PLoS ONE: Målrettet Cancer Therapy med en Novel Anti-CD37 Beta-Particle Emitting radioimmunkonjugatets for behandling af ikke-Hodgkins lymfom

Abstrakt

177Lu-DOTA-HH1 (

177Lu-HH1) er et nyt anti-CD37 radioimmunkonjugat udviklet til behandling af non-Hodgkins lymfom. Mus med subkutane Ramos xenotransplantater blev behandlet med forskellige aktiviteter af

177Lu-HH1,

177Lu-DOTA-rituximab (

177Lu-rituximab) og ikke-specifik

177Lu-DOTA-IgG

1 (

177Lu-IgG

1) og terapeutisk virkning og toksicitet af behandlingen blev overvåget. Betydelig tumorvækstforsinkelse og forøget overlevelse af mus blev observeret i mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-HH1 sammenlignet med mus behandlet med lignende aktiviteter

177Lu-rituximab eller uspecifikt

177Lu-lgG1 , 0,9% NaCl eller umærket HH1. Alle mus injiceret med 530 MBq /kg af

177Lu-HH1 tolereret behandlingen godt. I modsætning hertil 6 ud af 10 mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-rituximab erfarne alvorlig stråling toksicitet. Bevarelsen af ​​

177Lu-rituximab i organer i mononukleære fagocytsystem var længere end for

177Lu-HH1, hvilket forklarer den højere toksicitet observeret i mus behandlet med

177Lu-rituximab.

In vitro

internalisering undersøgelser viste, at

177Lu-HH1 internaliserer hurtigere og i højere grad end

177Lu-rituximab, som kunne være årsagen til det bedre terapeutiske effekt af

177Lu-HH1.

Henvisning: Repetto-Llamazares AHV, Larsen RH, Pätzke S, Fleten KG, Didierlaurent D, Pichard A, et al. (2015) Målrettet Cancer Therapy med en Novel Anti-CD37 Beta-Particle Emitting radioimmunkonjugatets for behandling af ikke-Hodgkins lymfom. PLoS ONE 10 (6): e0128816. doi: 10,1371 /journal.pone.0128816

Academic Redaktør: Ken Mills, Dronningens University Belfast, Storbritannien

Modtaget: 9. februar 2015; Accepteret: April 30, 2015; Udgivet: 11 juni 2015

Copyright: © 2015 Repetto-Llamazares et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev delvist finansieret af den norske Forskningsråd (https://www.forskningsradet.no) tilskud numrene 213633 og 219.454 og af Nordic Nanovector ASA ( https://www.nordicnanovector.com). Medforfattere Ada H. V. Repetto-Llamazares og Jostein Dahle er ansat af Nordic Nanovector ASA. Nordic Nanovector ASA ydet støtte i form af lønninger til forfattere AHVR-L og JD, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Medforfatter Roy H. Larsen er tilknyttet Sciencons AS. Sciencons AS er aktionær i Nordic Nanovector ASA. Sciencons AS ikke yde støtte i form af løn for forfatteren RHL, og havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Denne undersøgelse blev finansieret delvist af Nordic Nanovector ASA (https://www.nordicnanovector.com/). Forfatterne Jostein Dahle og Ada H. V. Repetto-Llamazares er ansat af Nordic Nanovector ASA, og Roy H. Larsen er medlem af bestyrelsen i Nordic Nanovector ASA og Sciencons AS og tre af dem er aktionærer i Nordic Nanovector ASA. 177Lu-HH1 er det vigtigste produkt fra Nordic Nanovector ASA. Der er ingen patenter, yderligere produkter i udvikling eller yderligere markedsførte produkter at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer

Introduktion

På trods af løftet om behandling med den nøgne monoklonale antistof (mAb) rituximab, et betydeligt antal af patienterne behandlet med konventionelle doser af rituximab alene eller i kombination med kemoterapi ikke opnå fuldstændig respons og kan i sidste ende tilbagefald [1]. Alternative behandlinger har været anti-CD20 mAbs konjugeret til

