromosom 16q22. CMTM3 proteinet indeholder en leucin-zipper og to LXXLL motiver. Dette 20 kDa protein er lokaliseret til cytoplasmaet og tjener som et skelet for proteiner i det endoplasmatiske reticulum og kernemembranen [4].

CMTM3

stærkt til udtryk i den mandlige reproduktive system, med det højeste udtryk niveau i testiklerne [4].

Tidligere undersøgelser også vist, at flere medlemmer af cmtm superfamilien kan spille vigtige roller i immun og mandlige reproduktive systemer og i tumorigenese [5] – [12]. Det har for nylig vist, at

CMTM3

dæmpes, eller nedreguleres i gastrisk, bryst-, nasopharyngeal, esophageal, tyktarm og nyrecarcinomer [8], [13]. Dets ekspression blev omvendt korreleret med dets promotor CpG status for methylering [8], [13]. Genekspressionen af ​​CMTM3 i tumorceller mangler dets ekspression fører til undertrykkelse af cellevækst og apoptose, hvilket tyder på, at CMTM3 er et hidtil ukendt tumorsuppressor [8]. Men dens rolle i udviklingen af ​​kræft og progression er ikke klart defineret til dato.

I denne undersøgelse har vi observeret, at

CMTM3

var ofte nedreguleret i testikelkræft væv via methylering på en specifik, enkelt CpG sted lokaliseret inden for Sp1 /Sp3-responsive region af promotoren. Den ektopiske udtryk for

CMTM3

hæmmede kolonidannelse, proliferation, migration og invasive kapacitet på testikelkræft celler. Disse funktioner CMTM3 blev opnået ved at modulere cellecyklusprogression og apoptose.

Materialer og metoder

Kræftceller og kliniske prøver

Et menneske seminom cellelinje (NCCIT), prostata cancer cellelinjer (LNCaP, DU145, PC3 og 22RV1), nyrekræft cellelinier (OSRC-2 og 786-O), blære tumorcellelinier (HTB9-5637 og T24) og en HEK-293 humane epitelial nyrecellelinje blev brugt . Celler blev dyrket i RPMI 1640-medier (Gibco /BRL) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C med en atmosfære af 5% CO

2.

Tyve par testikelkræft væv og de matchede ikke-kræft testikel væv blev opnået fra patienter, der gennemgår primær kirurgi på Shenzhen Second Folkets Hospital og Peking University Shenzhen Hospital med patienternes eller værger ‘skriftlige samtykke, og er blevet godkendt af den etiske komité i Shenzhen Second Folkets Hospital, Shenzhen, Kina. Prøver blev enten straks fikseret i 10% neutral formalin til histologi og immunhistokemi eller lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C til yderligere PCR. H

GAPDH

-F: 5′-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 ‘, og

GAPDH

-R: 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3′. Real-time PCR assays blev udført under anvendelse af Platinum SYBR Green qPCR Supermix UDG (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA). Assayet blev udført in triplo ved anvendelse af forskellige primersæt:

CMTM3

-F: 5′-GCTTCTTTGCTACCATCGTGTTTG-3 ‘, og

CMTM3

-R: 5′-GCCTTCAGTCAG AGTCCGAGTC-3′;

GAPDH

-F: 5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC -3 «

GAPDH

-R: 5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3 ‘. Den relative ekspression på

CMTM3

blev bestemt ved anvendelse af 2

-ΔΔCt metode [16].

Protein ekstraktion og Western blot-analyse

Væv eller celler var lyseres ved RIPA puffer (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) suppleret med en protease-inhibitor cocktail og phosphataseinhibitorer. En mængde på 30 ug totalt protein blev opløst på SDS-12% polyacrylamidgeler og overført til PVDF-membraner (Hybond-P, Amersham Biosciences Piscataway, NJ, USA). Efter blokering med 5% BSA i Tris-bufret saltvand med 0,1% Tween 20 (TBST) ved stuetemperatur i 2 timer, blev membranen probet med primært antistof ved 4 ° C natten over. Efter vask tre gange med TBST-buffer blev membraner inkuberet med peberrodsperoxidasekonjugeret IgG. De blotting signaler blev visualiseret med Super Signal West Pico Chemiluminescent substrat (Pierce, Rockford, IL, USA). Membraner blev strippet med stripning puffer ved 40 ° C i 30 minutter under forsigtig omrystning og genprobet med et kanin polyklonalt antistof mod β-actin (1:10000, Santa Cruz Biotechnology) som en kontrol for protein lastning.

