PLoS ONE: Flere Analyser af G-protein koblet receptor (GPCR) Udtryk i udviklingen af ​​Gefitinib-Modstand i Transforming Ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Der er stigende tegn på, at funktionel krydstale mellem GPCRs og EGFR bidrager til progression af colon, lunge, bryst, ovarie, prostata og hoved- og halskræft. I denne undersøgelse udførte vi flere analyser af GPCR ekspression i en gefitinib-resistent ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) cellelinie, H1975, der huser en L858R /T790M-mutationen. For at bestemme ekspressionsprofilen af ​​mRNA’er, der koder 384 GPCR’er i normalt humant lunge fibroblast (NHLF) og H1975-celler, blev udført en GPCR-specifik microarray analyse. En varme-kort over microarray afsløret betydelige forskelle i ekspression af GPCRs mellem NHLF og H1975 celler. Fra GPCR udtrykslisten, valgte vi nogle GPCR-agonister /antagonister at undersøge, om de respektive ligander kan påvirke væksten af ​​H1975-celler. Blandt dem, behandling med enten en selektiv antagonist af adenosin A2a receptorer, som var stærkt udtrykt i H1975 celle og en anden gefitinib-resistente NSCLC celler, HCC827GR celler eller “lille interfererende RNA” (siRNA) målretning adenosin A2a receptorer produceret et signifikant fald i celle levedygtighed både H1975 og HCC827GR celler. Blandt opreguleret GPCRs i H1975 celler blev GS-, gi- og Gq-koblede GPCR’er udtrykte næsten ligeligt. Blandt nedreguleret GPCR’er blev Gi-koblede GPCR’er overvejende udtrykt i H1975-celler. De foreliggende resultater tyder på, at flerlaget krydstale mellem GPCR’er og EGFR kan spille en vigtig rolle for tilrettelæggelsen nedstrøms signaleringsmolekyler, der er impliceret i udviklingen af ​​gefitinib-resistent NSCLC

Henvisning:. Kuzumaki N, Suzuki A, Narita M, Hosoya T, Nagasawa A, Imai S, et al. (2012) Flere Analyser af G-protein koblet receptor (GPCR) Udtryk i udviklingen af ​​Gefitinib-Modstand i Transforming Ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 7 (10): e44368. doi: 10,1371 /journal.pone.0044368

Redaktør: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

Modtaget: 10. september 2011; Accepteret: August 2, 2012; Udgivet: 29 oktober, 2012 |

Copyright: © 2012 Kuzumaki et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) er den hyppigste dødsårsag af kræft. Mens kemoterapi lidt kan forlænge overlevelsen hos patienter med fremskreden sygdom, er det også forbundet med klinisk signifikante bivirkninger [1]. Epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) er et vigtigt mål for molekylær anti-NSCLC terapi [2]. Gefitinib mål ATP kløft i tyrosinkinasen EGFR, som overeksprimeres i 40-80 procent af NSCLC og mange andre epiteliale cancere [3]. EGFR-signalering udløses ved binding af vækstfaktorer, såsom EGF, hvilket resulterer i enten dimerisering af EGFR molekyler eller heterodimerisering med beslægtede receptorer, såsom HER2. Autophosphorylering og transphosphorylering af EGFR’er gennem deres tyrosinkinasedomæner rekrutterer nedstrømseffektorer og aktiverer signaler for proliferation og celle-overlevelse [4]. Mutationer er blevet identificeret i EGFR-genet i prøver fra patienter med NSCLC, der responderer på EGFR inhibitorer [5]. Disse mutationer består af små deletioner, som påvirker aminosyrerne 746 gennem 750 (delE746-A750) eller punktmutationer (oftest leucin erstattet af arginin i codon 858 [L858R]) [6], [7], [8]. Disse mutationer ændrer nedstrøms signalering og antiapoptotiske mekanismer, og dermed mediere onkogene virkninger [9]. Begge disse mutationer gør tumoren mere følsomme over for forbindelser, der inhiberer EGFR, mest sandsynligt ved at flytte kritiske rester, som omgiver den ATP-bindende kløft tyrosinkinasedomænet af receptoren, som stabiliserer interaktion med både ATP og kompetitive inhibitorer [6] [7]. I vores tilfælde, DNA-sekventering af EGFR-genet i en tumor biopsiprøve ved tilbagefald viste et andet punkt mutation, der ændrede threonin til methionin i position 790 (T790M) af EGFR [5]. Effekten af ​​gefitinib er af begrænset varighed, hovedsageligt på grund af lægemiddelresistens er knyttet til et andet punkt mutation.