131I (tositumomab) eller

90Y (ibritumomab-tiuxetan). Behandling med konventionelle aktiviteter radioaktivt mærkede mAbs har produceret højere samlet respons og komplet remission i sammenligning med nøgne mAbs [2-5]. I betragtning af at radioimmunterapi (RIT) bruges oftest efter patienter er blevet behandlet med flere runder af rituximab og at de to godkendte radioimmunoconjugates (RICS) til klinisk brug,

90Y-ibritumomab-tiuxetan (Zevalin) og

131I-tositumomab (Bexxar), målrette den samme CD20 antigenet som rituximab, er det ønskeligt at designe en ny RIC, der vil målrette mod et andet antigen end CD20. Den CD37-antigenet rigeligt udtrykt i B-celler, men er fraværende på plasmaceller og normale stamceller [6-8]. Derfor CD37 synes at være en passende terapeutisk mål i patienter med recidiverende B-celle-afledte maligniteter, såsom B-celle CLL, hårcelleleukæmi (HCL) og B-celle NHL.

RIT med CD37 som mål er tidligere blevet undersøgt ved hjælp af en

131I-mærket murint monoklonalt antistof (MB-1), både i en musemodel og hos patienter [9-14]. En højere grad af internalisering og nedbrydning af

131I-mærket RIC blev fundet for CD37 end for CD20 [14]. Trods lovende klinisk respons observeret i disse kliniske undersøgelser til anti-CD37-antistof, videreudvikling af RIT fokuseret på CD20 som målantigenet og ikke er foretaget efterfølgende indsats for at udvikle RIT med anti-CD37-baserede RIC. Et begrænset antal andre CD37-rettet antistof baserede immunterapier har imidlertid blevet vurderet hos patienter. Den lille modulære immunopharmaceutical protein Otlertuzumab har avancerede til klinisk test [15] og for nylig rapporteret om fase II data i kombination med bendamustin [16]. Desuden har Fc-manipulerede antistof CD37.1 (BI836826) [17] for nylig påbegyndt fase I [18]. Desuden har to antistof-lægemiddel-konjugater (ADC’er) blevet udviklet, som kovalent at binde cytotoksiske midler til CD37-targeting antistoffer, der kan forbedre deres antitumor potens: IMGN529 [19] og AGS-67E [20]. ADC’ere er designet til at give specifik afgivelse af cytotoksiske forbindelser til celler, der udtrykker målantigenet, gennem ADC binding, internalisering og intracellulær nyttelast frigivelse. Kliniske data har vist potentialet i ADCs til kræftbehandling af CD30 og HER2-positiv tumorer [21,22]. Alle disse CD37 målretning lægemidler havde vist lovende resultater, hvilket yderligere validerer CD37 som et mål for behandling af NHL og CLL. En fordel med RIT sammenlignet med nøgne mAb’er og ADCs er den række af den udsendte stråling, som giver en krydsild effekt, således at tumorceller med mindre antigener eller ikke-tilgængelige tumorceller også blive ramt af den cytotoksiske stråling. Det er stadig uvist, om virkningsmekanismen for RIT er bedre end ADC’er.

Styrken af ​​RIT mod internalisere antigen CD37 kunne have været undervurderet af brugen af ​​radionuklid

131I, som tendens til at blive fraspaltet fra antistoffet og udskilles fra cellerne ved internalisering og katabolisme når den anvendes som “ikke-residualiserende” tyrosin-inkorporeret radiomærke, som det blev gjort i de tidlige studier med

131I-MB-1 [23]. “Residualiserende” radiomærker, på den anden side, er fanget i cellerne efter metabolisme af RIC. I et forsøg på at re-evaluere og forbedre RIT mod CD37 har vi udviklet en ny RIC (Betalutin) baseret på “residualiserende” radioaktiv mærkning

177Lu knyttet til den anti-CD37-antistof HH1 [24]. Behandling med 100 MBq /kg

177Lu-HH1 resulterede i en tredobbelt forøgelse i overlevelsen af ​​SCID mus, som blev injiceret intravenøst ​​med Daudi lymfomceller sammenlignet med ubehandlede kontrolmus [7]. SCID-mus er ikke i stand til at reparere DNA dobbelt-strengbrud [25], at begrænse mængden af ​​radioaktivitet, der kan indgives, mens nøgne mus kan tåle højere doser af stråling. En subkutan tumor xenograft i nøgne mus er en mere relevant model for voluminøse type sygdom, der ofte findes i NHL patienter end den intravenøse model i SCID-mus. Derfor er den terapeutiske og toksicitet effekt af

177Lu-HH1 blev evalueret i nøgne mus med subkutan Ramos xenografter i nærværende dokument.

