PLoS ONE: Immunrespons over for Cancer Testikel Antigen Xage-1b i Non-småcellet lungecancer kaukasiske patienter

Abstrakt

Immunterapi tilgange bruger checkpoint blokade, alene eller i kombination med tumorantigen vaccination eller adoptiv celle transfer, dukker op som lovende tilgange til behandling af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Som forberedelse til kommende kombineret immunterapi tilgange i NSCLC, her har vi vurderet spontane immunrespons til Xage-1b, en tumor antigen af ​​Cancer Testikel Antigen gruppe, der tidligere er blevet rapporteret at være spontant immunogen i den japanske befolkning, i en kohorte af kaukasiske patienter med NSCLC. Vi fandt spontane serologiske reaktioner på Xage-1b i 9% af patienterne. Vigtigere, blev disse reaktioner begrænset til, og repræsenterede 13% af patienter med adenocarcinom tumorer, den hyppigste histologiske subtype, for hvilke immunterapi tilgange er under udvikling. Ved hjælp af et sæt af overlappende peptider, der spænder over hele Xage-1b protein, og til støtte for de serologiske data, vi har registreret betydelig Xage-1b specifikke CD4

+ T-celle responser i alle Xage-1b seropositive patienter og identificeret flere CD4

+ T-celleepitoper. Alt i alt, vores resultater støtter relevansen af ​​Xage-1b-antigen i kaukasiere NSCLC patienter med adenocarcinom, og gennemførelsen af ​​fremtidige immunterapi udnytter den høje immunogenicitet af antigenet i denne patientpopulation

Henvisning:. Saito K, Nakayama E, Valmori D (2016) Immunrespons over for Cancer Testikel Antigen Xage-1b i ikke-småcellet lungecancer kaukasiske patienter. PLoS ONE 11 (3): e0150623. doi: 10,1371 /journal.pone.0150623

Redaktør: Takuma Kato, Mie University Graduate School of Medicine, JAPAN

Modtaget: 11. december 2015; Accepteret: 17 februar 2016; Udgivet: 3 mar 2016

Copyright: © 2016 Saito et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Ludwig Institute for Cancer Research (USA), Cancer Research Institute (USA), Ligue contre le Cancer (Frankrig) og LABEX IGO (Frankrig) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 85% af alle tilfælde lungekræft [1]. Trods de seneste forbedringer i terapeutiske strategier, udgør NSCLC derfor et af de største problemer for folkesundheden. I de fleste tilfælde, symptomer normalt vises i en fremskreden fase af sygdommen, i metastatisk eller lokalt fremskredne stadier, hvilket gør behandlingen vanskelig [2]. Efter første diagnose, præcis stadieinddeling er afgørende for at bestemme en passende terapi. Kirurgisk resektion af tumoren er stadig standarden for pleje, men, desværre, det er relevant og kan betragtes som en sammenhængende og vellykket løsning for helbredelse, kun hos patienter med resektable tumorer og i stand til at tolerere resektion. Men omkring 70% af lungekræftpatienter til stede med lokalt avanceret eller metastatisk sygdom på tidspunktet for diagnosen [2]. For disse patienter, den første linje af behandlingen er platinbaseret kemoterapi, som har vist sig at være gavnligt for palliation og repræsenterer standarden for pleje. Strålebehandling er også ofte brugt som en første linje i behandling for NSCLC og administrationen af ​​samtidig kemoterapi og strålebehandling er indiceret til fase III lungekræft [2]. Men selv med disse behandlinger, de samlede overlevelse i NSCLC patienter er stadig dramatisk lav, med en gennemsnitlig 5-års overlevelse på 17% hos patienter med tidlig sygdom og 4% i patienter med metastatisk sygdom [3]. Derfor er der et presserende behov for at udvikle nye terapeutiske strategier til at fremkalde mere effektive kliniske respons og forlænge overlevelsen i denne patienter population. I det sidste årti har ny viden i cancer biologi åbnet nye potentielle terapeutiske tilgange, herunder målrettede behandlinger og immunoterapi. Målrettede behandlinger, såsom dem, der bruger angiogenese-hæmmere, kan epidermale vækstfaktor receptor hæmmere (EGFRi) eller tyrosinkinasehæmmere (TKI) kombineres til de vigtigste behandlingsmetoder hos patienter specifikke mutationer [4-6]. Imidlertid var andelen af ​​patienter som udtrykker disse mutationer er relativt lille (for eksempel kun 10-15% af NSCLC harbour EGFR mutationer). Derudover de kliniske virkninger af disse behandlinger er ofte ikke langtidsholdbare, som følge af udviklingen af ​​resistens [7,8].