Aktiviteten af ​​Akt, som også er kendt som proteinkinase B (PKB), stimuleres af forskellige vækstfaktorer , og dette serin-threoninkinase spiller evolutionært konserverede roller i mange cellulære funktioner, såsom proteinsyntese og cellevækst [10], [11]. Det er blevet rapporteret, at EGFR-inhibitor ændrer stærk, forbigående Akt phosphorylering til svag, vedvarende Akt phosphorylering. På grund af de lavpasfilterkredsløbene karakteristika Akt pathway fører dette til den stærkere phosphorylering af S6, som er et molekyle nedstrøms Akt, end i fravær af inhibitoren. Således kunne EGFR-inhibitor fungere som en nedstrøms aktivator af EGFR [12]. Tilsammen tyder disse resultater på, at processen med gefitinib-resistens fører til forværring af tumorceller.

En stor mængde data viser, at G-protein-koblede receptorer (GPCRs) spiller en afgørende rolle i tumorigenese, og er impliceret i vigtige skridt i kræft progression fra transformation, vækst og overlevelse til metastaser. En anden vigtig måde at GPCRs bidrager til tumorigenese indebærer intensiv krydstale med en kanonisk vej. Der er betydelig dokumentation for, at agonister af nogle GPCRs, gennem en proces kaldet transaktivering kan aktivere vækstfaktor receptor (RTK’er) i fravær af tilsat vækstfaktor [13], [14], [15]. Dette er en vigtig vej, der bidrager til vækstfremmende aktivitet af mange GPCR-ligander. På den anden side har nylige resultater viste, at RTK’er transducerer signaler gennem anvendelse GPCR signalmolekyler og RTK ligander selv kan transaktivere GPCR’er. For at mægle tumor overlevelse og spredning kan GPCR’ere interagere med EGFR nedstrøms signalveje, herunder phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) /Akt, og Janus kinase /signal transducere og aktivatorer af transkription (Jak /Stat3) veje. Faktisk den funktionelle krydstale mellem GPCR og EGFR bidrager til udviklingen af ​​tyktarms-, lunge-, bryst-, ovarie-, prostata- og hoved og hals tumorer [16], [17]. Således kunne GPCR være en fremragende sted for at blokere tumorgene signaler, hvilket ville gøre GPCR-medierede funktioner lovende terapeutiske mål i lægemiddeludvikling at opnå innovative intervention i NSCLC. I den foreliggende undersøgelse, udførte vi flere analyser af GPCR ekspression i en gefitinib-resistent NSCLC cellelinie, H1975.

Materialer og metoder Salg

Cellekultur

Den humane ikke- småcellet lungecancer celle (NSCLC) linjer HCC827, NCI-H1975 (H1975; American Type Culture Collection Co, MD, USA) og HCC827GR blev dyrket i RPMI 1640 medium HEPES Modifikation (Sigma-Aldrich Co., MO, USA) med 10% føtalt bovint serum (FBS; Invitrogen ™ Life Technologies Co., CA, USA) og 1% penicillin-streptomycin (PS; Invitrogen ™ Life Technologies Co.). Normale humane lungefibroblaster (NHLF, Lonza Inc., NJ, USA) blev dyrket i fibroblast basalt medium med insulin, rhFGF-B, GA-1000 og FBS (alle fra Takara Bio Inc., Tokyo, Japan). Alle celler blev holdt under en fugtig atmosfære af 5% CO

2 ved 37 ° C.