Materialer og Metoder

Tumor celler

Ramos lymfomceller (LGC Standards, Borås, Sverige), der udtrykker CD20 og CD37-receptorer blev dyrket i RPMI 1640-medium suppleret med Glutamax (Gibco, Paisley, UK), 10% varmeinaktiveret FCS (Gibco) og 1% penicillin-streptomycin (Gibco) i en fugtig atmosfære med 95% luft /5% CO

2.

Radioaktiv mærkning af antistoffer

antistofferne HH1 (anti-CD37, nordisk Nanovector ASA, Oslo, Norge ), Rituximab (anti-CD20, Roche, Pharma Schweiz, Basel, Schweiz) og den murine non-specifik isotype kontrol antistof (IgG

1) (MAB002, R Packard Instrument Co, Meriden, CT, USA) og celler blev vasket to gange ved anvendelse af DPBS (Gibco, Paisley, UK) suppleret med 0,5% wt bovint serumalbumin (BDH Prolabo, VWR, Lutterworth, Leicestershire, UK), hvorefter aktiviteten bundet til cellerne blev talt i gammatæller. Ligevægtsdissociationskonstanten (K

d) og den maksimale gennemsnitlige densitet af antigener (B

max) blev beregnet ud fra montering af de eksperimentelle data. Tre eksperimenter blev udført ved hjælp af

177Lu-HH1 og 2 eksperimenter ved hjælp af

125I-rituximab. Resultaterne fra alle forsøg for hver RIC blev midlet til at opnå en gennemsnitlig værdi på K

d og B

max for hver RIC.

internalisering eksperimenter

HH1-DOTA blev mærket med Alexa Fluor 488 og rituximab med Alexa Fluor 647 (Molecular Probes, Invitrogen, Paisley, UK). En million Ramos-celler per ml i vækstmedium blev inkuberet med 10 ug /ml HH1 eller 20 ug /ml rituximab for enten 19 timer ved 37 ° C eller 1 time ved omkring 4 ° C. Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) blev tilsat til cellerne til en koncentration på 2 pg /ml 1 time før billeddannelse. Celler blev afbildet med en AxioImager Z1 ApoTome mikroskop-system (Carl Zeiss, Jena, DE) ved hjælp af en PlanApo 63 × /N.A.1.4 DIC-objektiv, passende optiske filtre, en AxioCam MRM kamera og Axiovision 4.8.2 (Carl Zeiss). Z-snit blev opnået for hver 1 um over hele cellevolumen. Billeder præsenteres som overlejringer af fluorescens billeder af central z-sektion og DIC billede. 20 til 40 celler blev scannet for hver behandling.

Dyr og implanteret

Institutionelt avlet kvindelige athymiske nøgne FOX1

nu mus blev anvendt. Alderen og vægten af ​​musene er vist i tabel 1. Dyrene blev holdt under patogenfrie betingelser med en 12 timers belysning cyklus ved en rumtemperatur på 23 ° C og luft relativ fugtighed på 55% i plast bure. Mad og vand blev leveret

ad libitum

og strøelse blev ændret regelmæssigt. Mus blev bedøvet med subkutane injektioner af 70-100 pi Tiletamin-zolazepam mix (Virbac, Carros Cedex, Frankrig) fortyndet 1: 5 med sterilt vand før implantering af stykker af Ramos lymfom xenograftvæv fra carrier-mus, (diameter 1,5-2 mm) i flankerne. Alle procedurer og forsøg med dyr i denne undersøgelse blev godkendt af Det norske Animal Research Authority (NARA). Institut for Sammenlignende Medicin institutionelle dyrlæge har fastsat reglerne for fodring, overvågning, håndtering og ofring af dyr i overensstemmelse med regler fastsat af ministeriet for landbrug i Norge og “Den europæiske konvention om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål “. Den institutionelle dyrlæge har uddelegeret myndighed fra det norske Animal Research Authority (NARA). De laboratoriedyr faciliteter er underlagt en rutinemæssig sundhed-overvågningsprogram og testet for smitsomme organismer i henhold til en ændring af Sammenslutningen af ​​Europæiske Laboratorium Animal Science Associations (FELASA) anbefalinger.

