PLoS ONE: Notch1 Pathway Aktivitet Bestemmer Regulatory rolle Cancer-associerede fibroblaster i melanom Vækst og Invasion

Abstrakt

cancerassocierede fibroblaster (CAF) spiller en afgørende rolle i regulering cancer progression, men den molekylære determinant, som regulerer tumoren regulerende rolle af CAF fortsat ukendt. Ved hjælp af en mus melanom model, hvor exogene melanomceller blev podet på huden af ​​to linjer af mus, hvor den genetiske aktivering eller inaktivering af Notch1 signalering specifikt forekommer i naturlige vært stromale fibroblaster, demonstrerede vi, at Notch1 pathway aktivitet kunne bestemme tumorfremmende eller tumor-undertrykke fænotype i CAF. CAF transporterer forhøjet Notch1 aktivitet betydeligt hæmmet melanom vækst og invasion, mens dem med en null Notch1 forfremmet melanom invasion. Disse resultater identificerer Notch1 vej som en molekylær determinant, der styrer regulerende rolle CAF i melanom vækst hud og invasion, afslører Notch1 signalering som et potentielt terapeutisk mål for modermærkekræft og potentielt andre solide tumorer

Henvisning:. Shao H , Kong R, Ferrari ML, Radtke F, Capobianco AJ, Liu ZJ (2015) Notch1 Pathway Aktivitet Bestemmer Regulatory rolle Cancer-associerede fibroblaster i melanom vækst og invasion. PLoS ONE 10 (11): e0142815. doi: 10,1371 /journal.pone.0142815

Redaktør: Claudia Daniela Andl, Vanderbilt University, UNITED STATES

Modtaget: August 18, 2015; Accepteret: 27 oktober 2015; Udgivet: November 12, 2015

Copyright: © 2015 Shao et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Bankhead-Coley Cancer Research Program (Award # 09BN-11), Kvinders Cancer Association og interne midler fra University of Miami til Z .. Liu

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

CAF er stromale fibroblaster bosiddende i og i nærheden af ​​tumoren masse. De er primært afledt fra aktiverede lokale hvilende fibroblaster og rekrutterede cirkulerende knoglemarv mesenchymstamceller (MSC) [1,2]. CAF er involveret i regulering tumorudvikling ved at fremkalde opløselige faktorer, ekstracellulær matrix (ECM) [3] og exosomer [4]. Deres bidrag til primære og sekundære maligne lidelser [5,6] samt at deltage i lægemiddelresistens og tumor tilbagefald [7,8] gøre CAF potentielle mål for terapeutiske interventioner på tumor mikromiljø (TME). Trods omfattende dokumentation for den afgørende tumor-regulerende rolle CAF, hvordan rollen bestemmes forbliver et mysterium. Vi og andre tidligere observeret, at Notch1 pathway aktivitet er omvendt korreleret med den af ​​fibroblaster. Notch pathway aktivitet er lav i prolifererende fibroblaster, mens høj i hvilende fibroblaster [9]. Tab af

Notch1

i muse embryonale fibroblaster (MEF) resulterede i hurtigere vækst og motilitet celle sats, mens Notch1 aktivering retarderet cellevækst og motilitet af humane fibroblaster [9]. Konsekvent, Notch aktivering induceret celle-cyklus anholdelse og apoptose i MEF [10]. I tumor xenograft musemodeller, co-implanteres eksperimentelle humane dermale fibroblaster transporterer høj Notch1 aktivitet inhiberede melanom vækst og angiogenese [11], hvilket viser, at Notch1 aktivering giver en tumor-undertrykkende fænotype på eksperimentel CAF. Disse resultater foreslog en afgørende rolle for Notch signalering i styrende funktion af fibroblaster. Men de undersøgte i disse tidligere undersøgelser fibroblaster er ikke rigtige eller naturlige CAF. Her udnyttede vi nye musemodeller at udforske rolle Notch1 signalering ved fastsættelsen af ​​den regulerende rolle af naturlige vært CAF i melanom vækst og invasion.