Oprettelse af gefitinib-resistent cellelinje, HCC827GR

HCC827 celler blev udsat for 1 uM af gefitinib i 48 timer i medium indeholdende 10% føtalt bovint serum. De blev derefter vasket og dyrket i stoffri medium, indtil overlevende celler var 80% konfluente. Disse celler blev derefter igen eksponeret for stigende koncentrationer af gefitinib (fra 1 til 5 uM). Celler endelig kunne vokse i 5 uM gefitinib blev opnået 1,5 måneder efter indledende eksponering. De etablerede resistente celler blev holdt i medium indeholdende 1 uM af gefitinib. For alle in vitro-undersøgelser blev resistente celler dyrkes i stoffri medium i mindst en uge for at eliminere gefitinib. Gefitinib-resistente celler omtales som HCC827GR

Reagenser

anvendes i den foreliggende undersøgelse reagenser var gefitinib (Toronto Research Chemicals Inc., Canada), [Arg

8]. – vasopressin acetatsalt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), angiotensin II (Sigma Chemical Co.), 2- (methylthio) adenosin-5′-triphosphat tetranatriumsalt-hydrat (Sigma Chemical Co.), beraprost natrium ( Toray Industries Inc., Tokyo, Japan), a-methyl-5- (2-thienylmethoxy) -1 H-indol-3-ethanamin monohydrochlorid (BW723C86; Sigma Chemical Co.), 2-

s

– ( 2-carboxyethyl) phenethylamino-5′-N-ethylcarboxamidoadenosin hydrochlorid-hydrat (CGS 21680; Sigma Chemical Co.), 7- (2-phenylethyl) -5-amino-2- (2-furyl) – pyrazolo [4, 3-e] -1,2,4-triazolo [1,5-c] pyrimidin. (SCH-58.261; Sigma Chemical Co.)

Cellelevedygtighed assay

Celler levedygtighed blev bestemt af 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) assay. Tyve pi MTT-opløsning (5 mg /ml) blev tilsat til hver brønd af dyrkningsmediet. Efter inkubering i yderligere 2 timer blev mediet fjernet, og 100 pi DMSO blev tilsat for at løse formazankrystaller. Optisk densitet blev målt fremstillet ved anvendelse af en mikropladelæser ved en absorptionsbølgelængde 600 nm. I hvert eksperiment blev tre replikater fremstillet for hver prøve. Andelen af ​​levende celler blev bestemt baseret på forskellen i absorbans mellem prøver og kontroller.

GPCR TaqMan Array

Et kommercielt tilgængeligt TaqMan Array Menneskelig GPCR kort (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA), der giver os mulighed for at kvantificere ekspressionen af ​​mRNA, der koder GPCRs fra 50 underfamilier (343 receptorer, ikke herunder lugtstof, olfaktoriske, gustatoriske og feromon-receptorer), blev anvendt med RNA udvundet fra NHLF og H1975 celler. Total RNA, opnået fra NHLF og H1975-celler, blev ekstraheret under anvendelse af Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Applied Biosystems Inc.). Til dette assay blev cDNA fremstillet med en høj kapacitet RNA til cDNA kit (Applied Biosystems Inc.). Hver port blev indlæst med cDNA (fra 1,5 ug RNA) og TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems Inc.) ifølge producentens anvisninger. Pladen blev analyseret ved hjælp SDS2.3 og RQ manager 1.2 software leveret af Applied Biosystems. Cyklustider blev normaliseret aaato husholdning gen GAPDH. En sammenlignende Ct fremgangsmåde blev anvendt til at kvantificere de relative niveauer af mRNA under anvendelse RQ 1.2 software. Relative ekspressionsniveauer blev beregnet som 2 × 10

5. Resultaterne for hver GPCR blev undersøgt, og hvis prøven havde en beregnet grænseværdi under 0,1, blev det anset for at være målbart. I disse tilfælde, for databehandling formål, blev cyklen nummer sat til 35,0.