Terapi og toksicitet eksperimenter

Dyr med voksende tumorer med diametre mellem 4 og 12 mm blev randomiseret i bure efter behandlingsgruppe og blev administreret intravenøst ​​med 100 pi injektionsopløsninger korrigeret for individuel mus vægt. To indledende eksperimenter blev udført med injektion af aktiviteter mellem 50 og 1000 MBq /kg

177Lu-HH1 (S1 File). Disse eksperimenter blev anvendt til at bestemme de eksperimentelle parametre er valgt til de to eksperimenter præsenteret i dette papir (tabel 1), som omfattede injiceret aktiviteter af 410 og 530 MBq /kg

177Lu-HH1, 300 og 530 MBq /kg

177Lu -rituximab, 530 MBq /kg

177Lu-IgG

1 og 15 ug /kg HH1 og 0,9% NaCl som kontrolgrupper.

musene blev vejet og klinisk observeret to til tre gange om ugen i op til 109 dage. Desuden blev overvåget musene dagligt for tegn på sygdom eller ubehag. Aktivitetsniveau, hudlidelse (eksem, blødninger, etc.) og generelle sundhedstilstand af musene blev observeret dagligt. Mus blev aflivet ved cervikal dislokation under sevofluran gas anæstesi, hvis nogen af ​​følgende humane endepunkter blev nået: tumor diameter oversteg 20 mm, kropsvægt faldt med 20% fra højeste kropsvægt eller dyr ellers viste symptomer på alvorlig sygdom og ubehag

Tumorvækst blev overvåget op til den første tumor volumen måling højere end 2000 mm

3 i hver mus (større tumorer udvikler normalt nekrotiske sår). Komplet remission blev defineret som ingen observerbar tumor. Mus nå dette stadium blev betragtet som langsigtede responders.

Hematology.

Der blev taget blodprøver før injektion, ved døden og hver 4 til 7 uger efter behandlingen administration. prøveudtagning Blodet blev udført som tidligere [26] beskrevne. Stråling toksicitet blev defineret som hvide blodlegemer under 1 × 10

9 1 /L, blodpladetal under 400 × 10

9 1 /l, pludseligt vægttab-omkring 5% i bortfald på 2 til 3 dag – ledsaget af et lavt aktivitetsniveau og en generel tilstand af sygdom. Sammenligninger mellem gennemsnitlige værdier af forskellige behandlingsgrupper blev udført ved hjælp af t-test med et signifikansniveau på 0,05.

Et mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-HH1 blev ofret 11 dage efter behandling injektion for at opnå hæmatologi og histologi data på dette særlige tidspunkt. Desuden at få flere hæmatologiske data 3 mus har tumordiametre mellem 12 og 15 mm (800 og 1300 mm3) var også inkluderet i eksperiment 2.

histopatologi.

Mus blev obduceret og hjerte, lunger, blev lever, mave, milt, små og store tarme, nyrer, lårbenet, muskel, kranium, hjerne, tumor, hud, æggestokke og lymfeknuder fast og sendt til god acceleration, Milano, Italien til støbning, sektionering, farvning og patologisk undersøgelse .

biofordeling eksperimenter

Konjugater blev administreret ved haleveneinjektion af 100 pi opløsning (0,2 og 0,9 MBq) til hvert dyr. Mellem 4 og 7 mus blev aflivet ved halsen dislokation under sevofluran gas anæstesi på hvert tidspunkt efter hjertepunktur til blodprøveudtagning. Tumor størrelser på injektion af konjugater varierede mellem 120 og 1800 mm

3. Undersøgelser blev udført som beskrevet i reference [28]. Sammenligninger mellem gennemsnitlige værdier blev gjort ved hjælp t-test med et signifikansniveau på 0,05.