Materialer og metoder

Mus

Notch1

loxP /loxP

mus blev beskrevet [12].

ROSA

LSL-N1IC + /+ Hotel (# 008.159) og

Fsp1

.

Cre

+/- Hotel (# 012.641) mus blev købt fra The Jackson Lab (Bar Harbor, ME). Alle disse mus har en C57BL6 baggrund. Den Gain-Of-Function Notch1 (GOF

Notch1:.

Fsp1

Cre

+/-

;

ROSA

LSL-N1IC + /+

) og tab af funktion Notch1 (LOF

Notch1:.

Fsp1

Cre

+ /-

;

Notch1

LoxP /LoxP + /+) linjer blev genereret ved at krydse

ROSA

LSL-N1IC + /+

Notch1

loxP /loxP + /+

med

Fsp1

.

Cre

+/-

mus, og efterfølgende krydser

Fsp1

Cre

+/-

;.

ROSA

LSL-N1IC +/-

med

ROSA

LSL-N1IC + /+

mus og

Fsp1

.

Cre

+/-

;

Notch1

loxP /loxP +/- med

Notch1

loxP /loxP + /+

mus hhv. GOF

ctrl (

FSP1

Cre

– /-

;. ROSA

LSL-N1IC + /+) og LOF

ctrl (

FSP1

Cre

– /-

;. Notch1

LoxP /LoxP + /+ ) mus blev anvendt som kontrol. Mus blev holdt ved DVR dyrefaciliteter under standardbetingelser. Mus blev bedøvet for alle kirurgiske procedurer ved ketamin /xylazin blanding (100/10 mg /kg, IP), og billeddiagnostiske procedurer ved at indånde 3% isofluran gas, og ofret i CO2 kammer. Institutionel dyr pleje og bruge udvalg ved University of Miami godkendt alle dyreforsøg.

Mus hud model af modermærkekræft

Murine melanomaceller, B16-F10 (ATCC

®, CRL-67.345

TM), stabilt transduceret med Luciferase 2 (Luc2) /lentivirus, blev dyrket med komplet DMEM. For tumor graft eksperimenter, 5 x 10

5 Luc2

+ /B16-F10 celler suspenderet i 0,1 ml saltvand blev podet (

s

.

c

.

)

på dorsale hud af 6 uger gamle GOF

Notch1 vs. GOF

ctrl og 8 uger gamle LOF

Notch1 vs. LOF

Ctrl mus. B-16-F10 er afledt af C57BL6 mus og kan være xenotransplanteret på de oprettede GOF, LOF og kontrolmus, der har en C57BL6 baggrund. Musene blev aflivet ved uge 3 efter podning. Operativt fjernede tumorer blev vejet. Melanom vækst blev vurderet på grundlag af tumor vægt og positivitet af Ki67 celledeling markør målt ved immunofluorescens i tumorceller, mens melanom lokal invasion blev evalueret ved histologisk vurdering af vævssnit af reseceret melanom.

Histologi, Immunofluorescens (IF) Western blot

H 0,05

Resultater

Notch1 aktivering i CAF undertrykker melanom vækst

Angivelse af fibroblast-specifikt protein. -1 (FSP1, også kaldet S100A4) er generelt begrænset til fibroblaster [14,15].

FSP1

.

Cre

mus blev med succes anvendt til at skabe null alleler i fibroblaster for TGF type II-receptorer [16], EP4 receptorer [17], og PTEN [18]. Vi skabte en

st par GOF

Notch1 vs GOF

Ctrl mus. GOF

Notch1 mus levedygtige indtil ansat i melanom hud graft eksperimenter inden for to måneder. Deres krop udseende og hud væv histologi, herunder dermis, hvor huden fibroblaster primært bor, dukkede normal (S1A Fig).