På den anden side, immunterapeutiske strategier har potentiale til at styrke patientens immunrespons, at inducere stabile kliniske respons og forlænge overlevelsen [1]. Emerging immunterapeutiske strategier er dem, der bruger checkpoint blokade specifikke antistoffer, der har vist klinisk effekt i undergruppe af patienter. De seneste data tyder på, at disse responderende patienter er dem, der huser spontane immunreaktioner til autolog tumor. Andre immun baserede strategier i NSCLC omfatter kræft vaccination tilgange hjælp kræft /testis-antigener (CTA) [1,9], proteiner kodet af gener normalt udtrykkes i kimceller i testis og føtal ovarie- og, i nogle tilfælde, i placenta trofoblaster, stumme i normale voksne væv, men afvigende igen udtrykt i forskellige typer af kræft [10,11]. CTA er i vid udstrækning udtrykt i kræft i forskellige histologiske undertyper, er ofte meget immunogen og anses derfor blandt de mest attraktive mål for udviklingen af ​​cancer vacciner [11]. Kræft-vacciner som monoterapi er i øjeblikket under evaluering i NSCLC og kunne være effektiv hos patienter med minimal residual sygdom [9]. På trods af de første kliniske forsøg, der anvender denne type af strategi ikke har mødt deres kliniske endpoint [12], en kombination af vaccination med checkpoint blokade behandlingsformer er meget lovende [1]. Men anvendelsen af ​​disse strategier kræver identificering af tumorspecifikke antigener udtrykt af en betydelig del af NSCLC, samt af karakteristikaene af tumorer, der udtrykker dem,. Various CTA er blevet vist at blive udtrykt i NSCLC. Xage-1b er kodet af Xage-1-genet, der ligger i Xp11.22 region af X-kromosomet [13,14]. Fire udskrift varianter, Xage-1a til d, er blevet identificeret [14-16]. En transkript udtrykt i tumorer, Xage-1b, koder for et 81 aminosyrer langt protein [14,17]. Xage-1b blev rapporteret at være den fremherskende udskrift udtrykt i NSCLC. Xage-1b ekspression blev observeret i 45% af adenocarcinomer i japanske patienter [18]. Xage-1b viste sig at inducere antistof og T-celle responser i japanske NSCLC-patienter. Hyppigheden af ​​antistofrespons blev rapporteret at være højere i adenocarcinoma patienter (14%) end i SCC patienter (2%) [19]. Formålet med denne undersøgelse var at udvide disse resultater til den kaukasiske befolkning, at vurdere potentialet Xage-1b-baserede immunterapi hos kaukasiere.

Materialer og metoder

prøver Patienter og celle rensning

Perifere mononukleære blodceller (PBMC) prøver blev indsamlet fra en kohorte af 141 NSCLC patienter (Institut de Cancérologie de l’Ouest (ICO), Saint-Herblain, Frankrig), efter godkendelse af Institutional Review Board af ICO. PBMC fra 60 raske donorer blev opnået fra Etablissement Français du Sang (EFS) Pays de la Loire, efter godkendelse af Institutional Review Board af Etablissement Français du Sang Pays de la Loire (Nantes, Frankrig). En underskrevet informeret samtykkeerklæring blev opnået fra alle donorer, der deltager i undersøgelsen. Den kohorte omfattede 91 adenocarcinomer, 40 planocellulært karcinom (SCC) og 10 NSCLC tumorer i andre undertyper. PBMC blev isoleret ved densitetsgradientcentrifugering. CD4

+ og CD8

+ T-celler blev beriget fra PBMC ved magnetisk cellesortering hjælp mikroperler (MACS Cell adskillelse Technology, Miltenyi Biotec).