En pilot

In vivo

SPECT /CT blev udført på to mus med Ramos subkutane xenotransplantater med diametre omkring 12 mm i deres højre flanke i en nanoSPECT /CT (Bioscan Inc., Washington DC, USA). SPECT /CT opkøb blev udført ved 3, 24 og 48 timer efter behandling injektion i mus 1 og efter 24 timer i mus 2. Aktiviteter målt ved SPECT /CT blev sammenlignet med ex-vivo målinger udfærdiget i 48 timer efter behandlingen administration. Mus blev injiceret i.v. med 150 pi af 10 MBq

177Lu-HH1 og blev bedøvet med 2% Isofluran for erhvervelse billede.

Dosimetri

dosishastigheden og absorberede doser fra

177Lu-HH1 og

177Lu-rituximab i mus blev beregnet som beskrevet i reference [28] for en indsprøjtning af en MBq /mus (40 MBq /kg) og under forudsætning af betyde energi af beta-partikler, til Auger- og konvertering elektroner være 0.1473 MeV [29]. Den selv-stråling fraktionen for tumor blev anslået til at være 0,944 (200 mg tumor [30]).

Statistisk analyse

overlevelse af de forskellige behandlingsgrupper blev sammenlignet ved Kaplan-Meyer overlevelsesanalyse hjælp SigmaPlot til Windows-version 12.0 (Systat Software Inc., Californien, USA) ved hjælp af tid til at nå en tumor volumen højere end 4 gange den oprindelige tumor volumen eller eutanasi skyldes stråling toksicitet symptomer som endepunkterne. Hæmatologi og biodistributionsdata blev sammenlignet ved hjælp af en-vejs ANOVA. Multiple sammenligninger blev udført under anvendelse af Holm Sidak metoden. Et signifikansniveau på p 0.05 blev anvendt i alle test.

Resultater

Terapi og toksicitet eksperimenter

Tumor vækst og overlevelse.

Der var en markant tumorvækst forsinkelse i mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-HH1 sammenlignet med mus behandlet med enten

177Lu-IgG

1 eller 0,9% NaCl (fig 1A). Tumorvækst blev også forsinket i nogle af mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-rituximab, men denne behandling vist sig at være giftig: 60% af musene måtte ofres grund symptomer på svær stråling toksicitet mellem 11 og 18 dage efter injektion af behandling (tabel 2). Ingen af ​​musene blev aflivet på grund af stråling toksicitet symptomer i nogen af ​​de andre behandlingsgrupper. Tumorvækst i kontrolmusene var behandlet med 0,9% NaCl eller 15 ug /kg nøgen HH1 var ikke-homogen, med 30% og 10% komplet remission, hhv. På den anden side, tumorer i mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-IgG voksede

1 homogent og viste ingen naturlige regressioner. Antallet af langsigtede respondere var højest i mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-HH1 (Fig 1B). Endvidere behandling med 530 MBq /kg

177Lu-HH1 signifikant forlænget overlevelse af mus sammenlignet med

177Lu-IgG

1, 0,9% NaCl og HH1 (p 0,05) (Fig 1C, tabel 2 ). Overlevelse af mus behandlet med

177Lu-IgG

1 var signifikant kortere end for dem behandlet med 0,9% NaCl (p 0,05), som var på grund af væksten homogenitet og manglen på tumorregression observeret i mus behandlet med

177Lu-IgG

1, som kan være relateret til stråling induceret immunosuppression. Det er tidligere blevet vist, at væksten af ​​xenografter hos mus kan forøges ved bestråling af hele kroppen (WBI) [31-34] eller andre immunmodulerende midler [32,35-38]. Naturlige regressionsanalyse af xenografter i nøgne mus i kontrolgrupper er observeret tidligere [33,35], især i nøgne mus med subkutane Ramos xenografter [39,40]. RIT kan betragtes som en form for WBI behandling, som derfor kan resultere i en bedre udnyttelse og vækst af xenotransplantater i behandlede mus end i kontrolmus. Således kan den terapeutiske effekt af RIT undervurderes i musemodeller, hvor kroppens samlede bestråling forbedrer tumor vækst, især når man sammenligner den terapeutiske effekt af RIC med midler, der har lav systemisk toksicitet såsom NaCl eller umærkede mAbs. Det kan være mere praktisk derfor at sammenligne effekten af ​​RIC til tilsvarende doseringer af ikke-specifik, kontrol RIC stedet.