RNA forberedelse og semi-kvantitativ analyse ved revers transkription-polymerasekædereaktion (RT-PCR)

Total RNA i NHLF blev H1975, HCC827 og HCC827GR ekstraheret under anvendelse af SV Total RNA Isolation System (Promega, Madison, WI) ifølge producentens instruktioner. Oprenset total RNA blev kvantificeret spektrofotometrisk ved A260. Til fremstilling første-streng cDNA, 1 ug af RNA blev inkuberet i 100 pi puffer indeholdende 10 mM dithiothreitol, 2,5 mM MgCl

2, dNTP-blanding, 200 U revers transcriptase II (Invitrogen), og 0,1 mM oligo-dT12 -18 (Invitrogen). Hvert gen blev amplificeret i 50 pi PCR-opløsning indeholdende 0,8 mM MgCl

2, dNTP-blanding, og DNA-polymerase med syntetiserede primere af human A2a receptor (sense: GGCTGCCCCTACACATCATCAACT, antisense: TGGGCCAGGGGGTCATCT) og GPR87 (sense: 5′- CTCTAAAGGGGTAAGGGAGA -3 ‘, antisense: 5′-TGGGTTCAGCATAGGTTATT-3’). Prøver blev opvarmet til 95 ° C i 1 min, 55 ° C i 2 min og 72 ° C i 3 minutter. Den sidste inkubation var ved 72 ° C i 7 min. Blandingen blev kørt på 2% agarose-gelelektroforese med de angivne markører og primere til den interne standard glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase. Agarosegelen blev farvet med ethidiumbromid og fotograferet med UV-gennemlysning. Intensiteten af ​​båndene blev analyseret og semi-kvantificeres ved computerstøttet densitometri hjælp ImageJ software.

Sample forberedelse og Western blotting

Cellerne blev opløst med buffer indeholdende 20 mM Tris-HCI (pH 7 .4), 0,3% (vægt /volumen) Triton, 3 mM MgCb

2, 1 M saccharose, 5 mM α-ME, og 1 /1.000 proteaseinhibitor i 15 min. Cellelysater blev centrifugeret ved 2.350 g i 10 minutter ved 4 ° C, og supernatanten blev bevaret som lysatet fraktion til Western blotting. En alikvot af prøven blev fortyndet med et tilsvarende volumen af ​​2 x elektroforese prøvebuffer (Protein Gel Loading Dye-2X, Amresco, Solon, OH) indeholdende 2% natriumdodecylsulfat (SDS) og 10% glycerol med 0,2 M dithiothreitol. Proteiner (7 pl /bane) blev separeret efter størrelse på 4-20% SDS-polyacrylamid gradient gel og overført til nitrocellulosemembraner i Tris-glycinbuffer indeholdende 25 mM Tris og 192 mM glycin. For immunoblot detektion blev membraner blokeret i Tris-bufret saltvand (TBS) indeholdende 1% fedtfri mælk (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) indeholdende 0,1% Tween 20 (Research Biochemicals, Inc., MA, USA) i 1 timer ved stuetemperatur under omrøring. Membranen blev inkuberet med primært antistof fortyndet i TBS [1:1000 GPR87 (Abcam, Cambridge UK), 1:200,000 glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH; Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA)] indeholdende 1% nonfat tørmælk med 0,1% Tween 20 natten over ved 4 ° C. Membranen blev vasket i TBS indeholdende 0,05% Tween 20 (TTBS), og derefter inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med peberrodsperoxidase-konjugeret gede anti-kanin IgG (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL, USA) fortyndet 1 :10,000 i TBS indeholdende 1% fedtfri tørret mælk indeholdende 0,1% Tween 20. Efter denne inkubation blev membranerne vasket i TTBS. Antigen-antistof-peroxidase-kompleks blev endelig detekteret ved forøget kemiluminescens (Pierce, Rockford, IL, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger og visualiseret ved udsættelse for Amersham Hyperfilm (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, IL, USA).

“små interfererende RNA” (siRNA) transfektion

H1975 og HCC827GR celler blev transficeret med kommercielt tilgængelige “små interfererende RNA” (siRNA) målretning adenosin A2a receptorer (NIPPON EGT CO., Toyama, Japan) efter reversfase transfektion metode. Den tilsvarende mål-mRNA-sekvensen af ​​adenosin A2a receptor for siRNA var som følger: 5′- ACAGCAACCTGCAGAACGT-3 ‘, (accession nummer: NM_000675.4). Kort fortalt blev adenosin A2a receptor genspecifikke siRNA fortyndet i Opti-MEM (Invitorogen) og blandes med RNAimax (Invitorogen) præ-fortyndet i Opti-MEM. Efter 20 minutters inkubering ved stuetemperatur blev komplekserne tilsat til 96-brønds. Derefter blev celler (5 x 10

3 celler) podes i, godt. Efter 3 dages dyrkning blev cellelevedygtighed detekteret ved MTT-assayet.