Proteiner og peptider

Serien af 17 16-mer Xage-1b overlappende peptider (OLP, tabel 1) blev syntetiseret på en Multiple Peptide Synthesizer, AMS422, ABINED ved Okayama University. Det rekombinante NY-ESO-1 protein blev produceret i

Escherichia coli

som tidligere [20] beskrevne. Den Xage-1b (GAGED2a) protein (81 aminosyrer langt) blev syntetiseret under anvendelse af et peptidsynteseapparat ved GL Biochemistry.

In vitro-stimulering af CD4

+ og CD8

+ T-celler

Oprenset CD4

+ og CD8

+ T-celler blev stimuleret med bestrålede autologe antigenpræsenterende celler (APC’er) i nærvær af en blanding af 17 16-mer overlappende peptider (OLP, 2 uM ) (tabel 1), der spænder over hele aminosyresekvensen af ​​Xage-1b protein, rhIL-2 (50 IU /ml) og rhIL-7 (10 ng /ml). Celler blev dyrket i 96-brønds dyrkningsplader ved 37 ° C (CO

2 5%) i Iscoves modificeret Dulbeccos medium (IMDM, Gibco) suppleret med 8% varmeinaktiveret humant serum (HS), GlutaMAX (Gibco), HEPES (Gibco), ikke-essentielle aminosyrer (MEM NEAA, Gibco), ciprofloxacin og penicillin /streptomycin.

Intracellulær cytokin farvning (ICS)

Efter

in vitro

stimulation CD4

+ og CD8

+ T-celler blev dyrket i 14 dage og derefter vurderet for Xage-1b specifikke T-celle responser. Kulturer blev opsamlet og stimuleret i nærvær eller i fravær af Xage-1b peptid pool (2 uM) og testet i et standard 4 hr intracellulær cytokin-farvning (ICS), med fluorescerende-konjugerede cytokin-specifikke antistoffer αCD4 (BD Biosciences), αCD8 (BD Biosciences), αIL-17A (eBioscience) og alFN-γ (BD Biosciences). Den cytokin udtryk profil blev derefter vurderet ved flowcytometri (FACSAria II, BD Biosciences).

IFN-γ capture assay og etablering af CD4

+ og CD8

+ T-celle-kloner

CD4

+ og CD8

+ T-cellelinier blev opsamlet og stimuleret i nærvær eller fravær af Xage-1b peptid pool (2 uM). Stimulerede prøver blev inkuberet med en bi-specifik CD45 og IFN-γ antistof (IFN-γ catch reagens, Miltenyi Biotec) og inkuberet i 5 minutter på is. Celler blev derefter anbragt på en langsom roterende indretning (Miltenyi Biotec) i 45 minutter ved 37 ° C, for at tillade cytokinsekretion. Efter denne periode blev cellerne vasket i kold buffer og inkuberet med APC-konjugeret IFN-γ påvisningsreagens (Miltenyi Biotec), i 15 minutter på is, i nærvær af αCD4 (FITC-konjugeret) cytokin-specifikt antistof. Celler blev yderligere vasket med kold buffer og analyseret ved FACS. CD4

+ T-celler, secernerede IFN-γ specifikt i respons på Xage-1b peptid pool blev sorteret ved flowcytometri celle, ved anvendelse af en FACSAria II. Det isolerede CD4

+ IFN-γ producerende T-celler blev klonet under betingelser med begrænsende fortynding, i plader med 96 brønde, ved stimulering med phytohæmagglutinin (PHA-L, 1 ug /ml) i nærvær af bestrålede allogene PBMC og EBV celle linjer (EBV-HV, EBV-LAZ) og rhIL-2 (150 IE /ml). CD4

+ T-celle kloner blev opretholdt i IMDM suppleret med 8% HS af re-stimulation hver 2-3 uger.