Konstruktion af promoter reporter plasmider, transfektion og luciferaseanalyse

for at konstruere en række

CMTM3

promoter-drevet luciferase reporter plasmider, seks DNA-fragmenter af den opstrøms af

CMTM3

startcodon blev amplificeret ved PCR (PCR-primere i tabel S1 i File S1) og klonet ind i pGL3-Basic Vector (Promega). Insertionerne blev bekræftet ved direkte sekventering. 293FT og PC3-celler blev udpladet i 24-brønds dyrkningsplader ved 1 x 10

5 celler /brønd og transient transficeret med pGL3 promotor reporter og pRLSV40 som tidligere [15] beskrevet, [17]. Når det angives, pCMV-Sp1 eller pCMV-SP3 ekspressionsplasmider (OriGene, Rockville, MD, USA) blev co-transficeret ind i cellerne. Luciferaseaktivitet blev bestemt ved anvendelse af Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) og normaliseret til Renilla luciferaseaktivitet. Hvert eksperiment blev udført tre gange in triplo. Aktivitet blev defineret som forholdet mellem ildflueluciferase til Renilla luciferase. For

in vitro

methylering analyse på

CMTM3

promotorfragment blev Sss jeg methylase brugt som rapporteret tidligere [15].

DNA bisulfitbehandling og methyleringsanalyse

bisulfit modifikation af DNA og bisulfit genomisk sekventering (BGS) blev udført som tidligere beskrevet [15], [18]. Bisulfit sekventering PCR-primere (BGS-F, TAGATAGTTTTTTTGGATAGGGGTAGA, og BGS-R, ACCTTTAAAAAAACAAAAAAAAACCC) blev designet ved hjælp af online-program, MethPrimer (https://itsa.ucsf.edu/urolab/MethPrimer) [19]. PCR blev udført i 40 cykler med Hotstart Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Tyskland). PCR-produkter blev klonet ind i pGEM-T (Promega, Madison, WI) vektor. Otte til ti hvide kloner for hver prøve blev udvalgt tilfældigt til sekventering.

Immunhistokemi

immunhistokemisk analyse af CMTM3 blev udført under anvendelse af en standard to-trins teknik som tidligere beskrevet [15]. Efter afparaffinering og rehydrering, blev væv objektglassene kogt at hente antigenet i en mikrobølgeovn med 10 mM citratpuffer (pH 6) i 15 min. Objektglassene blev nedsænket i 3% H

2O

2 i 20 min for at blokere endogen peroxidaseaktivitet, vasket med PBS og inkuberet med 3% normalt bovint serum i TBS i 30 min for at forhindre ikke-specifik binding af det primære antistof. Derefter blev væv objektglassene inkuberet med et oprenset kanin-polyklonalt antistof mod CMTM3 (1:500, venligst stillet til rådighed af Dr. Han, Peking University Center for human sygdom Genomics) eller normalt kanin IgG som kontrol ved 4 ° C natten over. Efter vask med PBS tre gange blev objektglassene inkuberet med gede anti-kanin IgG-HRP (sc-2030, Santa Cruz, CA, USA). Efter vask blev væv farvet med frisk fremstillet DAB løsning (DAKO, Carpinteria, CA) og visualiseret og fotograferet med et Leica DM4000B (Leica Microsystems, Inc.).

immunhistokemisk udtryk for CMTM3 blev evalueret baseret en repræsentant høj effekt felt fra to væv array-pletter ved to uafhængige undersøgere. Ekspressionen af ​​CMTM3, baseret på beregning af en samlet immunfarvning score (TIS) som produktet af en del score (PS) og en intensitet score (IS), blev kvantificeret under mikroskop og klassificeret i fire undergrupper: ingen ekspression (0-4) ; svag ekspression (+: 5,6,8); moderat ekspression (++: 9,10,12); intense udtryk (+++: 15). [20]