(A) Individuel tumorvækst (n = Antal tumorer i remission ved udgangen af undersøgelse /samlet antal indledende tumorer); (B) Procentdel af langsigtede respondenter (mus aflivet på grund af stråling toksicitet symptomer eller for hæmatologiske målinger før en af ​​deres tumorer nåede et volumen på 2000 mm

3 blev ikke behandlet i analysen); (C) Kaplan-Meier overlevelse kurve. Slutpunkt: tumorvolumen ≥ 4 gange oprindelige tumorvolumen. Krydserne betegner censureret dyr, der blev aflivet før de når 4 gange den oprindelige tumorvolumen. N = 9-10. Multiple sammenligninger blev udført under anvendelse af Holm Sidak metode. Signifikansniveau: p 0.05.

I betragtning af den høje toksicitet observeret under de første to uger i nogle af de mus behandlet med

177Lu-rituximab, endnu et eksperiment blev udført ved hjælp af lavere aktiviteter. Behandlinger med 410 MBq /kg

177Lu-HH1 og 300 MBq /kg

177Lu-rituximab (ca. 50% af LD50 for hver RIC) resulterede i en let tumorvækstforsinkelse (Fig 2A). Mus behandlet med 410 MBq /kg

177Lu-HH1 havde det højeste antal langsigtede respondere mens der ikke var nogen langsigtede respondenter i mus behandlet med 300 MBq /kg

177Lu-rituximab på grund af ingen hæmning af tumorvækst ( fig 2B). Median overlevelse var længere i mus behandlet med 410 MBq /kg

177Lu-HH1 (mere end 15 gange i forhold til kontrolgruppen), men forskellen var ikke statistisk signifikant sammenlignet med de andre behandlingsgrupper (p 0,05) (Fig 2C, tabel 2). Median overlevelse af mus behandlet med 300 MBq /kg

177Lu-rituximab var omkring 3 gange længere end for musene i kontrolgruppen, mens den gennemsnitlige overlevelse af mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-rituximab var ens til musene i kontrolgruppen. Selv når mængden af ​​langsigtede respondenter var højere for den højere injicerede aktivitet

177Lu-rituximab toksiciteten af ​​behandlingen havde en stærk indflydelse på den gennemsnitlige overlevelse. Det optimale injicerede aktivitet for

177Lu-rituximab kunne ligge på mellem 300 og 530 MBq /kg, hvor en optimal mængde af langsigtede respondenter kunne findes uden livstruende toksicitet.

(A) Individuel tumor vækst (n = antal tumorer i remission i slutningen af ​​studiet /samlet antal indledende tumorer) (B) Procentdel af langsigtede respondenter; (C) Kaplan-Meier overlevelse kurve. Slutpunkt: tumorvolumen ≥ 4 gange oprindelige tumorvolumen. Krydserne betegner censureret dyr, der blev aflivet før de når 4 gange den oprindelige tumorvolumen. N = 5-6. Multiple sammenligninger blev udført under anvendelse af Holm Sidak metode. Signifikansniveau: p 0.05.

Kropsvægt.

Den gennemsnitlige kropsvægt af mus behandlet med RIC faldt brat efter injektion. Den gennemsnitlige kropsvægt tab varede i omkring 7 dage for behandling med 530 MBq /kg og omkring 4 dage for behandling med 410 og 300 MBq /kg aktiviteter (Fig 3). Bagefter den gennemsnitlige kropsvægt af de behandlede mus begyndte at stige, tendens mod gennemsnitlig legemsvægt på kontrolgrupperne.

gennemsnitlig legemsvægt på nøgne mus med Ramos-xenotransplantater behandlet med 530 MBq /kg

177Lu -HH1, 530 MBq /kg

177Lu-rituximab, 530 MBq /kg

177Lu-IgG

1 uspecifik isotypekontrol, 15 ug /kg HH1, NaCl 0,9%, 410 MBq /kg

177Lu-HH1 og 300 MBq /kg

177Lu-rituximab.