For at undersøge, hvilken rolle CAF med høj Notch1 aktivitet i regulering melanom vækst, 5 x 10

5 Luc2 + /B16-F10 celler blev podet på huden af ​​GOF

Notch1 vs GOF

Ctrl mus. I denne model er de cellulære bestanddele af hele tumoren stroma, herunder CAF, sammensat af naturlige værtsceller. Tumor metastaser blev overvåget af hele kroppen IVIS scanning i uge 3 indlæg tumor vaccinationer. Hud tumorer blev resektion, vægtet og underkastet immunhistokemisk analyse efter IVIS scanning.

Hvis farvning af huden sektioner portrætteret begrænset og forhøjet udtryk for N1

IC i kerner af FSP1

+ fibroblaster af GOF

Notch1 mus sammenlignet med GOF

ctrl mus (fig 1A), men ikke i tilstødende hud muskelceller (især muskelceller præsenteret autofluorescens endnu ingen nukleare signaler var detekterbare). Tilsvarende blev Hey1 udtryk forøget i kerner af FSP1

+ hudfibroblastre af GOF

Notch1 mus i forhold til GOF

ctrl mus (S1B Fig). Desuden udtryk for transgen-kodet mutant N1

IC protein (muN1

IC: PEST-domæne-trunkeret N1

IC, 59 Kd, (

ROSA

LSL -N1IC + /+

, The Jackson Lab: # 008.159)) i huden på GOF

Notch1 mus blev bekræftet ved Western blotting (fig 1B). Disse resultater viste effektive Cre-medieret specifikt udtryk for N1

IC og Notch pathway aktivering i huden fibroblaster.

A. Repræsentative billeder viser udtryk for N1

IC i kerner (pilespidser pegede) af FSP1

+ hudfibroblastre af GOF

Notch1 vs GOF

Ctrl mus. B. Ekspression af transgen-kodet muN1

IC (59 Kd) i huden på GOF

Notch1 mus blev påvist ved Western blotting. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. C. melanom vækst hæmmes i GOF

Notch1 mus (n = 8 /gruppe). Fem repræsentative billeder af resekteres tumorer /gruppe vises. D. Væsentligt mindre Ki67

+ tumorceller (Luc2

+) pr HPF i melanom fra GOF

Notch1 end GOF

ctrl mus. E. proliferative aktivitet af melanom celler (Ki67

+) er særlig lav i området (markeret) støder op til CAF (FSP1

+) i GOF

Notch1 mus. Kvantificering er tæller fra 5 HPF pr sektion og fem afsnit /tumor. Data blev statistisk analyseret ved hjælp af to-sidede Students

t

-test og udtrykt som gennemsnit ± SD.

melanom vækst i GOF

Notch1 mus var signifikant retarderet i forhold som i GOF

ctrl mus (fig 1C). Konsekvent, der var væsentligt mindre Ki67

+ tumorceller (Luc2

+) i melanom væv fra GOF

Notch1 end fra GOF

ctrl mus (Fig 1D). Proliferative aktivitet (Ki67 positivitet) af melanomceller var særlig svagere når tilstødende til CAF (Fig 1E), hvilket antyder, at CAF transporterer høj Notch1 aktivitet i GOF

Notch1 mus kan frigive tumor undertrykkende faktor (er). Disse resultater viste, at Notch1 aktivering giver en tumor-undertrykkende fænotype på CAF.

Notch1 aktivering i CAF undertrykker melanom invasion

Siden sprede melanom celler skal interagere med fibroblaster placeret i huden dermis (og i omegnen af ​​indpodet melanom), kan fibroblaster have en betydelig indvirkning på formidling melanom. Vi yderligere undersøgte effekten af ​​CAF på melanom invasion og metastase i GOF

Notch1 mus. Melanom lokal invasion blev evalueret ved histologisk vurdering af vævssnit af reseceret melanom. H 2C). Disse data indikerer, at CAF i GOF

Notch1 mus er mindre gunstigt for modermærkekræft invasion.

A.

Venstre

: nedsat tumor invasion i GOF

Notch1 sammenlignet med GOF

ctrl mus.