Adenoviral infektion

adenovirus bærer

CMTM3

gen (Ad-

CMTM3

) og den tomme adenovirus (Ad-null) blev venligst stillet til rådighed af Dr. Han Lab [7]. NCCIT celler blev podet ved 5000 celler /cm

2 i vævsdyrkningsplader, og efter 24 timer blev infektion udført ved udsættelse af cellerne for adenovirus ved den krævede infektionsmultiplicitet (MOI) i serumfrit cellekulturmedium i 60 min, efterfulgt af tilsætning af serum-holdige medier i 1-4 dage.

celleproliferation

til analysen af ​​celleproliferation, NCCIT celler blev inficeret som ovenfor, og celleproliferation blev målt 24, 48 og 72 timer under anvendelse af Cell Counting Kit-8 (CCK-8) ved at følge fabrikantens instruktion. Den spektrofotometriske absorbans ved 490 nm blev målt under anvendelse af en mikropladelæser. Disse data indberettes som middelværdien af ​​mindst tre uafhængige forsøg.

Colony dannelse assay

Cellerne blev inficeret med Ad-

CMTM3

eller Ad-nul. 24 timer efter infektion blev 1000 celler udpladet i hver brønd i plader med 6 brønde og holdt i komplette medier i 2 uger. Overlevende kolonier (≥ 50 celler pr koloni) blev fikseret med methanol, farvet med krystalviolet, talt og fotograferet. Hvert forsøg blev kørt i tre eksemplarer og udført tre gange.

sårheling assay

For in vitro sårheling assay, celler inficeret med Ad-

CMTM3

eller Ad -null blev dyrket i seks-brønds plader indtil sammenflydende. En lige ridse blev skabt over cellelaget anvendelse af en steril mikropipette spids, og resterne blev fjernet ved vask af cellerne med serum-frie medier. Celler blev fotograferet 0 og 36 timer efter sårdannelse. Forsøgene blev udført in triplo.

apoptoseassays

apoptotisk celledød blev bedømt ved flowcytometri under anvendelse af Annexin V-FITC /PI Apoptose Detection Kit ifølge producentens anvisninger. Efter 72 timer blev cellerne høstet og inkuberet med Annexin V-FITC og PI i 30 minutter i mørke ved 4 ° C. Flowcytometrisk analyse blev straks udført. Dataene er præsenteret som bi-parametriske dot plots viser Annexin V-FITC grøn fluorescens versus PI rød fluorescens. Eksperimenterne blev udført tre gange.

Kvantitativ PCR for apoptose pathway

Otteogfyrre timer efter celler blev inficeret med Ad-

CMTM3

eller Ad-null, celler blev høstet , og totalt RNA blev isoleret og oprenset med RNeasy RNA Isolation Kit (Qiagen). En mængde på 2 ug totalt RNA blev anvendt til at syntetisere cDNA’er med RT2 First Strand kit (SABiosciences, QIAGEN). CDNA’erne blev tilsat til en plade med 96 brønde fra RT

2 Profiler PCR-array-system (human apoptose PCR array). Kvantitativ RT-PCR for 84 gener relateret til human apoptose blev udført under anvendelse af iCYCLER iQ5 Real-Time PCR System (Bio-Rad, Hercules, CA). Dataanalyse blev udført ved hjælp af ΔΔ

C

T

metode med fem husholdning gener (

GAPDH

,

RPL13A

,

B2M

,

ACTB

, og

HPRT1

) valgt til normalisering. Udskrifter blev anset fraværende hvis C

t 35 og blev fjernet fra analysen. Ændringer i genekspression blev bestemt ved at sammenligne gentranskription niveauer i celler inficeret med Ad-CMTM3 til celler inficeret med Ad-nul.