Statistical Analysis

Alle data er præsenteret som gennemsnit ± S.E.M. Den statistiske signifikans af forskelle mellem grupper blev bedømt ved envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Bonferroni /Dunn multiple sammenligningstest. Den statistiske signifikans af forskelle mellem to grupper blev vurderet med Students

t

-test.

Resultater

Effekt af tyrosinkinaseinhibitoren gefitinib på væksten af ​​ikke-småcellet lungecancer (NSCLC) -celler

Tilsætning af tyrosinkinaseinhibitoren gefitinib (0,0001 pM-1 uM) til HCC827 celler, der er blevet klassificeret som gefitinib-sensitive NSCLC cellelinje [5], i 2 dage produceret en koncentrationsafhængig formindskelse i tumorcellevækst (figur 1a-i, p 0,001 versus ikke-behandlede gruppe). I modsætning hertil tilsætning af gefitinib (0,0001 pM-1 uM) i 2 dage ikke påvirke væksten af ​​H1975-celler (figur 1A-ii).

HCC827 (a) eller H1975 (b) celler blev inkuberet 2 dage med gefitinib, og derefter cellelevedygtighed blev målt (*** p 0,001 vs. ikke-behandlede gruppe).

Forskellige udtryk for GPCRs mellem NHLF og H1975 celler

for at profilere udtryk for mRNA, der koder for 384 GPCR i NHLF og H1975 celler, blev udført en TaqMan GPCR-specifikke microarray analyse (figur 2, 3, Tal S1-1, S1-2, S1-3 til listen over GPCR gener i array). Scatter plot viste, at der var mange flere up-regulerede GPCRs end ned-regulerede GPCR’ere i H1975 celler sammenlignet med NHLF. En varme-kort over microarray afsløret betydelige forskelle i ekspression af GPCRs mellem NHLF og H1975 celler (figur 2, 3).

Menneskelig GPCR udtryk blev analyseret ved mikroarrays.

hver GPCR er vist som en enkelt stang baseret på deres Ct-værdier og farvekoder er vist nedenfor, med en gradient fra grøn (negativ og laveste Ct-værdier) til rød (positiv og højeste Ct-værdier).

Ændringer i udtrykket forhold mellem Ga underenheder (Gs, Gi og Gq) i H1975 celler

udtrykket mønstre af Ga underenheder blandt op- eller ned-regulerede GPCR’ere af H1975 celler sammenlignet med NHLF blev tildelt følgende grupper: opreguleret Gs-koblet GPCR (tabel 1-a), opreguleret Gi-koblet GPCR (tabel 1-b), opreguleret Gq-koblet GPCR (tabel 1-C), nedreguleret Gs-koblet GPCR (tabel 2-a), nedreguleret Gi-koblede GPCR (tabel 2-b) og nedreguleret Gq-koblede GPCR (tabel 2-c).

mRNA og dens protein udtryk for GRP87, som var den mest opreguleret GPCR findes i GPCR vifte, var signifikant opreguleret i H1975 celler i forhold til dem i NHLF celler (Figur 4a: p 0,01 vs. NHLF, Figur 4b: p 0,001 vs. NHLF). (B) Øvre: Repræsentative Western blots af GPR87 Lavere: Repræsentative Western blots af GPR87 i hindeagtige fraktioner af H1975 celler. Hver søjle repræsenterer middelværdien med S.E.M. af 3 uafhængige prøver (** p 0,001 vs. ikke-behandlede gruppe).

Blandt opreguleret GPCR’ere i H1975 celler, GS-, gi- og Gq-koblede GPCR blev udtrykt næsten lige . Blandt nedreguleret GPCR’er blev Gi-koblede GPCR’er overvejende udtrykt i H1975-celler (figur 5)

Procentdelen af ​​ekspressionsmønsteret for Ga subunit. (Gs: rød, Gi: blå og Gq: grøn) i op- eller ned-regulerede GPCR’ere af H1975 celler sammenlignet med NHLF vises.