Right

: to repræsentant H E billeder af tumor sektioner (n = 8 /gruppe). Punkterede linjer angiver tumor grænser. Pile peger på invaderende tumorceller. Procentdel af invasion er baseret på resultaterne af H E billeder af tumor sektioner pr gruppe vises. Punkterede linjer angiver tumor grænser. Pile peger på invaderende tumorceller. Procentdel af invasion er baseret på resultaterne af H & E farvning i LPF af hver tumor sektion. B. Null Notch1 CAF, som omgiver tumorer udviser højere proliferative aktivitet som mere Ki67

+ /FSP1

+ celler kan påvises i LOF

Notch1 end i LOF

ctrl mus. C. Kvantificering af Ki67

+ fibroblaster /HPF i melanom kapsel LOF

Notch1 (sort bjælke) vs. LOF

Ctrl (hvid bar) mus. Kvantificering er tæller fra 5 HPF pr sektion og fem afsnit /tumor. Data blev statistisk analyseret ved hjælp af to-sidede Students

t

-test og udtrykt som gennemsnit ± SD.

Diskussion

Podning B16-F10 celler på huden af GOF

Notch1 og LOF

Notch1 mus tilbyder unikke syngene murine melanom modeller til dechifrering rolle Notch1 signalering i styrende tumor-regulerende funktion af CAF i TME hvor hele cellulære bestanddele af tumor stroma er sammensat af naturlige værtsceller . Vores resultater defineret Notch1 signalering som en molekylær kontakt, der styrer tumor-regulerende funktion af CAF. Drejning denne molekylære kontakt ON og OFF kan omvendt give tumor-undertrykkende og tumorfremmende ejendomme i CAF. Således kan Notch signalering manipuleres til at gennemføre Notch signalering-rettet terapi for melanom, og potentielt andre faste tumorer. Den åbner således en ny vej til at målrette TME ved enten reprograming og konvertere CAF fra “tumor initiativtagere« til »tumorsuppressorer ‘gennem terapeutisk aktivering af Notch1 vej eller direkte at udnytte Notch nedstrøms mediator (r), dvs. WISP1 [11]. Selv om der er mange muligheder for aktivering af Notch1 vej i CAF, såsom at bruge genterapi tilgang eller en ny genom redigeringsmetode, CRISPR /Cas9 eller CRISPR /Cpf1 at indføre

N1

IC

eller anvende Notch vej aktiverende forbindelse, som kan identificeres ved hjælp af en lignende høj-throughput screening metode [20], aktivering Notch1 signalering specifikt i CAF, mens ikke samtidig øger Notch aktivitet i melanomaceller, udgør en terapeutisk udfordring, som den biologiske funktion af Notch signalering er celle kontekstafhængig [21], og høj Notch aktivitet er onkogen til melanom [13]. Det er uklart, hvordan Notch signalering er differentielt reguleret i CAF og melanomceller i samme mikromiljø. Det er også stadig uklart, om Notch /ligander deltager i celle-celle-kommunikation mellem fibroblaster-melanomceller. Idet en væsentlig del af CAF i tumorvæv er afledt af mesenchymale stamceller (MSC), en alternativ strategi er at udvikle cellebaserede behandlingsformer ved målrettet indgivelse af terapeutiske celler, dvs. autologe MSC-afledte fibroblaster præfabrikerede “

ex vivo

’til enten bære høj Notch1 aktivitet ved hjælp af metoder, der er beskrevet ovenfor, eller overekspression WISP1, i tumorvæv. Fibroblaster udtrykker høj Notch aktivitet har tendens til at undergå cellecyklusstandsning [9,10]. Denne figur gør MSCD-SF transporterer høj Notch aktivitet mere tiltrækkende som terapeutiske celler, fordi de ikke vil udvide irresistibly efter deres homing til tumorvæv og til sidst væk for immunceller. Derfor kan de gentagne gange anvendes til patienter for at forbedre terapeutisk effekt.