Cellecyklusanalyse

Otteogfyrre timer efter celler blev inficeret med ad-

CMTM3

eller Ad-null, blev cellerne trypsiniseret, vasket to gange, resuspenderet i phosphatbufret saltvand (PBS) og fikseret i iskold 70% ethanol. Efter at cellerne blev farvet med propidiumiodid (PI), blev cellecyklusanalyse udføres ved flowcytometri på en fluorescens-aktiveret cellesortering scanner. Fordelingen cellecyklus blev analyseret med Cell Quest software.

statistiske analyser

Statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 19-softwaren. Ekspressionen analyse af CMTM3 mellem testikelkræft væv og de tilsvarende tilstødende væv blev vurderet ved anvendelse af t-test. Sammenligningerne af kategoriske variabler blev udført under anvendelse af x

2 test eller 2-halet t-test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, hvis p-værdien var mindre end 0,05.

Resultater

CMTM3 ofte nedreguleres i testikelcancere

For at undersøge CMTM3 rolle i urogenital cancer, vi først forespørges den Oncomine database [21] for at vurdere de relative ekspressionsniveauer af

CMTM3

i urogenital cancer. To uafhængige undersøgelser viste, at

CMTM3

udtryk blev statistisk signifikant reduceret i testikeltumorer [22], [23] (figur 1A, 1B). Vi målte også

CMTM3

mRNA-niveauer i 10 urogenitale cancer cellelinjer. Sammenlignet med den høje ekspression af

CMTM3

i normale humane testis væv, ekspressionen af ​​

CMTM3

blev stille i en seminom cellelinje (NCCIT) og nedreguleres eller stumme i 2 af 4 prostata cancercellelinjer 2 af 3 renale cancercellelinjer og i ingen af ​​blæren tumorcellelinier undersøgt (figur 1C). Vi analyseret yderligere udtryk for

CMTM3

i 20 parrede testis tumorvæv og de tilsvarende godartede tilstødende væv.

CMTM3

mRNA niveauer blev stille eller stærkt nedreguleret i 16 af 20 testikel kræfttilfælde med en samlet 5-fold fald i forhold til den tilsvarende godartet tilstødende væv (

P

= 0,002) (Figur 1D) . Resultaterne blev bekræftet i protein niveauer ved immunhistokemi farvning (figur 1E).

(A og B) Udtrykket af CMTM3 i individuelle prøver fra normale testis væv eller testikelkræft vises (data normaliseret til log2 skala fra de Sperger datasæt [23] og Korkola [22]). Sammenligninger mellem grupper blev udført ved anvendelse af Students t-test, med p-værdier er angivet i hvert panel. (C) Udtrykket af

CMTM3

i normale testis væv og urogenitale cancer cellelinjer blev bestemt ved real-time RT-PCR. Data er vist som middelværdi ± S.D. for tre uafhængige forsøg. (D) Udtrykket af

cmtm

3 i 20 testiklerne tumor prøver og parrede normale testis væv blev bestemt ved real-time RT-PCR. Data er vist som middelværdi ± S.D. fra tre uafhængige forsøg. (E) Repræsentant immunhistokemi farvning for CMTM3 i testiklerne tumor prøver og parrede normale testis væv.

Desuden har vi udvidet analysen af ​​CMTM3 udtryk for en uafhængig kohorte af testikel væv microarray ved immunhistokemi (tabel 1, Figur S1 i File S1). Af 75 tilfælde af testis tumorer, 36 (48%) tilfælde af tumorer viste ingen CMTM3 udtryk, 27 (36%) tilfælde af tumorer havde lav CMTM3 udtryk, og 12 (16%) tilfælde af tumor havde moderat CMTM3 udtryk. Alle af 18 (100%) tilfælde af kræft tilstødende normale væv og normale testikel væv havde intensiv eller stærk intensiv CMTM3 udtryk (tabel 1). Alle 8 (100%) tilfælde af atrofi havde intensiv CMTM3 udtryk. Vigtigt er det, var ingen enkelt tilfælde observeret hvor CMTM3 farvning var mere intens i tumor end i normal testikel, yderligere fremhæve specificiteten af ​​den observerede mønster (tabel 1). Vi undersøgte også sammenhængen mellem CMTM3 udtryk i seminom med patologiske parametre, og bemærkede, at faldet CMTM3 er signifikant associeret med fremskreden T etape (Tabel S2 i File S1).