Virkninger af en selektiv GPCR agonist eller antagonist på væksten af ​​gefitinib-resistente H1975 celler

fra GPCR-ekspression liste blev nogle kommercielt tilgængelige GPCR-agonist /antagonist valgt at undersøge, om de respektive ligander påvirkede væksten af ​​H1975 celler (figur S2). En adenosin A2a-receptor (CGS-21680), en angiotensin II-receptor-like 1 agonist (angiotensin II) og en purinergisk receptor P2Y G-protein-koblede 2 agonist (2- (methylthio) adenosin-5′-triphosphat tetranatriumsalt-hydrat), der var alle agonister af opreguleret GPCR’er i mikroarrayet listen, havde ingen virkning på tumorcellevækst. Tilsvarende blev cellevækst ikke påvirket af en prostaglandin I

2 receptor (IP) agonist (beraprost natrium), en 5-hydroxytryptamin receptor 2B agonist (BW723C86) og en arginin vasopressin receptor 1A agonist ([Arg

8] -vasopressin acetat salt), som alle blev klassificeret som “ned-regulerede GPCR’er”. I modsætning hertil tilsætning af selektive adenosin A2a-receptor-antagonist SCH-58.261 (10 nM-10 pM) i 7 dage (figur 6A) frembragte en koncentrationsafhængig formindskelse i H1975 cellevækst (p 0,01, s 0,001 vs. ikke- behandlede gruppe)

(a) H1975-celler blev inkuberet i 7 dage med den selektive adenosin A2a-receptor-antagonist SCH-58.261 (10 nM-10 pM), og derefter cellelevedygtighed blev målt (** p. 0,01 , *** p 0,001 versus ikke-behandlede gruppe). (B) Behandling med siRNA rettet mod adenosin A2a-receptorer til H1975 celler i 3 dage faldt betydeligt cellelevedygtigheden af ​​H1975 celler (** p 0,01 vs. ikke-behandlede gruppe).

Vi næste udføres for at transducere siRNA targeting adenosin A2a-receptorer i H1975-celler. Celler blev høstet til detektion af adenosin A2a-receptor-mRNA-niveau semi-kvantitativt ved RT-PCR ved 72 h efter transfektion. Adenosin A2a-receptor-ekspression i nærvær af siRNA targeting adenosin A2a-receptorer blev nedreguleret med 90% i forhold til ikke-behandlede (data ikke vist). Under disse betingelser, behandling med siRNA targeting adenosin A2a receptorer produceret et signifikant fald i H1975 cellevækst (figur 6b: p 0,001 versus ikke-behandlede gruppe).

rolle adenosin A2a receptorer i væksten af ​​gefitinib resistente HCC827GR celler

for at bekræfte funktionen af ​​adenosin A2a receptorer på gefiitnib-resistens over for NSCLC, genereret vi anaother gefitinib-resistente HCC827GR celler ved at udsætte HCC827 celler til stigende koncentrationer af gefitinib til 1,5 måneder. Ifølge en sekvensanalyse, HCC827GR celler havde andet punkt mutation, skyldes hovedsageligt forårsages medikamentresistens, 2369 C T i EGFR exon 20-21, som førte til overgange Thr790Met (Figur 7a-i). Derfor har tilføjelsen af ​​gefitinib (0,01 uM-1 uM) i 2 dage ikke påvirke væksten af ​​HCC827GR celler (figur 7a-ii). Udtrykket af adenosin A2a-receptor-mRNA blev dramatisk forøget i HCC827GR celler i forhold til HCC827 og NHLF celler (figur 7b, p 0,001 vs. NHLF). Under disse betingelser, den selektive adenosin A2a-receptor-antagonist SCH-58.261 (10 nM-1 uM) i 7 dage producerede en koncentrationsafhængig formindskelse i HCC827GR cellevækst (figur 7c, s 0,05, s 0,001 versus ikke-behandlede gruppe ). Endvidere behandling med siRNA targeting adenosin A2a-receptorer også produceret et signifikant fald i HCC827GR cellevækst (figur 7d: p 0,001 versus ikke-behandlede gruppe).