Vurdering af serologiske reaktioner

serologisk respons blev vurderet ved ELISA, anvendelse af 96-brønds plader coatet med Xage-1b protein (2 ug /ml) eller NY-ESO-1 protein (1 ug /ml) natten over ved 4 ° C. Sera blev vurderet i en række fortyndinger fra 1/100 til 1 /100.000. Antistoftitere blev beregnet som serumfortynding svarende til 50% af den maksimale optiske densitet respons.

Vurdering af IFN-γ-produktion ved ELISA

For at vurdere antigenspecifik IFN-γ produktion, XAGE- 1b specifikke kloner blev stimuleret i nærvær eller i fravær af peptidet pool (50 × 10

3 per brønd, i 96-brønds rundbundede dyrkningsplader). IFN-γ blev målt ved ELISA i 24 timer kultursupernatanter under anvendelse Nunc Maxisorp fladbundet 96-brønds plader. For den fine specificitet assay celler (50 × 10

3 pr brønd) blev stimuleret i nærvær eller i fravær af Xage-1b enkelt peptider (300 uM), og IFN-γ-koncentrationen blev målt som ovenfor. For antistoffet blokerende eksperimenter, αDP (1 ug /ml), αDQ (1 ug /ml), αDR (1 ug /ml) og αDR52b (ascites, 1:10 fortynding) antistoffer blev tilsat til assayet kultur. HLA-DR begrænser alleler blev tilsvarende vurderet af IFN-y ELISA, under anvendelse af molekylært definerede APC. LDR1, venligst stillet til rådighed af Dr. Hassan M. Zarour (University of Pittsburgh, USA), blev opretholdt i komplet RPMI-medium og kontrolleres for HLA-DR ekspression. EBV149 og EBV156, (Epstein-Barr virus transformerede lymfoblastoide cellelinjer) blev afledt fra patienter, der udtrykker HLA-DRB1 * 13.

Resultater

Serologiske responser på Xage-1b og NY-ESO-1 i NSCLC patienter

Vi screenede en kohorte af 141 NSCLC patienter til serologiske reaktioner på Xage-1b og NY-ESO-1, som intern kontrol, ved ELISA. Resultaterne af screeningen er opsummeret i figur 1. Vi vurderede først sera fra patienter sammen med de 60 raske donorer ved en fortynding på 1: 100. Vi har registreret signifikante serologiske reaktioner på Xage-1b hos 12 patienter (Fig 1A). I modsætning hertil påvistes antistofresponser mod NY-ESO-1 hos 9 patienter. Vi vurderede derefter sera fra 12 Xage-1b seropositive patienter i en titreringskurve og beregnet antistoftiteren, defineret som den serumfortynding, der giver 50% af det maksimale respons. De opnåede titere varierede blandt de seropositive patienter og varierede fra 1: 250 til 1:. 40000 (Fig 1B)

(A) Sammendrag af ELISA for de 141 NSCLC-patienter og 60 raske donorer (HD). Den optiske densitet (OD) cut-off mellem respondenter og ikke-respondenter blev bestemt som den gennemsnitlige OD opnået med sera fra 60 HD + 5 standardafvigelser (SD) (stiplet linje). (B) Sera titrering fra 12 Xage-1b seropositive patienter og fra 1 HD blev udført i en række fortyndinger, fra 1/100 til 1 /100.000. Antistoftitre blev bestemt som den serumfortynding, der svarer til 50% af den maksimal OD respons.