Re-ekspressionen af ​​CMTM3 hæmmer celle vækst og celle migration

lyddæmpning af

CMTM3

i testikelkræft viste, at CMTM3 kunne være en funktionel tumor suppressor i testikelkræft carcinogenese. For at undersøge væksthæmmende effekt af

CMTM3

, re-ekspressionen af ​​

CMTM3

i forbigående inficerede NCCIT celler blev bekræftet ved RT-PCR og Western blotting (figur 2A). Som vist i figur 2B, blev cellevækst signifikant reduceret i Ad-

CMTM3

-inficerede NCCIT celler sammenlignet med Ad-nul-inficerede kontrolceller. Den undertrykkende virkning på cancercellevækst blev yderligere bekræftet ved en koloni-dannelse assay. Koloni-numre blev væsentligt reduceret sammenlignet med de kontrol celler til 32% i NCCIT celler inficeret med Ad-

CMTM3 Hotel (P 0,01). (Figur 2C)

(A) Ekspression af CMTM3 i NCCIT celler efter infektion med Ad-CMTM3 blev bekræftet under anvendelse af RT-PCR og Western blots. (B) Celleproliferation blev registreret af WST-1 assay NCCIT celler efter infektion med Ad-nul eller Ad-

CMTM3

. (C) Repræsentative resultater af koloni-dannelse-assays med NCCIT celler. (D) Migration blev bestemt ved en sårhelende assay i NCCIT celler inficeret med Ad-nul eller Ad-

CMTM3

. Resultaterne er repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Desuden blev virkningen af ​​CMTM3 på testikelkræft cellemotilitet undersøgt af en sårhelende assay. Sammenflydende monolag af celler blev ridset til dannelse sår og derefter dyrket i 24 timer. Ektopisk CMTM3 udtryk ført til væsentligt reduceret sårheling celle migration i forhold til Ad-null-inficerede celler (Figur 2D). Ad-

CMTM3

transficerede celler blev runde og fritliggende, mens ikke blev observeret nogen tydelig ændring i Ad-nul-inficerede celler, hvilket er i overensstemmelse med en tidligere rapport [8].

Re- udtryk for CMTM3 inducerer cellecyklusstop i G2 fag og celle apoptose

den markante undertrykkelse af spredning af CMTM3 fik os til at vurdere virkningerne af CMTM3 på cellecyklus distribution og apoptose af testikelkræft celler. Repræsentative resultater af distributionen celle-cyklus i Ad-null- eller Ad-

CMTM3

-inficerede NCCIT celler er vist i figur 3A. Flowcytometrianalyse afslørede en signifikant G2 cellecyklusstandsnings i CMTM3-udtrykkende celler sammenlignet med kontrol-inficerede celler (figur 3A).

(A) repræsentant cellecyklusanalyse. Resultaterne er repræsenteret som gennemsnittet ± standardafvigelse og er baseret på tre uafhængige forsøg (p 0,01). G1 og G2 faser i rød, S faser i hvid. (B) NCCIT celler inficeret med Ad-nul og Ad-

CMTM3

blev mærket med FITC-Annexin V /PI, og apoptose blev vurderet med flowcytometri. (C) Western blot analyse af celle cycle- og apoptose-relaterede proteiner i Ad-null- og Ad-

CMTM3

-inficerede NCCIT celler. β-actin blev anvendt som kontrol. Alle eksperimenter blev udført tre gange. (D) En skematisk illustration af den foreslåede model, der afbilder en p53-uafhængig apoptose vej hos testikeltumorer.

Vi undersøgte også den apoptotiske virkning af CMTM3 i testikelkræft celler ved anvendelse Annexin V-FITC /PI-farvning assays. Andelen af ​​Annexin V-positive /PI-positive celler steg med 15,4% i Ad-

CMTM3

-transduced NCCIT celler (figur 3B). Disse resultater indikerer, at den inhiberende virkning på celleproliferation med CMTM3 er sandsynligvis medieret af G2 cellecyklusstop og apoptose.

CMTM3 inducerer cellecyklusstop og apoptose i en p53-uafhængig måde

Sådan udforske den molekylære mekanisme CMTM3-induceret cellecyklusstandsning, vurderede vi virkningen af ​​CMTM3 re-ekspression på ekspressionen af ​​cellecyklussen regulator, p21. Som vist i figur 3C, kan CMTM3 forøge mRNA og protein niveauer af p21.