(a-i) Sekvensanalyse i HCC827GR celle. En enkelt nukleotidændring C T (EGFR exon 20) i DNA, som skaber en missense ændring i proteinsekvensen der erstatter en threonin med en methioninrest. (A-ii) HCC827GR celler blev inkuberet med gefitinib i 2 dage, og derefter cellelevedygtighed blev målt. (B) Øvre: repræsentant RT-PCR for mRNA’er af adenosin A2a-receptor (ADORA2a) og GAPDH, en intern standard, i hver celletype. Lavere: Intensiteten af ​​båndene blev bestemt semi-kvantitativt ved hjælp ImageJ. Værdierne for ADORA2a mRNA blev normaliseret med værdien for GAPDH mRNA. Dataene repræsenterer gennemsnittet med S.E.M. af 3 uafhængige prøver (*** p 0,001 vs. NHLF). (C) HCC827GR celler blev inkuberet i 7 dage med den selektive adenosin A2a-receptor-antagonist SCH-58.261 (10 nM-10 pM), og derefter cellelevedygtighed blev målt (* p 0,05, ** p 0,01 kontra ikke-behandlede gruppe). (D) Behandling med siRNA rettet mod adenosin A2a receptorer HCC827GR celler i 3 dage faldt betydeligt celle levedygtighed HCC827GR celler (*** p 0,001 vs. ikke-behandlede gruppe).

Diskussion

GPCR’er er traditionelt blevet associeret med mange af funktionerne af differentierede post-mitotiske celler. På den anden side er GPCR’er også udtrykkes i prolifererende celler og bidrager til embryogenese, vævsremodellering og reparation, inflammation, angiogenese, normal vækst og cancercelle.

Blandt dem, protease-aktiverede receptorer (Pars), chemokin receptorer og receptorer for bioaktive lipider, såsom LPA og sphingosin-1-phosphat (S1P) har været impliceret i afvigende celleproliferation i en lang række forskellige cancerceller. Endvidere neuropeptider såsom endothelin, bradykinin, neuromedin B, cholecystokinin og angiotensin II aktivere deres beslægtede GPCR’er til at stimulere celleproliferation i forskellige celletyper, og spiller en afgørende rolle i mange aggressive humane cancere, herunder småcellet lungecancer (SCLC), pancreascancer, hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC), og prostatacancer [18], [19]. Imidlertid har der været få rapporter om kritiske rolle GPCRs i gefitinib-resistente NSCLC celler, såsom H1975 celler. En bedre forståelse af den rolle GPCR’er i NSCLC kan komme fra flere analyser for gen-ekspression profilering. Microarray undersøgelser vil sandsynligvis være nyttige værktøjer til dette formål. Derfor udførte vi en GPCR microarray analyse for gefitinib-resistente H1975 celler sammenlignet med normale humane lunge fibroblastceller. Ved profilering af ekspressionen af ​​mRNA’er, der koder GPCR’er, fandt vi et stort antal GPCR’er overudtrykt i H1975-celler. Det er blevet erkendt, at mange GPCR’er der blev overudtrykt i forskellige kræfttyper fremmer væksten af ​​tumorceller, når de aktiveres ved at cirkulere eller lokalt producerede ligander. Blandt GPCR’ere blev GRP87 opført som den mest up-regulerede GPCR i nærværende GPCR array. Efter dette array, valideret vi opreguleret udtryk for GRP87 mRNA og dens protein ved hjælp af RT-PCR og western blotting, sammenlignet med dem, der observeres i NHLF celler. I H1975 celler, GS-, gi- og Gq-koblede GPCR’er blev overudtrykt til næsten samme omfang, mens nogle Gi-koblede GPCR’er blev nedreguleret i H1975 celler.