I kohorten, 91 tumorer var adenocarcinomer, 40 var pladecellecarcinomer (SCC) og 10 tilhørte andre undertyper . Xage-1b seropositive patienter blev udelukkende fundet i adenocarcinom undergruppe, og repræsenterede 13% af undergruppe (tabel 2). I modsætning hertil NY-ESO-1 seropositive patienter tilhørte hovedsagelig til SCC undergruppe, og repræsenterede 13% af undergruppen mens kun 3% af adenocarcinom patienter havde betydelige serologiske reaktioner på NY-ESO-1 (tabel 2). Vi bekræftede således, at Xage-1b er spontant immunogent i NSCLC, mest i adenocarcinomer, og viste, at dette er tilfældet, ikke kun i den japanske befolkning som tidligere beskrevet, men også i kaukasere. Korrelationen mellem serologisk respons på Xage-1b og adenocarcinom histologisk subtype nåede statistisk signifikans (Fishers eksakte test, P = 0,0176). I modsætning hertil vores resultater viser, at antistofresponser på NY-ESO-1 er hyppigere i SCC patienter med data tæt på, men endnu ikke nå statistisk signifikans (Fishers eksakte test, P = 0,0563). Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data, seropositivitet af NY-ESO-1 blev observeret i 29% og 15% af SCC og adenocarcinom patienterne [21].

Vurdering af Xage-1b -specifik CD4

+ og CD8

+ T-cellereaktioner

Baseret på resultaterne af den serologiske screening, vi vurderede de 12-antistof responderpatienter for CD4

+ og CD8

+ T-celle responser på Xage-1b. Til dette formål har vi beriget CD4

+ og CD8

+ T-celler fra PBMC af patienterne ved magnetisk cellesortering og stimuleret dem i nærvær af en pulje af 17 16-mer overlappende peptider, der spænder over hele 81 amino -sekvens af Xage-1b protein (tabel 1) og dyrket dem i 14 dage i nærvær af bestrålede autologe APC, rhIL-2 og rhIL-7. Ved afslutningen af ​​dyrkningsperioden, vi stimulerede portioner af kulturer afledt fra hver patient i fravær eller i nærvær af Xage-1b peptid pool og vurderet reagere på Xage-1b i en 4 hr standard intracellulær cytokin-farvning assay under anvendelse af antistoffer specifik for IFN-γ og IL-17. Vi analyserede prøverne ved flowcytometri (fig 2A og 2C) og sammenlignede andelen af ​​IFN-γ producerende celler opnået for hver kultur i forhold til sin egen basislinje respons (i fravær af peptider) for at bekræfte antigen-specifikt respons. CD4

+ T-celle responser blev betragtet som signifikante, når andelen af ​​CD4

+ T-celler, der producerer IFN-γ i nærvær af peptidet puljen var mindst 3 gange højere end ved baseline. På baggrund af disse kriterier, vi har registreret betydelige CD4

+ T-celle responser på Xage-1b i alle seropositive patienter (Fig 2B), I modsætning hertil kun i tilfælde af en patient, vi registreret en Xage-1b specifikke CD8

+ T-celle respons (fig 2D). Vi har imidlertid ikke påvise specifikke produktion af IL-17 som respons på Xage-1b for nogen af ​​kulturerne.

(A, C) Tilstedeværelsen Xage-1b specifikke CD4

+ (A) og CD8

+ (C) T celle responser blev vurderet i peptid pool stimulerede kulturer ved intracellulær cytokin-farvning, med cytokin specifikke antistoffer aIFN-γ og αIL-17, efter stimulering i fravær eller nærvær af det Xage-1b-peptid pool. Procentdelene af IFN-y-producerende celler er vist i øverste venstre kvadranter af hver punktdiagram, som viser øget IFN-γ-produktion i peptid stimulerede prøver. De viste data er et eksempel på en CD4

+ og CD8

+ T-celle responder patient. (B, D) Sammenfatning af CD4

+ og CD8

+ T celle responser er vist for alle de 12 seropositive patienter. Som vist i (B), der registreres CD4

+ svar for alle seropositive patienter, mens en betydelig CD8

+ respons blev kun identificeret i en patient, NA703 (D). Værdier mindst 3 gange højere end baseline (ingen peptid) blev anset for signifikante.