Hematology.

De gennemsnitlige antal hvide blodlegemer (WBC) og røde blodlegemer (RBC) for mus behandlet med 530 MBq /kg af de forskellige RIC lå under værdierne for NaCl kontrolgruppe til 4 og 8 uger, men normaliseret ved afslutningen af ​​undersøgelsen (figur 4A). Det gennemsnitlige antal af blodplader (PLT) ikke varierer betydeligt mellem behandlings- og kontrolgrupper. Men mellem 11 og 25 dage efter behandling med RIC, WBC, RBC og PLT numre var betydeligt lavere i mus behandlet med 530 MBq /kg, hvilket indikerer en nadir omkring 2 uger efter behandlingen administration. Der var ingen kontroldyr ofret i denne tidsinterval, men kontrolværdier kan antages at være tæt på dem, der måles ved baseline og cirka 4 uger efter behandlingen injektion i NaCl-gruppen.

Antal hvide blodlegemer (WBC ), røde blodlegemer (RBC) og blodplader (PLT) i mus med Ramos-xenografter behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-HH1, 530 MBq /kg

177Lu-rituximab, 530 MBq /kg

177Lu IgG

1 uspecifik isotypekontrol, 15 ug /kg HH1, 0,9% NaCl (A) og 410 MBq /kg

177Lu-HH1 og 300 MBq /kg

177Lu-rituximab (B). Arealet af hver cirkel repræsenterer antallet af mus anvendes ved beregning af middelværdier. Cirkler med mørk kant og forbundet med linjer repræsenterer prøver udtaget på faste tidspunkter i løbet af undersøgelsen, hvor alle levende mus blev udtaget. Cirkler uden mørk rand og ikke forbundet med linjer repræsenterer blodprøver taget før eutanasi, hvor normalt en eller to mus blev ofret. N = 1-10. Fejl barer = standardafvigelse. *: Signifikant forskellig fra den tilsvarende 0,9% NaCl (kontrol) gruppe værdi (En-vejs ANOVA med Holm Sidak metode til multiple sammenligninger, p 0,05)

Det gennemsnitlige antal WBC i mus. behandlet med 410 MBq /kg

177Lu-HH1 og 300 MBq /kg

177Lu-rituximab var signifikant lavere end for kontrolgruppen 4 uger efter behandlingen administration, men værdierne normaliseret mod slutningen af ​​forsøget (fig 4B ). Det gennemsnitlige antal RBC og PLT var ens for alle behandlingsgrupper (p 0,05). Der var ingen dødsfald i forbindelse med alvorlige symptomer på stråling toksicitet i dette forsøg. Men WBC-tal i mus behandlet med

177Lu-rituximab som blev aflivet efter 13 og 17 dage på grund af tumor diameter større end 20 mm havde WBC, RBC og PLT værdier betydeligt lavere end de værdier, der måles for NaCl ved lignende tidspunkter.

histopatologi.

de vigtigste organer, der berøres af behandling med RIC med aktiviteter lig med eller højere end 530 MBq /kg var knoglemarven, lymfeknuderne, milten og æggestokke. Dyr behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-rituximab viste alvorlige ændringer i hemato-lymfopoietisk væv, herunder nedsat extra-medullær hæmatopoiese, lymfoid udtømning i milten og atrofi af knoglemarven (Fig 5A), hvilket indikerer stråling skader (tabel 3). Disse observationer var mere alvorlig jo før musene måtte aflives efter behandling injektion. Lignende observationer blev gjort for behandlinger med 800 og 1000 MBq /kg af

177Lu-HH1 [26]. De fleste af de mus, der viser alvorlige stråling toksicitet symptomer også præsenteret hud blødninger (Fig 5B), der startede som en hududslæt et par dage før aflivning. De histopatologiske observationer var i god overensstemmelse med hæmatologi målinger. For aktiviteter 530 MBq /kg og højere æggestokke blev ramt [26]. Mus aflives mellem 11 til 25 dage efter behandlingen administration gjorde dog ikke vise abnormaliteter i æggestokkene, hvilket indikerer, at disse læsioner tage mere end 3 uger til at udvikle