Aktiveringen af ​​A2a-receptorer er blevet rapporteret at føre til immunosuppressive virkninger, hvilket nedsætter antitumorale immunitet og dermed fremmer tumorvækst. I adfærdsmæssige undersøgelser er det blevet foreslået, at A2a-antagonister bør føjes til immunterapeutiske protokoller for kræft kan forbedre tumorimmunterapi. Disse forbindelser er allerede blevet vist at være sikker i forsøg med A2a-antagonister i behandling af Parkinsons sygdom [20]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om den specifikke agonister /antagonister, der virker på GPCR’er, som blev opreguleret eller ned-reguleret i H1975-celler kunne påvirke væksten af ​​H1975-celler. Blandt GPCR’er er anført, en selektiv antagonist af adenosin A2a-receptor, som var en af ​​de kommercielt tilgængelige ligander til GPCR’er overudtrykt i H1975-celler, producerede et dosisafhængigt fald i H1975 cellelevedygtighed. Svarende til antagonisten, behandling med siRNA målretning adenosin A2a receptorer produceret et signifikant fald i H1975 cellelevedygtighed. For yderligere at undersøge den rolle, adenosin A2a-receptorer i gefiitnib-resistens over for NSCLC, genereret vi en anden gefitinib-resistent klon ved at udsætte gefitinib af gefitinib følsomme NSCLC celler, HCC827 celler. Ligesom H1975 celler blev ekspression af adenosin A2a-receptor-mRNA dramatisk forøget i geftinib-resistente HCC827GR celler i forhold til HCC827 og NHLF celler. Under disse betingelser, behandling med enten den selektive adenosin A2a-receptor-antagonist eller siRNA targeting adenosin A2a receptorer produceret et signifikant fald i HCC827GR cellevækst. Disse resultater tyder på, at selv om yderligere

in vivo

undersøgelser er stadig behov, evnen til at forstyrre adenosin A2a receptorer kan give unikke muligheder for forebyggelse og behandling af NSCLC. På den anden side, selektive agonister til adenosin A2a-receptor, angiotensin II receptor-like 1, purinergisk receptor P2Y G-protein-koblet 2, prostaglandin I

2-receptor (IP), 5-hydroxytryptamin-receptor-2B og arginin vasopressin receptor 1A havde ingen virkning på H1975 cellelevedygtighed, som afspejler de komplekse funktioner af GPCR’er er udtrykt i disse celler. Mange af de ligander eller inhibitorer til GPCRs, der var op- eller nedreguleret i H1975 celler var ikke tilgængelig for denne undersøgelse. For eksempel er det opfattelsen, at GPR87, som var den største overudtrykte GPCR i H1975-celler, spiller en afgørende rolle i p53-afhængige overlevelse af cancerceller udsat for DNA-beskadigelse [21]. Den specifikke ligand og dens antagonist endnu ikke blevet identificeret. Da der ikke er nogen tvivl om, at GPCRs kan være centrale aktører i reguleringen af ​​forskellige patofysiologiske reaktioner, herunder kræft udvikling og progression, er det sandsynligt, at tilgange involverer interferens med RNA vil give os mulighed for bedre at forstå de specialiserede funktioner GPCRs udtrykt i gefitinib-resistent NSCLC-celler.

som konklusion har vi vist, at et stort antal GPCR’er opreguleret mens nogle blev nedreguleret via funktionelle krydstale mellem EGFR nedstrøms og GPCR transkription i udviklingen af ​​gefitinib-resistens i NSCLC.

Støtte Information

Figur S1.

Liste over GPCR gen symboler i microarray. TaqMan Array Menneskelig GPCR kort, som giver os mulighed for at kvantificere ekspressionen af ​​mRNA, der koder GPCRs fra 50 underfamilier (343 receptorer, ikke herunder lugtstof, olfaktoriske, gustatoriske og feromon-receptorer), blev anvendt

doi:. 10,1371 /journal.pone .0044368.s001

(PDF)

figur S2. Salg Virkninger af flere GPCR-agonister på væksten af ​​H1975 celler. H1975-celler blev inkuberet i 2 dage med hver GPCR-ligand (1, 10 uM) og MTT-assay blev derefter udført. Dataene cellelevedygtighed repræsenterer middelværdien med S.E.M. af 5 uafhængige stikprøver

doi:. 10,1371 /journal.pone.0044368.s002

(PDF)