Generation af CD4

+ T-celle-kloner, vurdering af det aktive peptider og HLA begrænsning

Vi isolerede Xage-1b reaktive CD4

+ T-celler fra en af ​​de Xage-1b seropositive patienter, NA555, ved at berige den del af celler, som secernerede IFN-γ specifikt i respons på Xage-1b peptid pool ved Miltenyi IFN-γ capture assay (fig 3A). At opnå specifikke kloner, dyrkede vi de isolerede celler under betingelser med begrænsende fortynding, ekspanderet dem og derefter bedømt dem i fravær eller i nærvær af Xage-1b peptid pool (Fig 3B). Vi opnåede 14 Xage-1b specifik CD4

+ T-celle-kloner, som vi karakteriseret for deres fine specificitet ved at vurdere reaktivitet mod de 17 overlappende enkelte peptider der udgør Xage-1b peptid pool. Vi oprindeligt testede de enkelte peptider i subpuljer af 3 peptider hver og konstateret, at de reaktive peptider blev lokaliseret i de første 2 subpuljer herunder peptider C1-C3 og C4-C6 (tabel 1). Vi vurderede derefter svaret på de enkelte peptider, der indgår i disse regioner. Fig 3C (venstre panel) viser et eksempel på denne analyse for en Xage-1b reaktive CD4

+ T-celle-klon (klon A8C7), som genkendte peptid C3. Et resumé af den fine specificitet vurdering af 14 CD4

+ T-celle-kloner er vist i figur 3C (højre panel). 10/14 kloner var reaktive til peptid C3, 1 klon anerkendte peptider C3 og C4, en klon anerkendt peptid C4, og 2 kloner anerkendt peptid C5. Alt i alt fandt vi 4 forskellige fine forhold. Baseret på denne reaktivitet, vi bestemt MHC klasse II-molekyler, der begrænser antigen genkendelse af enkelte kloner er repræsentative for de 4 fine forhold. Til dette formål vurderede vi antigengenkendelse i nærvær af αDP, αDQ, αDR og αDR52b specifikke antistoffer, i forbindelse med et IFN-γ-sekretion assay, hvis hver klon blev testet i nærvær eller i fravær af den reaktive peptid. Fig 4A viser et eksempel på en MHC klasse II-restriktion assay udført med CD4 T-celle-klon B2F8, som har anerkendt peptid C3. Som vist, vi konstateret, at antigen anerkendelse fra klon specifikt blev hæmmet af αDR antistof, mens ingen hæmning blev påvist med αDP og αDQ blokerende antistoffer, hvilket indikerer, at denne klon blev begrænset af HLA-DR. Lignende resultater blev opnået for de andre kloner. Vi derefter til formål at identificere de HLA-DR begrænser allel. HLA-DR molekylær typning viste, at NA555 udtrykte DRB1 * 01 og DRB1 * 13 alleler. At afgøre, hvilke af disse molekyler var den begrænsning allel, vi stimulerede CD4

+ T-cellekloner i nærværelse af LDR1 celler (musefibroblaster transficeret med HLA-DR1) eller EBV-transformerede B-cellelinier (EBV 149, EBV 156) udtrykker DR13 allel. Vi pre-inkuberes APC med de reaktive peptider og vurderet deres evne til at præsentere den tilsvarende Xage-1b peptid til CD4 T-celle-kloner. Responser blev bestemt ved at måle mængden af ​​IFN-γ i 24-timers kultursupernatanter ved ELISA. For alle kloner, vi har registreret peptid anerkendelse i nærvær af EBV-B cellelinier (EBV 149, EBV 156), der udtrykker DRB1 * 13, men ikke i nærvær af LDR1 celler (Fig 4B).