For at bestemme den molekylære mekanisme CMTM3-induceret apoptose, vi udnyttet Human Apoptose RT

2 Profiler PCR Array, som indeholder 84 kendte apoptotiske gener, til at overvåge udtrykket profiler af NCCIT celler inficeret med Ad-

CMTM3

. Til vores overraskelse, viste resultaterne, at

TP53

og en række gener (

APAF1

,

BAX

, og

BCL10

) var signifikant op- reguleret (tabel 2). Disse resultater blev verificeret ved qPCR med forskellige primere end dem, der anvendes i PCR array. De proteinniveauer blev også forøget med en tilsvarende størrelsesorden (figur 3C, tabel 2).

Dernæst vi undersøgt aktiveringen af ​​apoptotiske vej ved Western-analyse. Som vist i figur 3C, blev spaltet caspase-3 fragment markant forøget, mens pro-caspase-3 blev markant reduceret i CMTM3 re-udtrykkende testikulære cancerceller sammenlignet med kontroller (figur 3C). Re-udtrykkende CMTM3 også markant fremmet caspase-9 proteinekspression i testiklerne kræftceller. I mellemtiden blev forøget spaltet poly (ADP-ribose) polymerase observeret i CMTM3-transficerede celler, men blev sjældent påvises i kontrolceller (figur 3C). Disse data tyder på, at CMTM3 letter testikelkræft celle apoptose i en p53-uafhængig måde, som p53 er ikke fuldt funktionel i NCCIT celler [24] (Figur 3D).

Methylering af en specifik, enkelt CpG sted i klinisk testikelkræft prøver er signifikant associeret med CMTM3 udskrift udtryk

Som epigenetisk regulering er involveret i ekspressionen af ​​

CMTM3

[8], vi spurgte, om

CMTM3

promotor DNA methylering er forbundet med en tilsvarende reduktion i CMTM3 udtryk i testikel kræft.

for at definere promotorområdet kontrollerende

CMTM3

udtryk, en række afkortede promotor-konstruktioner blev genereret og indsat i pGL3 luciferase reporter vektorer, og aktiviteten af ​​promotoren blev bestemt ved at analysere for luciferase. Som vist i figur 4A, blev den mest betydningsfulde promotoraktivitet fundet i en ~400 bp fragment (-343 til -83 bp fra start codon stedet). To formodede bindingssteder for Sp1 /SP3 elementer i ~400 bp fragmentet, blev identificeret ved de motiv forudsigelse softwareprogrammer transkriptionsfaktor.

(A) Promotor aktivitet af humane CMTM3 deletionskonstruktioner i 293FT og PC3-celler. Cellerne blev transficeret med 0,8 ug pGL3-basiske eller luciferase reporter konstruktioner indeholdende forskellige størrelse promotorfragmenter. (B) Virkninger af Sp1 /SP3 på reporter genekspression. 293FT og PC3-celler blev transficeret med pCMV

Sp1 /SP3

ekspressionsplasmider eller tom vektor som kontrol. (C) Promotorfragmentet (PGL-D) og in vitro methylerede fragment (PGL-PD SSSI) blev transficeret ind 293FT og PC3-celler, og et luciferase-assay blev udført. Alle konstruktioner blev cotransficeret med pRLSV40 vektor som en intern kontrol for transfektionseffektivitet. Luciferaseaktivitet er udtrykt som procent aktivitet af kontrollen. Dataene er udtrykt som middel ± SE

For at bekræfte, om den relevante

cis

virkende elementer, Sp1 og Sp3, er involveret i reguleringen af ​​

CMTM3

genekspression, 293FT og PC3 celler blev cotransficeret med konstruktionen pGL3-

PD

pCMV

Sp1

eller pCMV

Sp3

. Luciferasereportergen analyser viste, at overekspression af Sp1 eller Sp3 væsentlig grad kan øge

CMTM3

promotor-aktivitet (figur 4B). Desuden blev CMTM3 promotor-aktivitet reduceret drastisk efter methylering (figur 4C).