(A) Repræsentative billeder af:. En normal knoglemarv fra en mus i NaCl-gruppen (aflivet 109 dage efter behandlingen), markeret reduceret cellularitet i en mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-HH1 aflivet 11 dage efter behandlingen, moderat nedsat cellularitet i en mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-IgG

1 aflivet 25 dage efter behandling og alvorlig nedsat cellularitet i en mus behandlet med 530 MBq /kg

177Lu-rituximab aflivet 15 dage efter behandlingen. (B) Eksempel på en mus med svær hud blødninger 11 dage efter administration med 530 MBq /kg

177Lu-rituximab. Musen blev ofret dagen billederne blev taget.

Biodistribution og dosimetri

Blod clearance var lidt hurtigere for

177Lu-rituximab end for

177Lu -HH1 (fig 6A), som gav en absorberet dosis til blod i mus behandlet med

177Lu-rituximab omkring halvdelen af ​​tiden for

177Lu-HH1 (tabel 4, figur 6B). Bevarelsen af ​​

177Lu-rituximab i lever, milt og lårben var signifikant længere end for

177Lu-HH1 eller

177Lu-IgG

1 (fig 6A og 6B) og dermed absorberede doser til disse organer var 2-3 gange højere for behandling med

177Lu-rituximab end for

177Lu-HH1. Den højere optag af

177Lu-rituximab i femur (tabel 4) sandsynligvis resulteret i en højere absorberet dosis til rød knoglemarv, hvilket er i overensstemmelse med den højere toksicitet og reducerede knoglemarvscellulariteten observeret i mus behandlet med

177Lu-rituximab . Optagelsen i tumor var hurtigere for

177Lu-rituximab, men tilbageholdelsen var kortere (ikke statistisk signifikant, p 0,05) end for

177Lu-HH1 (Fig 6A). De absorberede doser til tumor var tæt på 2 Gy for både

177Lu-HH1 og

177Lu-rituximab (tabel 4). Optagelsen og fastholdelse af

177Lu-HH1 og

177Lu-IgG

1 kontrol var ens for alle organer /væv undtagen nyrer og tumor (Fig 6A).

(A) Optagelse af

177Lu-HH1 (N = 6-8),

177Lu-rituximab (N = 4-5),

177Lu-lgG1 kontrol (N = 5) i udvalgte organer /væv fra nøgne mus med Ramos-xenotransplantater i procent af injiceret aktivitet pr gram væv (% IA /g). Fejl barer = standardafvigelse. *: Signifikant forskellig fra

177Lu-HH1 (One-way ANOVA med Holm Sidak metode til multiple sammenligninger, p 0,05). (B) Dosis pr MBq af injiceret aktivitet i udvalgte organer nøgne mus med Ramos xenografter behandlet med

177Lu-HH1 (N = 6-8) og

177Lu-rituximab (N = 4-5). (C)

In vivo

SPECT /CT multiplan gjort visning af en nøgen mus med en Ramos xenograft i sin højre flanke injiceret med 10 MBq

177Lu-HH1.

SPECT /CT-billeder viste en høj og heterogen tumoroptagelse sammenlignet med andre væv 48 timer efter injektion af

177Lu-HH1 (fig 6C). Optagelse i lunger, hjerte og aorta var høj 3 timer efter injektion og faldt med stigende tid, er betydeligt reduceret efter 48 timer. Optagelse i tumor var lav 3 timer efter

177Lu-HH1 administration men steg med tiden og var højere end i andre væv efter 48 timer. Forskellen tumor optagelse målt ved SPECT og gamma tæller var under 10%, hvilket viser god overensstemmelse mellem målinger udført

in vivo

med SPECT og

ex vivo

ved gamma tælling.

internalisering eksperimenter

HH1 blev næsten fuldstændig internaliseret efter 19 timers inkubation ved 37 ° C, mens der ikke var nogen signifikant internalisering efter 1 times inkubering ved 4 ° C.