(A ) Xage-1b specifikke CD4

+ T-celler blev isoleret ved IFN-γ capture assay. Numre angivet i det øverste højre område af dot plots viser de procentdele af IFN-γ-producerende celler blandt CD4

+ T-celler, efter stimulering i fravær eller i nærvær af peptidet pool. IFN-y-producerende celler blev sorteret og klonet under betingelser med begrænsende fortynding. (B) CD4

+ T-celle-kloner blev opnået og screenet for at vurdere reaktiviteten til Xage-1b. Kloner blev stimuleret i nærvær eller fravær af peptid pool og specificitet til Xage-1b blev bestemt ved ELISA. Responser blev betragtet som signifikante, når mængden af ​​IFN-γ detekteret i nærvær af peptid var mindst 3 gange højere end den detekteret i fravær af peptid. (C) Alikvoter Xage-1b specifikke CD4

+ T-cellekloner blev stimuleret i fravær eller nærvær af peptidet pool eller individuelle enkelt peptider og mængden af ​​IFN-γ blev målt i 24-timers kultursupernatanter ved ELISA. (D) Reaktivitet til Xage-1b enkelt peptider blev vurderet i 14 kloner og 4 fine særtræk blev identificeret.

(A) Identifikation af MHC II begrænser molekyler. Det venstre panel viser et eksempel på en HLA-II begrænsning assay klon, B2F8. Peptid genkendelse blev vurderet ved ELISA, inkubere Xage-1b specifikke CD4

+ T-cellekloner udviser hver af de 4 fine specificiteter enten i fravær eller i nærvær af αDP, αDQ, αDR og αDR52b specifikke antistoffer. Peptid anerkendelse var begrænset af HLA-DR i alle tilfælde, som opsummeret i B. HLA-DR begrænser allel blev identificeret ved inkubering Xage-1b specifikke CD4

+ T-celle-kloner med forskellige APC herunder utransficerede (3T3) eller DR1 transficerede muse fibroblast (LDR1) og DR13-udtrykkende EBV-cellelinier (EBV149, EBV 156). Hver APC blev præinkuberet med de reaktive peptider og begrænse allel blev bestemt ved at vurdere deres evne til at præsentere peptiderne til den tilsvarende CD4

+ T-celle-kloner. Peptid genkendelse blev vurderet ved måling af IFN-γ-sekretion i kultursupernatanter, i nærvær af hver APC. Som opsummeret, fandt vi, at peptid anerkendelse var begrænset af HLA-DR13 i alle tilfælde.

Diskussion

I denne undersøgelse undersøgte vi spontan antistof og T-celle responser til CTA Xage -1b i en kohorte af 141 kaukasisk NSCLC patienter. Vores resultater viser, at serologiske reaktioner på Xage-1b i høj grad er begrænset til adenocarcinomer som de findes i omkring 13% af dem, men er ikke påvist i SCC. Under hensyntagen til at Xage-1b er blevet rapporteret at blive udtrykt i ca. 45% af adenocarcinomer [18] (men kun 7% af SCC), serologisk respons synes temmelig hyppige i denne gruppe patienter, blev fundet i omkring en tredjedel af dem . Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere offentliggjorte data i den japanske befolkning, rapportering serologiske reaktioner på Xage-1b i 14% af adenokarcinomer men kun 2% af SCC patienter [19]. Vores data viser også, at serologiske reaktioner på NY-ESO-1 er i stedet mere hyppige i SCC end i adenocarcinom, som de findes i 13% af SCC, men kun i 3% af adenokarcinomer fra kaukasiere. Igen dette er i overensstemmelse med resultater fra tidligere undersøgelser, der har rapporteret hyppigere spontane serologiske reaktioner på NY-ESO-1 i SCC end i adenocarcinom [21]. Svarende til NY-ESO-1, har vi for nylig rapporteret, at MAGE-A-antigen, der også hører til CTA gruppen, blev mere ofte udtrykt i SCC, sammenlignet med adenocarcinom [22]. Sammen vores resultater bekræfter Xage-1b immunogenicitet i lunge adenocarcinom, fremhæver betydningen af ​​dette CTA som et lovende mål for immunterapi mod denne tumor undertype.