I modsætning til de hæmmende virkninger af CAF i GOF

Notch1 mus på både melanom vækst og invasion, CAF i LOF

Notch1 mus fremme lokalt invasion, men ikke væksten hud melanom. Mekanismen for sådanne forskellige virkninger af CAF i GOF

Notch1 mus vs. LOF

Notch1 mus er fortsat uklart. Muligvis er de vækst- og invasion egenskaber af melanom reguleret af forskellige opløselige faktorer og microenvironmental tidskoder skabt af CAF. Sletning af

Notch1

i CAF kan medføre ændring af et sæt opløselige faktorer og microenvironmental stikord, som fortrinsvis eller tilstrækkeligt påvirker melanom invasion, men ikke væksten ejendom. På den anden side, opløselige faktorer og microenvironmental tidskoder skabt af CAF, der bestemmer melanom vækst ejendom, måske ikke ligefrem vendes mellem GOF

Notch1 og LOF

Notch1 mus. Den Notch1 pathway er hyper-aktiveres gennem ekspression af N1

IC mutant i CAF af GOF

Notch1 mus, som er forskellig fra kanonisk, ligand-induceret Notch1 aktivering hvor deletion af Notch1 kan omvendt spejl. Dette kunne forklare, hvorfor CAF i GOF

Notch1 mus retarderet melanom vækst, mens CAF i LOF

Notch1 mus ikke fremmer melanom vækst. Alternativt kan andre Notch isoformer kompensere for Notch1 tab i CAF af LOF

Notch1 mus. Fremtidige studier er berettiget til at undersøge komplette profiler af opløselige faktorer og microenvironmental stikord bestemt af forskellige CAF (CAF fra GOF

Notch1 mus vs. CAF fra GOF

Ctrl mus og CAF fra LOF

Notch1 mus vs. CAF fra LOF

Ctrl mus).

En anden interessant, men uforklarlig fund er de forskellige spontane invasion satser af B16-F10 celler podet på GOF

Ctrl (83,3%) vs. LOF

Ctrl ( 30%) mus, muligvis på grund af de forskellige genetiske baggrunde af to linjer af mus. MSC-afledte fibroblaster fra disse to linjer af kontrol mus også udvise forskellige tumor-regulerende fænotyper

in vitro

. Fibroblaster fra GOF

Ctrl mus inducerede melanom celler til at danne sfæroider mens de fra LOF

Ctrl mus ikke gjorde (upubliceret observation).

Sammenfattende vi afdække Notch1 vej som en molekylær faktor, at kontrollen den regulerende rolle af CAF i melanom vækst og invasion. Vores undersøgelse fremhæver Notch1 vej som et potentielt terapeutisk mål at blive manipuleret til at omprogrammere og konvertere CAF til at fungere som tumorsuppressorer. Disse resultater garanterer fremtidig undersøgelse for at belyse molekylære mekanismer for Notch1-bestemt tumor-regulerende rolle i CAF.

Støtte Information

S1 Fig.

A, Repræsentative udseende billeder af GOFNotch1 og GOFCtrl. Hud væv histologi ser normal som undersøgt af H & E i uge 6. B, Forhøjet udtryk for Hey1 i huden fibroblaster af GOFNotch1 mus sammenlignet med GOFCtrl mus. Pilehoveder peger nuklear-lokaliseret Hey1 i fibroblaster. Antistof genkender Hey-1 blev købt fra GeneTex (GTX42614)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0142815.s001

(PDF)

S2 Fig.

A, Repræsentative udseende billeder af LOFNotch1 og LOFCtrl. Hudvæv histologi ser normal som undersøgt ved H & E i uge 6. B, Hes1 ekspression kan ikke påvises i fibroblaster placeret i kapsel af melanom i LOFNotch1 mus, men lidt påviselig ved kapsel melanom LOFCtrl mus. Pilehoveder peger nuklear-lokaliseret Hes1 i fibroblaster. Antistof genkender Hes1 blev købt fra Abcam (ab71559)

doi:. 10,1371 /journal.pone.0142815.s002

(PDF)

Tak

Vi takker Dr. Omaida C . Velazquez (University of Miami) til nyttige samarbejder, høring og diskussioner.