Vi næste udført bisulfit sekventering af 53 CpG sites herunder

CMTM3

kerne promotor region (-353 til 126 bp fra start codon stedet) i 13 parrede primære testis tumorprøver (figur 5A). Resultaterne viste, at en enkelt CpG site ved -155 bp, placeret ved krydset af de to Sp1 /SP3 bindingssteder, blev mere markant methyleret i tumorvæv (40,4% og 9,0%, henholdsvis), hvor

CMTM3

blev nedreguleret, end i tilsvarende ikke-tumorvæv (figur 5B). Ingen signifikant DNA-methylering blev observeret på de andre 52 CpG sites. En statistisk signifikant omvendt sammenhæng blev observeret mellem methylering af det indre CpG site ved -155 bp og niveauet af

CMTM3

mRNA ekspression i kliniske prøver (

P

= 0,01, R

2 = 0,246) (figur 5C). Dette fund tyder på, at

CMTM3

transskription i testikelkræft bestemmes, i det mindste delvist, ved methylering af en konkret, enkelt CpG sted inden for

CMTM3

promoter region.

(A) Skematisk struktur CMTM3 genet, CpG-øer, formodede transcriptionsfaktor bindingssites og transkriptionsstartstedet. Exoner er angivet med grønne rektangler. Translationsstartstedet er angivet med en buet pil. Den nedadgående pil viser den potentielle bindingssted for Sp1 /SP3. BGS primere for methylering analyser fremgår. (B) methylering af den CMTM3 promotorregionen blev analyseret ved BGS. Methylering af 8 bindingssteder for CpG i kernen promotorregionen for 3 parrede tumor og tilsvarende godartede tilstødende væv vises. (C) at methylering af enkelt CpG site ved -155 bp af CMTM3 promotorregionen for 13 parrede tumor og tilsvarende godartede tilstødende væv, afbildet som den CMTM3 mRNA-ekspression i testikelkræft væv. En statistisk signifikant negativ korrelation overholdes. Pearson korrelation, p = 0,01, R

2 = 0,246.

Diskussion

CMTM3

er stærkt udtrykt i normal testikler [25], men dens rolle i testikelkræft stadig undvigende. I nærværende undersøgelse fandt vi, at

CMTM3

blev ofte nedreguleret eller tavshed i testikelkræft cellelinjer og primære tumorer (figur 1, tabel 1) .Vi yderligere udført funktionelle studier NCCIT celler til at afsløre den biologiske funktion af CMTM3. Vi fandt, at re-ekspressionen af ​​CMTM3 stærkt svækket NCCIT celle motilitet og undertrykt kolonidannelse (figur 2), som var i overensstemmelse med tidligere rapporter i andre kræftformer [8], [13]. Cellecyklusanalyse viste, at CMTM3 inhiberede celleproliferation ved at øge andelen af ​​celler i G2 fase og fremme celleapoptose (figur 3A, 3B). Disse data antydede, at CMTM3 fungerer som en tumorsuppressor i TGCTs. Tidligere undersøgelser har vist, at cmtm familie proteiner, herunder CMTM3 [8], CMTM5 [26], [27] og CMTM8 [28], [29], kan inducere celle apoptose. Men den apoptosecyklus og mekanismen forbliver undvigende. I nærværende undersøgelse fandt vi, at re-ekspressionen af ​​CMTM3 i NCCIT celler fremmet transskription af

TP53

,

P21

, og

BAX

, og øget deres protein niveauer ved en lignende størrelsesorden (tabel 2, figur 3C). p53 er ikke fuldt funktionelt i NCCIT celler, hvilket antyder, at der ikke er nogen klar sammenhæng mellem trans-aktivering af p53 og fremkaldelse af apoptose i NCCIT celler [24]. Imidlertid p21 blev signifikant forøget. Således blev muligheden rejst, at CMTM3 kunne fremkalde en G2 cellecyklusstop og lette celle apoptose via p21 eller andre veje i en p53-uafhængig måde, som rapporteret i andre undersøgelser (Figur 3D) [30] – [32].

nedregulering af tumorsuppressorer er forbundet med transkriptionel hæmning gennem induktion af undertrykkende epigenetiske ændringer i promotor, herunder DNA methylering og histon modifikation [33].