I vores undersøgelse, vi har registreret betydelig Xage-1b-specifikke CD4

+ T celle responser i alle seropositive patienter, igen i overensstemmelse med tidligere data i den japanske befolkning [19]. Vi har etableret klonpopulationer fra en høj responder, bestemt, at reaktiviteten af ​​klonerne var mod sekvenser lokaliseret i peptider C3-C5, der svarer til 9-32 aminosyrer område af proteinet, og identificeret 4 fine særlige forhold antigengenkendelse. Vi viste, at der for alle fine særlige, blev peptid anerkendelse begrænset af HLA-DR. Ved at vurdere antigen præsentation ved hjælp af APC, der deler enkelt HLA-DR alleler med dem af patienten, bestemt vi, at antigen genkendelse af kloner begrænset af DRB1 * 13-allelen. Det er bemærkelsesværdigt, at mens andre Xage-1b MHC klasse II epitoper begrænset af andre alleler er blevet rapporteret [19,23,24], DRB1 * 13 begrænset epitop beskrevet her er ikke tidligere rapporteret.

Nogle af vores resultater er i modstrid med dem rapporteret i litteraturen [19,25]. På den ene side, både i vores undersøgelse og i tidligere undersøgelser i litteraturen [19] Xage-1b specifik CD4

+ T-celler reaktioner blev påvist i næsten alle NSCLC Xage-1b seropositive patienter. Men i modstrid med resultaterne af en nylig rapporteret undersøgelse [25] I vores undersøgelse Xage-1b specifikke CD4

+ T-celler producerede IFN-γ men ikke IL-17, og således udviste en klar Th1-profil. Derudover har vi opdaget en signifikant CD8

+ T-celle respons i kun én af de 12 seropositive patienter, som er meget mindre hyppig end frekvensen af ​​6/9 seropositive patienter, der tidligere er rapporteret i den japanske kohorte [19]. Denne uoverensstemmelse kan i det mindste delvist forklares ved de forskellige metoder, der anvendes, der væsentligt kan afvige med hensyn til sensitivitet og specificitet for detektion. Faktisk, mens vi vurderede CD8

+ T-celle responser i en 4 hr standard intracellulær cytokin farvning (ICS) assay, i japansk undersøgelse, CD8

+ T-celle responser på Xage-1b blev vurderet ved IFN-γ-sekretion capture assay [19]. Således enten hyppigheden Xage-1b specifikke CD8

+ T celle responser i seropositive patienter har været undervurderet i vores undersøgelse, på grund af den lavere følsomhed af den anvendte metode, eller overvurderet i undersøgelsen fra Ohue Y et al. på grund af den lavere specificitet af IFN-γ indfangningsassay, to hypoteser, der ikke udelukker hinanden. Men til fordel for en overvurdering af antallet af ægte Xage-1b CD8

+ T-celle-reaktioner i japansk undersøgelse, er det faktum, at IFN-γ sekretionsniveauer opnået i denne undersøgelse i størstedelen af ​​CD8

+ T cellekulturer upon stimulation med Xage-1b-peptider var meget lav, tæt på baggrundsniveauer [19].

Som konklusion, helt, vores resultater støtter relevansen af ​​Xage-1b-antigen i kaukasiske patienter med lunge adenocarcinom og tilskynde til gennemførelse af fremtidige immunterapi udnytter den høje immunogen af ​​dette antigen i denne patienternes befolkning.

Desuden er det bemærkelsesværdigt, at fordi udtrykket XAGE1b er kendt for at være reguleret af DNA methylering, DNA methyltransferase-inhibitorer kunne øge den potentielle patientpopulation berettiget til Xage-1b rettet immunterapier, som tidligere rapporteret i tilfældet af NY-ESO-1 [26]. At udforske denne mulighed kunne være genstand for fremtidige undersøgelser.